Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

G.G. wordt ondersteund door T32AG052374 en R.H.S. wordt ondersteund door R00AG065200 van het National Institute on Aging. We bedanken de CGC (gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) voor de stammen.

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Levensduur, meestal eenvoudig gedefinieerd als de duur van het leven, is een duidelijk binair fenomeen in de meeste organismen - een organisme leeft of niet. Een lang leven correleert echter niet altijd met de gezondheid van een organisme. Bijvoorbeeld, mitochondriale hormesemodellen waarbij blootstelling aan mitochondriale stress de levensduur dramatisch verlengt, zijn over het algemeen enkele van de langstlevende dieren, maar vertonen een groeiachterstand en een verminderde metabole functie37,54. Evenzo vertonen dieren met hyperactieve endoplasmatische reticulumstressreacties ook bepaald gedrag en fenotypen die kunnen worden gecorreleerd met verminderde gezondheid, ondanks het feit dat ze de eiwithomeostase en levensduur dramatisch hebben verbeterd36,49. Ten slotte zijn veel levensduurparadigma's in modelorganismen, waaronder verhoogde HSF-1-functie55, verhoogde XBP-1-functie56 en veranderde FoxO-signalering57, allemaal gecorreleerd met een verhoogd risico op kanker, en het is onbetwistbaar dat een langere levensduur niet gunstig is als een organisme in een constante strijd is met kanker en andere gezondheidsproblemen. Daarom kan een lang leven geen op zichzelf staande meting zijn in de verouderingsbiologie.
Het concept van healthspan is dus een groeiend veld in de verouderingsbiologie. Healthspan, losjes gedefinieerd als de periode van het leven dat men gezond is, is moeilijker vast te stellen dan een lang leven. In tegenstelling tot een lang leven is het concept van "gezondheid" echter ingewikkeld, omdat er veel verschillende uitlezingen zijn voor de gezondheid van organismen: op het niveau van het organisme zijn er spierfunctie / kracht, neuronale / cognitieve functie, reproductieve gezondheid, enz.; op cellulair niveau zijn er eiwithomeostase, lipidehomeostase, glucosehomeostase, metabolisme, enz. In 2014 hebben ouder wordende biologen biologische kenmerken van veroudering definitief gekarakteriseerd met de gestructureerde definitie dat het iets moet zijn dat van nature afbreekt tijdens het ouder worden en experimenteel kan worden gewijzigd, zodat experimentele exacerbatie veroudering zou moeten versnellen en experimentele interventie veroudering zou moeten vertragen. Deze negen kenmerken van veroudering omvatten genomische instabiliteit, telomeerverloop, epigenetische veranderingen, verlies van eiwithomeostase (proteostase), stamceluitputting, veranderde intercellulaire signalering, mitochondriale disfunctie, gedereguleerde nutriëntdetectie en cellulaire senescentie58. Sindsdien beweren talloze studies dat andere factoren moeten worden opgenomen, waaronder extracellulaire eiwitten en systemische fysiologie zoals immuniteit en ontsteking59. Uiteindelijk schrijft de complexe definitie van gezondheidspan voor dat de gezondheid van organismen wordt gemeten met behulp van meerdere verschillende methoden.
Daarom worden in dit manuscript meerdere methoden gepresenteerd om verschillende aspecten van de gezondheid te meten met behulp van het nematodenmodel, C. elegans. We testen locomotorisch gedrag met behulp van thrashing assays, reproductieve gezondheid met behulp van het aantal eieren en de broedgrootte, en gevoeligheid voor stress. Inderdaad, locomotorisch gedrag is een gouden standaardmethode voor het meten van de gezondheid, omdat organismen een aanzienlijk verlies van beweeglijkheid en beweging vertonen tijdens het ouder worden51. Verlies van locomotorisch gedrag kan worden toegeschreven aan meerdere kenmerken van veroudering, omdat de spierfunctie bij C. elegans afhankelijk is van een goede proteostase60, mitochondriale disfunctie61 en neuron-spiersignalering62. Hoewel dit manuscript zich richt op één meting van locomotorisch gedrag, is het belangrijk op te merken dat er veel andere methoden bestaan, waaronder beweeglijkheid van dieren op een massieve agarplaat, respons op aanraking51 en chemotaxis-assays63. Deze methoden vereisen echter over het algemeen meer geavanceerde opnameapparaten, het gebruik van wormvolgsoftware of het gebruik van dure, gevaarlijke of vluchtige chemicaliën, die allemaal onbetaalbaar kunnen zijn in sommige onderzoeksinstellingen.
Bovendien worden testen voor het aantal eieren en de broedgrootte gepresenteerd als een methode om de reproductieve gezondheid te meten en als de eenvoudigste methode om celdeling bij volwassen wormen te meten, omdat volwassen wormen post-mitotisch zijn en alleen geslachtscellen en embryo's celdeling ondergaan binnen een volwassen worm64. Als een maat voor celdeling kan reproductieve gezondheid relevant zijn voor de verouderingskenmerken van cellulaire senescentie en stamceluitputting. Reproductieve gezondheid kan worden beïnvloed door vele factoren, waaronder pathogene infectie65 of blootstelling aan stress49, hoewel er geen directe correlatie is tussen reproductieve gezondheid en levensduur. In feite vertonen sommige langlevende dieren een significante afname van broedgrootte49, en het is zelfs mogelijk dat er een omgekeerde correlatie bestaat tussen levensduur en broedgrootte50. Dit is geen fenomeen dat specifiek is voor C. elegans, omdat schadelijke effecten van reproductie op de levensduur al lang zijn waargenomen bij mensen66, gezelschapshonden67 en muizen68. Toch bieden we het aantal eieren en de broedgrootte als een betrouwbare en goedkope methode voor het meten van reproductieve gezondheid met de kanttekening dat reproductieve gezondheid mogelijk niet correleert met een lang leven of gezondheidsspanne.
Ten slotte worden overlevingstests aangeboden als een indirecte maat voor de gezondheid van het organisme. Belangrijk is dat cellulaire stressreacties, inclusief respons op thermische stress69 en ER-stress35, snel afnemen tijdens het verouderingsproces en direct relevant zijn voor het verouderingskenmerk van proteostase70,71. Hyperactiverende stressreacties kunnen daarentegen de levensduur aanzienlijk verlengen door de veerkracht tegen stress te bevorderen 35,37,38. Hoewel deze studie zich richt op de eenvoudigste en goedkoopste methoden, bestaat er een groot aantal alternatieve methoden voor stressbestendigheidstests voor thermotolerantie41 en oxidatieve stress66, die elk een andere set apparatuur en verbruiksartikelen vereisen. Naast eenvoudige blootstellingsstudies aan stressoren, kunnen andere fysiologische methoden worden uitgevoerd, afhankelijk van de toegang tot apparatuur. Een extracellulaire fluxanalysator kan bijvoorbeeld de mitochondriale functie en cellulaire ademhaling controleren73; fluorescerende dissectiemicroscopen maken metingen van transcriptionele melders mogelijk voor activering van stressrespons20; en hoge resolutie samengestelde of confocale microscopen kunnen worden gebruikt om organelmorfologie te meten met fluorescerende sondes voor mitochondriën74, het endoplasmatisch reticulum 75,76 en actinecytoskelet77.
Als een laatste waarschuwingsverhaal voor metingen van de levensduur, terwijl chemische en genetische methoden voor het steriliseren van wormen worden aangeboden om de kosten aanzienlijk te verlagen, is het belangrijk op te merken dat beide de levensduur direct kunnen beïnvloeden. Eerder is bijvoorbeeld gemeld dat blootstelling aan FUDR zowel de levensduur als de thermotolerantiebeïnvloedt 45. En hoewel de glp-4(bn2)-mutant zelf geen directe effecten heeft op de levensduur, is groei bij 25 °C een milde hittestress33,34 en kan dus de levensduur beïnvloeden2. Er bestaan andere methoden voor het steriliseren van C. elegans, waaronder auxine-gemedieerde steriliteit78 of alternatieve temperatuurgevoelige sperma-deficiënte mutanten79. Alle methoden hebben echter enkele kanttekeningen en er moet voor worden gezorgd dat de minst schadelijke test wordt gebruikt voor de wetenschappelijke behoeften van elk laboratorium. Een laatste beperking van langlevenstudies is potentiële variabiliteit die kan optreden als gevolg van lage steekproefgroottes of gewoon door een objectieve fout van de onderzoeker. Dit kan worden omzeild omdat nieuwe technologieën worden geboren in geautomatiseerde levensduurtechnologieën80, maar nogmaals, deze systemen zijn duur en vereisen enige technische en computationele apparatuur en vaardigheden. Uiteindelijk is de verzameling methoden die hier wordt aangeboden een betrouwbare set hulpmiddelen die snel kunnen worden aangepast en geleerd in bijna elke instelling en een solide basis bieden voor verouderingsbiologie.

Sinds de publicatie van 'The genetics of Caenorhabditis elegans', een van de meest invloedrijke artikelen van Sydney Brenner in 1974, wordt deze microscopische worm beschouwd als een uitstekend modelsysteem om biologische mysteries te bestuderen1. In 1977 publiceerde Michael R. Klass de methode voor het meten van de levensduur van C. elegans en stelde dit modelsysteem op om veroudering te bestuderen2. Het onderzoek om de relatie tussen stress en levensduur te begrijpen is begonnen met de identificatie van een enkele mutatie in het leeftijd-1 gen, wat resulteerde in een levensduurverlenging in C. elegans3. Bovendien hebben hedendaagse studies andere levensduurverhogende mutaties geïdentificeerd, die langlevende mutante wormen onthulden die een verhoogde weerstand tegen stress vertonen 4,5,6. Met zijn vele voordelen, waaronder een korte levensduur, eenvoudig onderhoud, volledig gesequenced genoom dat homologie bevat aan ongeveer tweederde van alle menselijke ziekteverwekkende genen, beschikbaarheid en gemak van het gebruik van RNA-interferentie (RNAi) bibliotheken, en fysiologische gelijkenis met mensen 7,8,9, is C. elegans snel aangenomen als een uitstekend model voor stress en verouderingsbiologie.
Misschien wel de grootste nutsvoorzieningen van C. elegans zijn de extreem lage onderhoudskosten, het gemak van experimenteren en de verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor studies. C. elegans worden meestal gekweekt op een vast agarmedium met een E. coli-voedselbron. Twee veelgebruikte E. coli-stammen zijn standaard OP50, een B-stam die misschien wel de meest gebruikte10 is, en HT115, een K-12-stam die voornamelijk wordt gebruikt voor RNAi-experimenten11,12. De HT115 K-12 stam draagt een deletie in RNAIII RNase, een mutatie die essentieel is voor RNAi-methoden, waarbij plasmiden die dsRNA tot expressie brengen dat overeenkomt met individuele C. elegans-genen worden gebruikt. De dsRNA-voedingsvectoren zorgen voor een robuuste knockdown van C. elegans-genen zonder de noodzaak van complexe kruisingen of genoombewerking, omdat bacteriën die deze plasmiden dragen rechtstreeks aan nematoden kunnen worden gevoerd. Duizenden van deze bacteriële RNAi-vectoren bestaan op de HT115-achtergrond, waaronder de meest populaire Vidal RNAi-bibliotheek met >19.000 individuele RNAi-constructies13 en de Ahringer RNAi-bibliotheek met 16.757 RNAi-constructies14. De bacteriële diëten OP50 en HT115 hebben echter grote verschillen in metabolisch profiel, waaronder verschillen in vitamine B1215,16. Daarom wordt aanbevolen om alle experimenten uit te voeren op een enkele bacteriebron, indien mogelijk, om gen-dieetinteracties te vermijden die meerdere verstorende factoren kunnen introduceren zoals eerder beschreven 17,18,19. Vanwege het gemak worden dieren op OP50 gehouden voor alle hier beschreven experimentele omstandigheden, maar alle experimenten worden uitgevoerd op HT115 zoals eerder beschreven20. Kortom, dieren worden op OP50 gehouden en na synchronisatie (na bleken) overgebracht naar HT115 voor consistentie tussen RNAi versus niet-RNAi-experimenten. Als alternatief kan ook een RNAi-competente OP50-stam worden gebruikt met een vergelijkbare deletie van RNAIII RNase in de E. coli K12 HT115-stam21.
Misschien is een belangrijke beperking van RNAi-experimenten in C. elegans de zorg voor knockdown-efficiëntie. Hoewel knockdown-efficiëntie kan worden gevalideerd via qPCR of western blotting, vereisen deze dure apparatuur en reagentia en zijn ze beperkt tot bulkanalyse. Dit is nog meer een zorg als we kijken naar specifieke cellen, zoals neuronen, die refractair (minder gevoelig) zijn voor RNAi. Hoewel de RNAi-efficiëntie in specifieke cellen kan worden verbeterd door overexpressie van SID-1, het transmembraaneiwit dat essentieel is voor dsRNA-opname22, is dit nog steeds beperkt tot de celtypespecifieke expressiepatronen van de promotors die voor deze constructen worden gebruikt, en dus zijn gen knock-outs en mutaties de meest waterdichte manier om genfuncties uit te putten. Naast RNAi-gemedieerde knockdown zijn C. elegans ook zeer vatbaar voor genoombewerking met CRISPR-gebaseerde strategieën 23,24,25 en transgene constructoverexpressie door micro-injecties, met de optie om transgene constructen te integreren door bestraling of transposon-gebaseerde integratie 26,27,28,29 . Deze methoden vereisen echter dure micro-injectieapparatuur en de hoge kosten van gids-RNA's of Cas9-enzym kunnen deze methoden verbieden in instellingen met beperkte financiering. In plaats daarvan zijn duizenden transgene lijnen en mutanten direct beschikbaar voor een paar dollar, zowel bij het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) als het National Bioresource Project (NBRP). De NBRP biedt geïsoleerde mutanten voor een groot aantal C. elegans-genen, waaronder gepubliceerde en daarom geverifieerde mutante stammen, mutanten afgeleid van proefprojecten en mutanten die nog moeten worden gekarakteriseerd. CGC daarentegen is een bewaarplaats van meestal gepubliceerde en gevestigde C. elegans-lijnen uit de onderzoeksgemeenschap. Beide verzenden soorten wereldwijd tegen zeer redelijke tarieven en bieden een breed scala aan opties voor mensen met een beperkte capaciteit om stammen in eigen huis te synthetiseren.
Hier wordt een samengestelde methodencollectie aangeboden, die waarschijnlijk de goedkoopste methoden zijn voor het testen van de levensduur en de gezondheidsspanne in C. elegans. Alle hier gepresenteerde methoden vereisen goedkope apparatuur en benodigdheden en gebruiken alleen stammen die direct beschikbaar zijn bij de CGC. Misschien wel het meest onbetaalbaar voor levensduur- en overlevingstests in C. elegans zijn de kosten van Nematode Growth Media (NGM) -platen. Aangezien C. elegans hermafrodieten zijn en zichzelf bevruchten, vereisen standaard overlevingstests dat volwassen dieren voortdurend van hun nageslacht worden verwijderd om besmetting door nakomelingen te voorkomen. Dit proces is niet alleen tijdrovend, het kan ook duur worden vanwege de noodzaak van ongeveer 100 platen per conditie om een enkele levensduurtest uit te voeren. Hier worden twee alternatieven geboden: gebruik van de temperatuurgevoelige kiembaanloze mutant, glp-4 (bn2) of chemische sterilisatie met behulp van 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). glp-4 codeert voor een valyl aminoacyl tRNA synthetase, en de temperatuurgevoelige glp-4(bn2) zijn reproductief deficiënt bij beperkende temperaturen als gevolg van verminderde eiwittransformatie30,31. FUDR is een robuuste methode om C. elegans chemisch te steriliseren door DNA-replicatie te voorkomen, waardoor de voortplanting wordt geremd32. Hoewel FUDR voor sommige laboratoria onbetaalbaar kan zijn, is slechts een kleine hoeveelheid nodig om wormen chemisch te steriliseren, en de stabiliteit in poedervorm kan het voor de meeste groepen haalbaar maken. Het gebruik van de temperatuurgevoelige glp-4 (bn2) mutant is zeker de goedkoopste optie, omdat de enige vereiste een incubator is om de dieren naar de beperkende 25 ° C te verplaatsen; er moet echter worden opgemerkt dat groei bij 25 °C milde hittestress33,34 kan veroorzaken. Ongeacht de methode kan het gebruik van steriele dieren de kosten van verbruiksartikelen die nodig zijn voor leeftijdsgebonden testen aanzienlijk verlagen.
Om veroudering te bestuderen, zijn standaard levensduurtests conventioneel omdat paradigma's die de levensduur veranderen directe gevolgen hebben voor veroudering. Metingen van de gezondheidsspanne en stresstolerantie bieden echter aanvullende informatie over de gezondheid van het organisme. Hier worden verschillende methoden aangeboden om de gezondheid te meten: 1) vruchtbaarheid als een maat voor reproductieve gezondheid; 2) broedgrootte als maat voor de ontwikkeling van de gezondheid en levensvatbaarheid van gelegde nakomelingen; en 3) locomotorisch gedrag als een maat voor spierfunctie en beweeglijkheid, die beide direct gecorreleerd zijn met veroudering. Daarnaast worden testen van stresstolerantie aangeboden: overleving tot ER-stress, mitochondriale / oxidatieve stress en thermische stressoverleving. Inderdaad, dieren met verhoogde weerstand tegen ER-stress35,36, mitochondriale stress37 en thermische stress38 vertonen een langere levensduur. ER-stress wordt toegepast door C. elegans bloot te stellen aan tunicamycine, dat N-gebonden glycosylatie blokkeert en de accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten veroorzaakt39. Mitochondriale / oxidatieve stress wordt geïnduceerd door blootstelling aan paraquat, die superoxidevorming induceert, specifiek in de mitochondriën40. Hittestress wordt toegepast door de incubatie van dieren bij 34-37 °C33,41. Alle hier beschreven testen kunnen worden uitgevoerd met minimale apparatuur en fondsen en bieden een verscheidenheid aan hulpmiddelen om veroudering in diverse groepen te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

De ontdekking en ontwikkeling van Caenorhabditis elegans als modelorganisme was invloedrijk in de biologie, met name op het gebied van veroudering. Veel historische en hedendaagse studies hebben duizenden levensduurveranderende paradigma's geïdentificeerd, waaronder genetische mutaties, transgene genexpressie en hormese, een gunstige, laaggradige blootstelling aan stress. Met zijn vele voordelen, waaronder een korte levensduur, eenvoudig en goedkoop onderhoud en een volledig gesequenced genoom met homologie aan bijna tweederde van alle menselijke genen, is C. elegans snel aangenomen als een uitstekend model voor stress en verouderingsbiologie. Hier worden verschillende gestandaardiseerde methoden onderzocht voor het meten van levensduur en gezondheidsspanne die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan bijna elke onderzoeksomgeving, vooral die met beperkte apparatuur en fondsen. Het ongelooflijke nut van C. elegans wordt gekenmerkt, wat het vermogen benadrukt om krachtige genetische analyses uit te voeren in de verouderingsbiologie zonder de noodzaak van uitgebreide infrastructuur. Ten slotte worden de beperkingen van elke analyse en alternatieve benaderingen besproken voor overweging.

C. elegans zijn een uitstekend modelorganisme voor verouderingsonderzoek vanwege een grote meerderheid van verouderingsmechanismen die bij mensen worden bewaard. Belangrijk is dat ze zeer lage kosten hebben in onderhoud en experimenten met minimale vereisten voor apparatuur en verbruiksartikelen, waardoor ze een felbegeerd modelsysteem zijn voor instellingen met beperkte middelen. Bovendien maakt een overvloed aan eenvoudige testen met ondiepe leercurves ze een uitstekend systeem voor zelfs de jongste onderzoeker met weinig tot geen ervaring. Al deze factoren in combinatie met de krachtige genetica van C. elegans , waaronder het gemak van genoombewerking, duizenden beschikbare mutanten en transgene dieren tegen nominale kosten, en beschikbare RNAi-bibliotheken voor genetische knockdown van vrijwel elk gen, maken ze een ideaal systeem voor niet-gegradueerde instellingen. Hier worden enkele van de goedkoopste methoden om veroudering in C. elegans te bestuderen onderzocht, voornamelijk gericht op testen met minimale apparatuur en verbruikskosten, evenals ondiepe leercurves. In feite werd het geheel van de protocollen en gegevensverzameling geschreven / uitgevoerd door junior onderzoekers met <5 maanden onderzoekservaring, meestal niet-gegradueerde studenten.
Levensduurstudies bij C. elegans zijn heel eenvoudig vanwege de korte levensduur van dieren, variërend van 14-20 dagen. Belangrijk is dat levensduurtests sterk gestandaardiseerd zijn en alleen een incubator, een standaard dissectiemicroscoop, een standaard wormpick en verbruiksartikelen vereisen voor het bereiden van NGM-agarplaten. Misschien wel het meest kostenonvriendelijke aspect van levensduurmetingen in C. elegans zijn verbruiksartikelen vereist. Dit komt omdat C. elegans hermafrodieten zijn die zichzelf bevruchten; daarom moeten volwassenen die worden gevolgd voor langleventests dagelijks worden verwijderd van nakomelingen. Dieren kunnen echter worden gesteriliseerd door ze bloot te stellen aan FUDR of door mutanten te gebruiken, zoals de temperatuurgevoelige kiembaanloze glp-4 (bn2) mutant gekweekt bij de prohibitieve 25 °C om de hoeveelheid benodigde verbruiksartikelen te verminderen 30,31,32. Hier werden levensduurtests uitgevoerd met FUDR of met de glp-4 (bn2) kiembaanloze mutanten, die vergelijkbare resultaten laten zien als standaardlevensduur uitgevoerd op niet-steriele dieren. Hoewel de levensduur van het wildtype niet identiek is vanwege de effecten van FUDR45 of groei bij 25 °C op levensduur2, vertoont het kortlevende hsf-1 knockdown-dier betrouwbaar een significante afname van de levensduur voor alle omstandigheden (figuur 1). hsf-1 codeert voor de heat-shock factor-1 transcriptiefactor, die betrokken is bij de regulatie van de thermische stressrespons, en de knockdown ervan resulteert in een significante afname van de levensduur38,46.
Hoewel een lang leven een belangrijke factor is om te overwegen in de verouderingsbiologie, correleert een lang leven vaak niet met een verhoogde gezondheid, zelfs niet in C. elegans47. Daarom bieden we als complementaire benadering verschillende methoden om de gezondheid van organismen te meten, waaronder reproductieve gezondheid, motorisch gedrag en stressbestendigheid. Reproductieve gezondheid kan op twee manieren worden gemeten. Ten eerste zullen metingen van het aantal eieren een directe meting geven van hoeveel eieren worden gelegd door een enkele zelfbevruchtende hermafrodiet. Omdat dieren echter meer eicellen produceren dan sperma, worden sommige onbevruchte eieren die nooit levensvatbare nakomelingen zouden produceren ook gelegd48. Daarom, om een beter begrip te krijgen van het ware voortplantingsvermogen van een dier, bieden metingen van de broedgrootte een maat voor hoeveel levensvatbare nakomelingen worden geproduceerd. Vaak kan verhoogde stressbestendigheid het voortplantingsvermogen verminderen, mogelijk als gevolg van het inherente effect van waargenomen stress op de voortplanting49. Evenzo wordt een significante afname van zowel het aantal gelegde eieren als de broedgrootte gevonden bij hsf-1 overexpressiedieren in vergelijking met wildtypecontroles (figuur 2A, B). In feite vertonen sommige hsf-1 overexpressiedieren volledige steriliteit, wat bewijs levert dat reproductieve gezondheid omgekeerd gecorreleerd kan zijn met een lang leven.
Hoewel reproductieve gezondheid belangrijk is voor het begrijpen van de gezondheid van de kiembaan, functionele meiose en reproductieve capaciteit, is er in het algemeen geen directe correlatie tussen levensduur en broedgrootte50. Dus, als een complementaire benadering, wordt locomotorisch gedrag aangeboden als een gouden standaardmethode voor het testen van C. elegans healthspan tijdens het ouder worden51. Er zijn veel methoden om locomotorisch gedrag te meten, maar de meeste methoden vereisen geavanceerde camera's, trackingsoftware of dure chemicaliën. Daarentegen vereisen thrashing-assays vrijwel geen apparatuur die verder gaat dan waar een standaard C. elegans-laboratorium mee is uitgerust: ontleedmicroscoop, wormpick, pipet en verbruiksartikelen voor het maken van NGM-agarplaten. Thrashing-percentages bieden een betrouwbare methode voor het meten van de gezondheid tijdens het ouder worden, zoals gemeten door een significante afname van thrashing bij oude dieren in vergelijking met jonge dieren (figuur 2C).
Ten slotte is survival to stress assays een extra fysiologische meting van veerkracht. Het vermogen om stressreacties te activeren neemt over het algemeen af tijdens het verouderingsproces, waardoor dieren minder veerkrachtig en gevoeliger voor stress worden. Stressbestendigheid kan dus worden gebruikt als een betrouwbare proxy voor de gezondheid van organismen. Hier worden methoden aangeboden voor het onderzoeken van de gevoeligheid voor 1) ER-stress als reactie op blootstelling aan tunicamycine, een chemisch middel dat N-gebonden glycosylering blokkeert en resulteert in accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten in de ER; 2) mitochondriale / oxidatieve stress door blootstelling aan paraquat, een chemisch agens dat superoxidevorming in mitochondriën induceert; en 3) thermische stress door blootstelling aan verhoogde temperaturen. Voor tunicamycine en paraquat assays wordt het medicijn opgenomen in de NGM-agarplaat tijdens de plaatproductie. Voor hoge concentraties tunicamycine ontwikkelt zich over het algemeen geen nakomelingen en daarom hoeven sterilisatietechnieken niet te worden gebruikt. Het hier gepresenteerde protocol beveelt 25 ng / μL aan als een uiteindelijke concentratie van tunicamycine, maar voor mensen met beperkte middelen toont 10 ng / μL ook een significante vermindering van de overleving (figuur 3A). Beide concentraties beperken de ontwikkeling van nakomelingen en er zijn dus geen sterilisatiemethoden nodig, hoewel de DMSO-controle een sterilisatietechniek of verplaatsing van dieren op nieuwe platen vereist. Dit komt omdat tunicamycine-toxiciteit de ontwikkeling van nakomelingen voorkomt, maar DMSO is vrijwel niet-toxisch, waardoor nakomelingen zich volledig kunnen ontwikkelen wanneer ze op tunicamycine worden gekweekt.
Voor paraquat-assays is een sterilisatietechniek of beweging van dieren vereist, omdat paraquatbehandeling niet voorkomt dat nakomelingen zich ontwikkelen tot volwassenheid. Hoge niveaus van paraquat (4 mM) verkorten de levensduur aanzienlijk, terwijl lage niveaus van paraquat (0,25 mM) de levensduur verlengen als gevolg van een hormetisch effect (figuur 3B), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten52. Ten slotte vereisen thermotolerantietests alleen een incubator die 30-37 °C kan bereiken en zijn er geen extra reagentia nodig. Overexpressie van hsf-1 verhoogt de thermotolerantie bij 37 °C (figuur 3C) zoals eerder gepubliceerd53. Zoals anderen echter eerder en uit de huidige gegevens hebben aangetoond, is het grootste probleem met thermotolerantietests hun variabiliteit. Veel factoren kunnen bijdragen aan variabiliteit binnen thermotolerantietests, waaronder verschillen tussen incubators en de tijd die dieren buiten de incubator doorbrengen terwijl ze elk uur thermotolerantie scoren. Voor een grondige richtlijn van thermotolerantie, zie de referentie 41.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg"> Figuur 1: Vergelijking van levensduurmetingen met en zonder sterilisatie. (A) Levensduur van wild-type N2-nematoden gekweekt op NGM-agarplaten bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi-bacteriën bij 20 °C. Dieren werden op dag 1, 3, 5 en 7 van de volwassenheid uit het nageslacht verwijderd. (B) Levensduur van in het wild levende N2-nematoden gekweekt op NGM-agar-FUDR-platen bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi-bacteriën bij 20 °C. Dieren werden volwassen gemaakt op standaard ev- of hsf-1 RNAi-platen en vervolgens verplaatst naar FUDR-platen op dag 1 van de volwassenheid. C) Levensduur van glp-4(bn2) mutante dieren gekweekt op NGM-agar platen bezaaid met lege vector (ev) of hsf-1 RNAi bij 25 °C. Voor alle omstandigheden werden dieren elke 2 dagen gescoord voor de dood totdat alle dieren als dood of gecensureerd werden geregistreerd. Dieren met zakken, uitsteeksel of explosie van de vulva, of dieren die langs de zijkanten van de platen kropen en uitgedroogd waren, werden gecensureerd. Alle statistieken zijn uitgevoerd met behulp van Log-Rank Mantel-Cox-tests en zijn te vinden in tabel 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg"> Figuur 2: Aantal eieren, broedgrootte en thrashing als metingen van de gezondheidsspanne. (A) Thrashing-assays werden uitgevoerd op glp-4 (bn2) mutante dieren gekweekt op NGM-agar-platen bezaaid met lege vector bij 25 ° C op dag 1 (blauw), dag 4 (rood) en dag 9 (groen) dieren. Thrashing werd gescoord bij dieren die in M9-oplossing op een NGM-agarplaat werden geplaatst, video-opnamen met een standaard smartphonecamera gemonteerd op een oculair van een standaard ontleedbare scope en thrashing scoorde in slow motion voor nauwkeurigheid. n = 15 dieren per aandoening. (B) Het aantal eieren werd gemeten bij wilde N2 (blauw) en sur-5p::hsf-1 (rode) dieren. Dieren werden gekweekt bij 20 °C en verplaatst naar verse borden, en eieren werden elke 12 uur geteld. Het totaal aantal gelegde eieren werd opgeteld. n = 7 dieren voor wildtype en 9 dieren voor sur-5p::hsf-1. C) Broedproeven werden gemeten bij dezelfde dieren als (B), waar eieren gedurende 2 dagen bij 20 °C werden gekweekt om uit te komen, en alle uitgekomen eieren werden geteld. = p < 0,001 berekend met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney-tests. Elke stip vertegenwoordigt een enkel dier en lijnen vertegenwoordigen het mediaan- en interkwartielbereik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg"> Figuur 3: Stressbestendigheid als proxy voor de gezondheid van het organisme. (A) Overlevingstest van N2-dieren gekweekt op de lege vector RNAi-bacteriën bij 20 °C. De dieren werden verplaatst naar platen met 1% DMSO, 10 ng/μL tunicamycine (TM) of 25 ng/μL TM op dag 1 van de volwassenheid. B) Overlevingstest van N2-dieren die zijn gekweekt op de lege vector RNAi-bacterie bij 20 °C. Dieren werden uit het luik gekweekt op platen met water, 0,25 mM paraquat (PQ) of 4 mM PQ. Voor A-B werden dieren elke 2 dagen gescoord voor de dood totdat alle dieren als dood of gecensureerd werden geregistreerd. Dieren met zakken, uitsteeksel of explosie van de vulva, of dieren die langs de zijkanten van de platen kropen en uitgedroogd waren, werden gecensureerd. Alle statistieken werden uitgevoerd met behulp van Log-Rank Mantel-Cox-tests (tabel 2). C) Gepoolde gegevens van alle thermotolerantietests van 37 °C voor dieren van het wildtype N2 versus overexpressie van hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Gegevens worden weergegeven als percentage levend op tijd = 9 uur van een thermotolerantietest, waarbij elke lijn een gematcht experiment vertegenwoordigt dat op dezelfde dag is uitgevoerd. Dieren werden gekweekt op de lege vector RNAi-bacteriën bij 20 °C en verplaatst naar 37 °C op dag 1 van de volwassenheid voor de test. n = 60 dieren per stam per duplo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td colspan="3">Recept</td>
		</tr><tr><td>Bleekoplossing</td>
			<td colspan="3">1,8% (v/v) natriumhypochloriet, 0,375 M KOH</td>
		</tr><tr><td>Carbenicilline</td>
			<td colspan="3">100 mg/ml stamoplossing (1000x) in water. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden of -20 °C voor langdurige opslag</td>
		</tr><tr><td>Fudr</td>
			<td colspan="3">10 mg/ml oplossing in water. Bewaren bij -20 °C.</td>
		</tr><tr><td>Iptg</td>
			<td colspan="3">1 M oplossing in water.</td>
		</tr><tr><td>Lysogenie Bouillon (LB)</td>
			<td colspan="3">In dit protocol werd commerciële LB gebruikt (zie Tabel van Materialen), maar alle standaard LB zelfgemaakte recepten met Bacto-trypton, gistextract en NaCl zijn voldoende.</td>
		</tr><tr><td>M9-oplossing</td>
			<td colspan="3">22 mM KH2PO4 monobasisch, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr><tr><td>Nematode GroeiMedia (NGM)</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi platen</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline. Bewaren bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 3 maanden</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline; 1% DMSO</td>
		</tr><tr><td>(controle op tunicamycine)</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi TM</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml carbenicilline/ampicilline; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamycine</td>
		</tr><tr><td>Paraquat</td>
			<td colspan="3">400 mM oplossing in water – moet vers worden bereid</td>
		</tr><tr><td>Tetracycline</td>
			<td colspan="3">10 mg/ml stockoplossing (500x) in 100% ethanol. Bewaren bij -20 °C</td>
		</tr><tr><td>Tunicamycine</td>
			<td colspan="3">2,5 mg/ml stamoplossing in 100% DMSO. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag. Dit is een 100x oplossing (25 ng/μL werkoplossing)</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1. Recepten voor reagentia en media voor protocollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Corresponderend deelvenster Afbeelding</td>
			<td colspan="2">Stam, Behandeling</td>
			<td>Mediane levensduur</td>
			<td># Sterfgevallen/# Totaal</td>
			<td>p-waarde (Log-Rank)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1a</td>
			<td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1b</td>
			<td colspan="2">N2, vector RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1c</td>
			<td colspan="2">N2, glp-4(bn2), vector RNAi, 25 °C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>< 0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C, 1% DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamycine</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycine</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vector RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td><0.001</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2. Statistieken voor levensduur en stressbestendigheid.

Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Dit protocol presenteert de laagste kosten en de laagste technische methoden voor het serveren van veroudering in zee-elegans. Een invloedrijk modelorganisme in de verouderingsbiologie. Het grootste voordeel van deze methoden is het gemak van implementatie, met behulp van goedkope apparatuur en materiaal.Waardoor ze vatbaar zijn voor elke onderzoeker, ongeacht ervaring of beschikbare financiering. Zoals een oude verouderingsstudie er is natuurlijke variabiliteit in gezondheid binnen populaties. Daarom is het essentieel dat experimenten worden uitgevoerd op gezonde, goed gevoede en strak gesynchroniseerde dieren.Om scheur invaliditeit te garanderen Begin met de bereiding van een liter nematode groeimedia of NGM vijzelplaat. Voeg 2,5 gram pepton, 3,0 gram natriumchloride en 20 gram vijzel toe aan een kolf van één liter met roerstaaf en voeg gedestilleerd water toe aan een eindvolume van 970 milliliter. Steriliseer de NGM-vijzeloplossing in een kolf van één liter met behulp van een standaard autoclaaf of mediasterilisator.En laat de oplossing roeren tot hij afkoelt tot 60 tot 75 graden Celsius. Terwijl de oplossing afkoelt, verwarmt u een kralenbad tot 65 tot 70 graden Celsius. Zodra de NGM vijzeloplossing afkoelt tot 60 tot 75 graden Celsius.Voeg de vloeibare additieven toe en laat de oplossing gedurende vijf minuten volledig mengen. Dompel de kolf vervolgens onder in een kralenbad bij 65 tot 70 graden Celsius om te voorkomen dat de media stollen tijdens het gieten in de plaat. Pipetteer negen tot 11 milliliter van de oplossing in elke 60 milliliterplaat.Als u klaar bent, plaatst u de pipet terug in de verwarmde oplossing om de temperatuur te handhaven en om te voorkomen dat media in de pipet stollen. Herhaal de procedure voor alle platen en laat NGM een plaat 's nachts stollen. Eenmaal gestold, gebruik ze voor het zaaien van platen met bacteriën of bewaar de platen in verzegelde containers gedurende maximaal drie maanden bij vier graden Celsius om de wormen via bleken te synchroniseren.Verzamel de aaltjes door een kleine hoeveelheid M9-oplossing op een bord met de wormen te gieten zonder de petrischaal te overvullen. Draai vervolgens de M nine-oplossing voorzichtig rond om wormen los te maken van de bacteriële gazons. Verzamel vervolgens volwassen gravidwormen in een buis van 15 milliliter met een serologische pipet.Vermijd het doorboren van de vijzel met de pipetpunt. Pelleteer de dieren met centr gedurende 30 seconden op 1100 keer G en adem het supernatant op. Voeg vijf milliliter van de vers bereide bleekoplossing toe aan de wormkorrel en controleer de wormen om de paar minuten onder een ontleedmicroscoop, samen met intermitterend krachtig schudden totdat alle volwassen wormlichamen zijn opgelost en alleen eieren in de mix zijn achtergebleven.Pelleteer vervolgens de eieren door het eierbleekmengsel gedurende 30 seconden op 1100 keer G te draaien en de bleekoplossing te aspirateren. Was vervolgens de gepelletiseerde eieren door maximaal 15 milliliter M9-oplossing toe te voegen en de buis vier of vijf keer om te keren om de eieren en oplossing te verspreiden. Nogmaals, centrifugeer de buis gedurende 30 seconden op 1100 maal G om de eieren te pelleteren en de M9-oplossing te aspirateren.Voer de was vier keer uit om bleekmiddel uit de eimix te verwijderen. Na de vierde wascentrifusie aspirateert u de M9-oplossing van 100 microliter naar twee milliliter, afhankelijk van het totale aantal gebleekte wormen. Schud de eieren grondig om de klonten te breken en zorg ervoor dat de eieren volledig geresuspendeerd zijn in de M9-oplossing.Als alternatief kunnen dieren L één worden gearresteerd voor een nauwere temporele synchronisatie door 10 tot 12 milliliter M9-oplossing toe te voegen aan de eikorrel in een kroniekbuis van 15 milliliter. Laat de wormen tot 24 uur in een rotator draaien bij 20 graden Celsius. Om het ei of L één concentratie pipetteer vier microliter van het eimengsel op een NGM-plaat met bacteriën.Tel en bereken vervolgens de aanwezige eieren per microliter media. Herhaal de telling drie of vier keer om de benadering te verbeteren, op basis van de benaderingsplaat, het juiste aantal eieren of L één gearresteerde dieren op de NGM vijzelplaat bezaaid met bacteriën naar keuze. Om het gedrag van de locomotief van de wormen te meten via thrashing.Verplaats een klein aantal volwassen wormen van een NGM-vijzelplaat naar 10 tot 20 microliter M9-oplossing onder een ontleedbereik. Concentreer je vervolgens op één worm tegelijk en tel het aantal keren dat het monster in 15 seconden overschakelt van een concave naar bolle formatie. Gebruik een handteller en een timer en herhaal de procedure voor 10 tot 15 wormen.Verouder de wormen tot de gewenste leeftijd en herhaal de metingen op alle gewenste leeftijden. Zoals gevisualiseerd, slaan oudere wormen met aanzienlijk lagere snelheden. Voor kwantiteits- en vruchtbaarheidsmetingen.In 10 tot 15 Caenorhabditis elegans-wormen, kies L vier wormen uit in een afzonderlijke NGM-vijzelplaat bezaaid met bacteriën naar keuze. Laat dieren 's nachts groeien bij 20 graden Celsius en zorg ervoor dat een nieuw gezaaide partij borden klaar is voor de volgende dag. Om de hoeveelheid eieren te meten die door Caenorhabditis zijn gelegd, brengen elegans de volwassen wormen over in een vers NGM-vijzelblad dat elke 12 tot 24 uur gedurende zeven tot acht dagen met die geplunderde bacterie is bezaaid of totdat de eieren niet langer zichtbaar zijn en tellen ze het aantal eieren dat op de borden wordt gelegd.Om de broedgrootte van Caenorhabditis elegans te meten Breng de volwassen wormen over op een verse NGM-vijzelplaat bezaaid met bacteriën om de 12 tot 24 uur, of zeven tot acht dagen of totdat het nageslacht niet langer zichtbaar is. Houd alle borden met eieren op 20 graden Celsius. Twee dagen na het overbrengen van wormen.Tel het ontwikkelde nageslacht op het bord. Tel alle levende en zich ontwikkelende wormen in het L-vierstadium of eerder om ervoor te zorgen dat de F twee-generatie de resultaten niet verstoort. Verwijder alle wormen van het bord terwijl ze worden geteld.Houd de platen nog een tot twee dagen langer aan voordat u ze opnieuw scoort om ervoor te zorgen dat dieren met vertraagd uitkomen of ontwikkeling niet worden gemist. Het effect van de sterilisatiemethode op de levensduur van de wilde type N2-nematoden toonde aan dat veranderingen in de levensduur van de wormen die op de NGM-vijzelplaten werden gekweekt, vergelijkbaar waren met die van wormen gekweekt op de NGM-vijzel FUDR-platen of de glp vier BN2-mutante dieren gekweekt op de NGM-vijzelplaten. Het kortlevende HSF one knockdown-dier vertoonde een significante afname van de levensduur voor alle omstandigheden.Een aanzienlijke afname van het aantal gelegde eieren en broedgrootte werd gevonden in de HSF-versie over expressiedieren in vergelijking met de wildtypecontroles. Sommige HSF-dieren vertoonden volledige steriliteit, wat aangeeft dat reproductieve gezondheid omgekeerd evenredig kan zijn met een lang leven. De thrashing rate bood een betrouwbare methode voor het meten van de gezondheid tijdens het ouder worden, zoals gemeten door een significante afname van het thrashing bij oude dieren in vergelijking met de jonge dieren.Overleving tot stress zijn betrouwbare testen voor het meten van de gezondheid van het organisme, Tunicamycine die reticulumstress veroorzaakt, resulteerde in een kortere levensduur, ongeacht de concentratie in vergelijking met DMSO-controle. De hoge niveaus van paraquat verkortten de levensduur aanzienlijk, terwijl lage concentraties paraquat de levensduur verhoogden als gevolg van hormetisch effect. In de thermotolerantietests verhoogde de overexpressie van HSF de thermotolerantie bij 37 graden Celsius Voor alle levensduur- en verouderingsexperimenten.Het is belangrijk om te onthouden dat sterilisatietechnieken een pleiotroop effect kunnen hebben op de gezondheid van organismen, wat de resultaten beïnvloedt. Er bestaan veel aanvullende en complementaire benaderingen voor het meten van de gezondheidsspanne als apparatuur en infrastructuur beschikbaar zijn, waaronder metingen van transcriptie, translatie-eiwitaggregatie, organel, morfologie en metabole functies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulatie van ploïdie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...