Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe No tarafından desteklenmiştir. R01 GM-130934 ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) MCB-2016022 hibe eder. B.N.C, E.J.D.V. ve K.S.C., T32 GM119999 ödülü kapsamında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden bir hibe ile kısmen desteklenmiştir.

NOT: Desteklenen lipit çift katmanlarının oluşturulması, monodisperse küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) hazırlanmasını gerektirir. Lütfen SUV oluşumu hakkında daha önce yayınlanmış bir protokololan 24'e bakın. Kısaca, tüm SUV'lar 12 dakika boyunca prob sonikasyonu ile oluşturulur toplamda% 70 genlikte, 4 dakikalık sonikasyon dönemleri ve ardından buzlu suda 2 dakikalık dinlenme süreleri. SUV çözümleri iyi açıklığa kavuşturulmalı ve boyut olarak monodispe...

<ol>
	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes.">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li><li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology.">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li><li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference.">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li><li>Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin:+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study.">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li><li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules.">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li><li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment.">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).</li><li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions.">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Lou, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amphipathic+helix+enables+septins+to+sense+micrometer-scale+membrane+curvature.">An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature.</a> Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays.">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Lobato-M&#225;rquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution.">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).</li><li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck.">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li><li>Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+dynamic+remodelling+of+the+septin+cytoskeleton+during+the+cell+cycle.">Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle.</a> Nature Communications. 5, 1-10 (2014).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+governing+septin+assembly.">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces:+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction.">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li><li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+lipid+bilayers+(SLBs)+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts.">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li><li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Hücre zarları birçok farklı şekil, eğrilik ve fizikokimyasal özellik kazanır. Hücrelerin mikrometre ölçeğinde montajlar oluşturduğu nanometre ölçekli makineleri incelemek için, membran mimetiklerinin minimal sulandırma sistemlerini tasarlamak gerekir. Bu protokol, hem membran eğriliğini hem de bileşimi hassas bir şekilde kontrol eden teknikler sunarken, kullanıcının yaygın olarak bulunan mikroskopi tekniklerini kullanarak kantitatif floresan ölçümlerini kolayca almasını sağlar.
<p clas...

Hücrelerin şekilleri ve iç bölmelerinin çoğu, onları çevreleyen lipit zarlarına bağlıdır. Membranlar, proteinlerle etkileşimler, lipit sıralama ve çeşitli şekiller üretmek için iç ve dış kuvvetlere etki ederek deforme olabilen viskoelastik yapılardır 1,2,3,4. Bu şekiller genellikle membran eğriliği açısından tanımlanır. Hücreler, hücre kaçakçılığı, sitokinezi ve migrasyon dahil olmak üzere süreçler üzerinde tanımlanmış mekansal-zamansal kontrol sağlamak için tercihen belirli membran eğriliklerine monte edilebilen veya "algılayabilen" çeşitli protein paketlerini kullanır 5,6. Membrandaki hücre makinelerinin dinamiklerini, zamanı ve mekansal çözünürlüğü hücre sağlığı ile dengelemenin zorluğu nedeniyle gözlemlemek özellikle zordur. Süper çözünürlük teknikleri bu tür yapıların ayrıntılı bir görünümünü sunabilse de, çoğu makine için montaj / demontaj zaman çizelgelerine uygun olmayan uzun kazanımlar gerektirir. Ek olarak, bu montajların doğal ortamlarındaki moleküler karmaşıklığı ve tek bir bileşenin oynayabileceği rollerin çokluğu, minimal sulandırma sistemlerini moleküllerin fonksiyonel kapasitesini incelemek için değerli bir araç haline getirmektedir.
Membran özelliklerini ve hücre dışındaki protein-membran etkileşimlerini incelemek için minimal membran mimetiği geliştirilmiştir. Membran mimetiği, lipozomlar veya dev unilamellar veziküller gibi serbest duran lipit çift katmanlarından, desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB'ler) kadar değişir7,8,9,10. SLB'ler, tipik olarak cam, mika veya silika 11,12'den oluşan, altta yatan desteğe tutturulmuş biyomimetik membranlardır. Düzlemsel yüzeyler, küreler, çubuklar ve hatta hem içbükey hem de dışbükey eğrilikler üzerindeki protein-membran etkileşimlerini aynı anda araştırmak için dalgalı veya mikro desenli substratlar dahil olmak üzere çeşitli geometriler kullanılabilir1 3,14,15,16,17,18 . Çift katmanlı oluşum, hidrofilik bir yüzeye vezikül adsorpsiyonu ile başlar, ardından sürekli bir çift katmanlı oluşturmak için füzyon ve kopma ile devam eder (Şekil 1)19. Desteklenen çift katmanlar, ışık ve elektron mikroskobuna özellikle uygundur ve hücrelerde sıklıkla elde edilebilenden daha iyi zaman ve uzamsal çözünürlük sağlar. Kavisli SLB'ler özellikle önemli membran deformasyonunun yokluğunda protein eğrilik hassasiyetini araştırmak için çekici bir araç sağlar ve serbest sistemlerde ayrılması genellikle imkansız olan eğrilik algılama ve eğrilik indüksiyonu arasında ayrım yapılmasına izin verir.
Septinler, pozitif kavisli membranlar üzerinde birleşme yetenekleri ile iyi bilinen bir filament oluşturan sitoiskelet proteinleri sınıfıdır 6,18,20. Mayadaki hücre döngüsü boyunca, septinler bir halka halinde toplanır ve sırasıyla tomurcuk oluşumu ve sitokinezi ile ilişkili kum saati ve çift halka yapılarını oluşturmak için yeniden düzenlenmelidir21. Değişen hücre döngüsü aşamaları22'de septin mimarisini gözlemlemek için platin replika elektron mikroskobu kullanılarak güzel çalışmalar yapılmış olsa da, mayada ışık mikroskobu kullanarak zaman içinde septin montajını izlemek sınırlı uzamsal çözünürlükle karşılanmıştır. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirilen lipit monokatmanlarını kullanan septinler üzerinde yapılan önceki çalışmalar, halkalar, demetler ve gazlı bezler gibi birkaç ilginç septin yapısını yeniden oluşturabildi23. Bununla birlikte, EM teknikleri, floresan mikroskobundan farklı olarak, zamansal çözünürlüklerinde de sınırlıdır. Çok ölçekli septin montajı sürecinin kinetik parametrelerini daha iyi çözmek için, membran geometrisini, numune koşullarını ve görüntüleme modalitesini dikkatlice kontrol edebilen desteklenen membran mimetiğine yöneldik.
Burada açıklanan protokoller düzlemsel veya kavisli SLB'ler, saflaştırılmış protein ve mikroskopi tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanır. Kantitatif floresan konfokal mikroskopi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), hem çeşitli membran eğriliklerine bağlı dökme proteini ölçmek hem de tek moleküllerin bağlanma kinetiğini ölçmek için kullanıldı. Ayrıca, bu protokol, farklı membran eğriliklerinde protein ultrayapısını incelemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Bu protokollerin odak noktası septin sitoiskeleti üzerinde olsa da, protokoller okuyucunun ilginç bulduğu herhangi bir proteinin eğrilik duyarlılığını araştırmak için kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, endositoz veya veziküler kaçakçılık gibi alanlarda çalışanlar, bu teknikleri çoklu protein komplekslerinin eğriliğe bağlı gruplarını araştırmak için yararlı bulabilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

Çoğu hücre, temel hücre işlemlerini gerçekleştirmek için şekillerini algılayabilir ve değiştirebilir. Birçok ökaryotta, septin sitoiskeleti, sitokinezi, polarize büyüme ve göç gibi şekil değişikliklerini koordine etmede ayrılmaz bir bileşendir. Septinler, çeşitli üst düzey yapılar oluşturmak için bir araya gelen filament oluşturan proteinlerdir ve çoğu durumda, plazma zarının farklı bölgelerinde, özellikle mikron ölçeğinde pozitif eğrilik bölgelerinde bulunur. Septin montaj sürecinin in vivo olarak izlenmesi, hücrelerdeki ışık mikroskobunun sınırlamalarının yanı sıra hem membranlar hem de sitoiskelet elemanları ile etkileşimlerin karmaşıklığı nedeniyle engellenir ve bu da canlı sistemlerde septin dinamiklerini ölçmeyi zorlaştırır. Neyse ki, son on yılda, septin montajını kontrol eden mekanizmaları yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüklerde incelemek için septin sitoiskeletinin hücresiz bir sistemde yeniden yapılandırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Septin montajının temel adımları, septin heterooligomer ilişkisi ve membran ile ayrışması, filamentlere polimerizasyon ve filamentler arasındaki etkileşimler yoluyla daha yüksek dereceli yapıların oluşumunu içerir. Burada, septin montajını farklı bağlamlarda gözlemlemek için üç yöntem sunuyoruz: düzlemsel çift katmanlar, küresel destekler ve çubuk destekleri. Bu yöntemler, montajın farklı aşamalarında septinlerin biyofiziksel parametrelerini belirlemek için kullanılabilir: membranı bağlayan tek oktamerler olarak, filamentler olarak ve filamentlerin montajları olarak. Bu parametreleri, eğrilik algılamanın çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde nasıl çalıştığını anlamak için eğrilik örneklemesi ve tercihli adsorpsiyon ölçümleriyle birlikte kullanıyoruz.

Her SLB'nin hazırlanmasını takiben, septinler veya ilgilenilen protein istenen destekle inkübe edilebilir ve TIRFM, konfokal mikroskopi veya SEM ile görüntülenebilir. Burada gösterilen sonuçlar, E. coli17'den rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan septinleri kullanır. Düzlemsel SLB'lerde TIRFM kullanılarak, filamentlerin uzunluğunu ve esnekliklerini belirlemek, difüzyon katsayılarını ölçmek ve zaman içinde montajı gözlemlemek mümkündür<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Bu protokol, membran bağlayıcı proteinler üzerinde çalışanlara, membran şeklinin protein montajlarının organizasyonunda nasıl bir rol oynadığını belirlemek için rehberlik edecektir. Bu tekniğin birincil avantajı, protein tipi, membran bileşimi ve membran geometrisi için çok yönlülüğüdür. Ayrıca, bir lipit çift katmanının ilişkili proteinlerin özelliklerini nasıl değiştirebileceğinin sorgulanmasına izin verir.Deney için iyi bir zar belirlemek için, lipit difüzyon oranlarını, ilgili proteinin hareketliliğini ve patlamamış lipozomların veya yüzeye yapışmış kaynaşmış lipozomların olup olmadığını içerebilecek bir kontrol listesi oluşturmanızı öneririz. Slaytların plazma temizliğine başlamak için, plazma temizleyiciyi beş dakika boyunca oksijenle temizleyerek havayı hatlardan ve odadan uzaklaştırın. Kuru kapak camı slaytlarını seramik bir kızağa yerleştirin.Temizleme sırasında, toz ve partikülleri gidermek için mikro kapak camı kızaklarının üzerine inert bir gaz akıtan. Beşiği plazma odasının arkasına yerleştirin, böylece kapaklar odanın uzun kenarı ile paralel olacaktır. Plazma temizleyiciyi maksimum güçte oksijenle 15 dakika çalıştırın.Oda hazırlığı için, kapağı 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünün buzlu kısmının hemen altında kesin. PCR tüpünün kenarını, tüpün içini önleyen UV ile aktive edilmiş yapıştırıcı ile boyayın. PCR tüp yapıştırıcısını nazikçe plazma temizlenmiş bir kapak kapağının ortasına yerleştirin, ardından yapıştırıcıyı iyileştirmek için odayı beş ila yedi dakika boyunca uzun dalga boylu UV ışığı altına yerleştirin.Bir çift katmanlı oluşturmak için, reaktifleri kuyuya ekleyin. SUV'ları bozmak için odaları bir yandan diğer yana yavaşça sallayın ve ardından 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fazla lipitleri yıkamak için pipetle pipetleyerek çift katmanı altı kez 150 mikrolitre SLBB ile durulayın, ardından septinlerle inkübe etmeden önce çift katmanı altı kez 150 mikrolitre reaksiyon tamponu ile yıkayın.Son yıkama adımında, reaksiyon tamponunu çıkarın ve kuyuda 75 mikrolitre bırakın. SSB'de seyreltilmiş 25 mikrolitre septin ekleyin ve TIRF mikroskobu ile görüntüleyin. İlk olarak, silika mikrosferleri içeren şişeyi 15 saniye boyunca vorteks, daha sonra bir dakika boyunca sonikat banyosu ve herhangi bir kümeyi kırmak için 15 saniye boyunca tekrar vorteks.Boncukları SLBB ve 10 mikrolitre beş milimolar SUV ile düşük yapışmalı bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Sedimantasyonu önlemek için boncuk lipit karışımını oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bu arada, pegile edilmiş bir kapak kayışını çözün ve kesilmiş 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünü yapıştırın.Kuluçkadan sonra, boncukları belirlenen RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. İlk spinden sonra, 50 mikrolitre süpernatan çıkarın, ardından 200 mikrolitre PRB ekleyin ve kuvvetli pipetleme ile karıştırın. Sonraki turlar için, 200 mikrolitre PRB'yi çıkarın ve ikinci ve üçüncü spinden sonra 200 mikrolitre daha ekleyin ve dördüncü spinden sonra 220 mikrolitre PRB ekleyin.Birden fazla boncuk boyutunda bir yarışma testi yapıyorsanız, her boncuk boyutunda eşit hacimlerde karıştırarak ve bu boncuk karışımının 29 mikrolitresini 721 mikrolitre reaksiyon tamponu ile seyrelterek reaksiyonu hazırlayın, ardından 75 mikrolitre seyreltilmiş boncuk ve SSB'de seyreltilmiş proteinin 25 mikrolitresini kuyucuklara ekleyin ve karıştırın. Septinleri sabit bir durumda ölçüyorsanız, karışımı bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından TIRF'ye yakın veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Yeşil renkle gösterilen septinlerle inkübe edilen düzlemsel SLB'lerin TIRF mikrografları homojen protein dağılımı göstermiştir.Kötü temizlenmiş cam kapaklarla yapılan SLB'ler, düşük septin bölgelerinde çift katmanda delikler veya boşluklar gösterdi. Patlamamış ve tübülasyonlu lipozomlar, eski lipozomlar kullanılırsa veya yıkamalar sıkı değilse yüzeyde birikebilir. Rodamin PE kullanılarak görselleştirilen lipit kaplı mikrosferlerin mikrografilerinde düzgün çift katmanlı birikim gösterilmiştir.Küresel destekler membran tarafından eşit şekilde kaplandı ve birkaç boncuk kümesi vardı. Fazla lipitlerin yetersiz yıkanması, lipit kümeleri tarafından gözlemlendiği gibi düzensiz membran kaplamasına neden oldu ve yanlış kullanım, çift katmanda boşluklara neden oldu. Boncukların yetersiz karıştırılması, toplam protein emilimini ölçmek için ideal olmayan kümelenmeye neden oldu.Burada sunulan desteklenen lipit çift katmanları kullanılarak, farklı protein-protein veya protein-membran dinamiklerini incelemek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, membranların kütle sitometrisi ve yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...