Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
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G.G.はT32AG052374、R.H.S.は国立老化研究所のR00AG065200によってサポートされています。我々は、この株についてCGC(NIH研究インフラプログラム事務局P40 OD010440が資金提供)に感謝する。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

寿命は、最も簡単には寿命として定義され、ほとんどの生物において、生物が生きているか生きていないかにかかわらず、明確な二項現象です。しかし、長寿は必ずしも生物の健康と相関しているわけではありません。例えば、ミトコンドリアストレスへの曝露が寿命を劇的に延ばすミトコンドリアホルミシスモデルは、一般に最も長生きしている動物の一部であるが、発育不全および代謝機能の低下を示す37,54。同様に、過活動小胞体ストレス応答を有する動物も、タンパク質恒常性および寿命が劇的に改善されたにもかかわらず、健康の低下と相関し得る特定の行動および表現型を示す36,49。最後に、HSF-1機能55の増加、XBP-1機能56の増加、およびFoxOシグナル伝達の変化57を含むモデル生物における多くの長寿パラダイムはすべて、がんリスクの増加と相関しており、生物ががんおよび他の健康疾患と絶えず闘っている場合、寿命の延長が有益ではないことは議論の余地がない。したがって、長寿は老化生物学における独立した測定ではあり得ません。
したがって、ヘルススパンの概念は、老化生物学の成長分野となっています。健康寿命は、大まかに言えば、健康である人生の期間として定義され、長寿よりも確認するのが難しいです。しかし、長寿とは異なり、「健康」の概念は、生物の健康には多くの異なる読み方があるため、複雑です:生物レベルでは、筋肉機能/強度、ニューロン/認知機能、リプロダクティブヘルスなどがあります。細胞レベルでは、タンパク質恒常性、脂質恒常性、グルコース恒常性、代謝などがある。2014年、老化生物学者は、老化の生物学的特徴を、老化の間に自然に分解し、実験的悪化が老化を加速し、実験的介入が老化を遅らせるように実験的に変更できるものでなければならないという構造化された定義で決定的に特徴付けた。老化のこれら9つの特徴には、ゲノム不安定性、テロメアの消耗、エピジェネティックな変化、タンパク質恒常性の喪失(プロテオスタシス)、幹細胞の枯渇、細胞間シグナル伝達の変化、ミトコンドリア機能障害、調節解除された栄養センシング、および細胞老化が含まれる58。それ以来、多くの研究が、細胞外タンパク質や免疫や炎症などの全身生理学を含む他の要因を含めるべきだと主張しています59。究極的には、healthspanの複雑な定義は、生物の健康が複数の異なる方法を使用して測定されることを義務付けています。
したがって、この原稿では、線虫モデルであるC. elegansを使用してヘルススパンのさまざまな側面を測定するための複数の方法が提示されています。スラッシングアッセイを用いた運動行動、卵数とひなの大きさを用いたリプロダクティブヘルス、ストレスに対する感受性をアッセイします。実際、運動運動行動は、生物が51歳の間に運動性と運動の著しい喪失を示すため、健康寿命を測定するためのゴールドスタンダードな方法です。C. elegansにおける筋肉機能は、適切なプロテオスタシス60、ミトコンドリア機能障害61、およびニューロン - 筋肉シグナル伝達62に依存するので、自発運動行動の喪失は、老化の複数の特徴に起因する可能性がある。この論文は運動行動の1つの測定に焦点を当てているが、固体寒天プレート上の動物の運動性、接触に対する応答51、走化性アッセイ63など、他の多くの方法が存在することに注意することが重要です。しかし、これらの方法は一般に、より洗練された記録装置、ワーム追跡ソフトウェアの使用、または高価で危険な、または揮発性の化学物質の使用を必要とし、これらはすべて一部の研究環境では禁止されている可能性があります。
さらに、成虫ワームは有糸分裂後であり、生殖細胞および胚のみが成虫ワーム内で細胞分裂を受けるので、卵数およびひなサイズのアッセイは、生殖に関する健康を測定する方法として、および成虫ワームの細胞分裂を測定する最も簡単な方法として提示される64。細胞分裂の尺度として、リプロダクティブヘルスは、細胞老化および幹細胞枯渇の老化の特徴に関連し得る。リプロダクティブ・ヘルスは、病原性感染症65やストレス49への曝露など、多くの要因の影響を受ける可能性があるが、リプロダクティブ・ヘルスと長寿の間に直接的な相関関係はない。実際、いくつかの長寿動物は、ひなのサイズ49の有意な減少を示し、長寿とひなのサイズ50との間に逆相関が存在する可能性さえある。これはC. elegansに特有の現象ではなく、生殖の長寿に対する有害な影響がヒト66、コンパニオンイヌ67、およびマウス68で長い間観察されてきた。それでも、私たちはリプロダクティブヘルスを測定するための信頼性が高く低コストの方法として卵数とひなのサイズを提供していますが、リプロダクティブヘルスは長寿や健康寿命と相関しない可能性があることに注意してください。
最後に、生存アッセイは、生物の健康の間接的な尺度として提供される。重要なことに、熱ストレス69およびERストレス35に対する応答を含む細胞ストレス応答は、老化プロセス中に急速に低下し、プロテオスタシス70、71の老化特徴に直接関連している。対照的に、過活性化ストレス応答は、ストレスに対する回復力を促進することによって寿命を有意に延ばすことができる35,37,38。この研究は、最も単純で低コストの方法に焦点を当てていますが、耐熱性41および酸化ストレス66には、ストレスレジリエンスアッセイのための多数の代替方法が存在し、それぞれが異なる機器および消耗品のセットを必要とする。ストレッサーへの単純な曝露研究を超えて、機器へのアクセスに応じて他の生理学的方法を実行することができます。例えば、細胞外フラックス分析装置は、ミトコンドリア機能および細胞呼吸をモニターすることができる73;蛍光解剖顕微鏡は、ストレス応答活性化のための転写レポーターの測定を可能にする20;高分解能化合物または共焦点顕微鏡は、ミトコンドリア74、小胞体75、76、およびアクチン細胞骨格77の蛍光プローブを用いてオルガネラの形態を測定するために使用することができる。
寿命の測定のための最後の警告として、ワームを殺菌するための化学的および遺伝的方法がコストを大幅に削減するために提供されていますが、どちらも寿命に直接影響を与える可能性があることに注意することが重要です。例えば、FUDRへの曝露は、寿命および耐熱性45の両方に影響を与えることが以前に報告されている。glp-4(bn2)変異体自体は寿命に直接影響しませんが、25°Cでの成長は軽度の熱ストレス33,34であり、したがって寿命2に影響を与える可能性があります。C.エレガンスを滅菌するための他の方法が存在し、オーキシン媒介性無菌性78または代替の温度感受性精子欠損変異体79を含む。しかし、すべての方法にはいくつかの注意点があり、各研究室の科学的ニーズに対して最も有害でないアッセイを利用するように注意する必要があります。長寿研究の最後の制限の1つは、サンプルサイズが低いか、単に研究者による客観的なエラーによって発生する可能性のある変動性です。自動化された寿命技術80で新しい技術が生まれるので、これは回避することができますが、これらのシステムはコストがかかり、エンジニアリングと計算機器とスキルが必要です。結局のところ、ここで提供される方法のコレクションは、ほぼすべての機関で迅速に適応および学習でき、老化生物学の強固な基盤を提供できる信頼性の高いツールセットです。

1974年にシドニー・ブレナーによって最も影響力のある論文の1つである「Caenorhabditis elegansの遺伝学」が出版されて以来、この顕微鏡ワームは生物学的謎を研究するための優れたモデルシステムと見なされてきました1。1977年、Michael R. KlassはC. elegansの寿命を測定する方法を発表し、老化2を研究するためにこのモデルシステムを確立しました。ストレスと長寿の関係を理解するための調査は、1歳遺伝子の単一の突然変異の同定から始まり、その結果、C. elegans3の寿命が延びました。さらに、現代の研究では、他の寿命を延ばす変異が同定されており、ストレスに対する耐性の増加を示す長寿命の変異ワームが明らかになりました4,5,6。短い寿命、容易なメンテナンス、すべてのヒト疾患原因遺伝子の約3分の2との相同性を含む完全に配列決定されたゲノム、RNA干渉(RNAi)ライブラリの可用性と使いやすさ、ヒトとの生理学的類似性7,8,9を含む多くの利点により、C. elegansはストレスおよび老化生物学の優れたモデルとして急速に採用されています。
おそらく、C. elegansの最大の有用性は、その非常に低い維持費、実験の容易さ、および研究に利用可能な様々な遺伝的ツールである。C.エレガンスは、典型的には、大腸菌食物源を有する固体寒天培地上で増殖される。2つの一般的に使用される大腸菌株は、標準OP50、おそらく最も一般的に使用されるB株10、およびHT115、主にRNAi実験に使用されるK−12株11,12である。HT115 K-12株はRNAIII RNaseの欠失を運び、これはRNAi法に不可欠な変異であり、個々のC.エレガンス遺伝子に対応するdsRNAを発現するプラスミドが使用される。dsRNA供給ベクターは、これらのプラスミドを運ぶ細菌を線虫に直接供給することができるため、複雑な交配やゲノム編集を必要とせずに、C. elegans遺伝子の堅牢なノックダウンを可能にします。これらの細菌RNAiベクターの数千がHT115バックグラウンドに存在し、その中には、>19,000個体のRNAi構築物13を有する最も人気のあるVidal RNAiライブラリーおよび16,757個のRNAi構築物14を有するアーリンガーRNAiライブラリーが含まれる。しかしながら、OP50およびHT115細菌食は、ビタミンB1215,16の違いを含む代謝プロファイルに大きな違いを有する。したがって、可能であれば、前述のように複数の交絡因子を導入する可能性のある遺伝子と食事の相互作用を避けるために、単一の細菌源に対してすべての実験を実行することが推奨される17、18、19。その容易さのために、動物は、ここに記載されるすべての実験条件についてOP50上で維持されるが、すべての実験は、前述のようにHT115上で行われる20。簡単に言えば、動物はOP50で維持され、RNAi実験と非RNAi実験の間の一貫性のために同期後(漂白後)にHT115に移されます。あるいは、大腸菌K12 HT115株に見られるRNAIII RNaseの類似の欠失を担持するRNAiコンピテントOP50株21を使用することもできる。
おそらく、C. elegansにおけるRNAi実験の主な制限の1つは、ノックダウン効率の懸念です。ノックダウン効率はqPCRまたはウェスタンブロッティングで検証できますが、これらは高価な機器と試薬を必要とし、バルク分析に限定されます。これは、RNAiに対して不応性(感受性が低い)であるニューロンなどの特定の細胞を見ると、さらに懸念事項です。特定の細胞におけるRNAi効率は、dsRNA取り込みに不可欠な膜貫通タンパク質であるSID−1の過剰発現を介して増強され得るが、これは依然としてこれらの構築物に使用されるプロモーターの細胞型特異的発現パターンに限定されているため、遺伝子ノックアウトおよび突然変異は、遺伝子機能を枯渇させる最も確実な手段である。RNAi媒介ノックダウンを超えて、C. elegansはCRISPRベースの戦略23、24、25およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック構築物の過剰発現によるゲノム編集にも非常に適しており、照射またはトランスポゾンベースの統合によってトランスジェニック構築物を統合するオプションがある26,27,28,29.しかし、これらの方法は高価なマイクロインジェクション装置を必要とし、ガイドRNAまたはCas9酵素の高コストは、限られた資金を有する機関においてこれらの方法を禁止する可能性がある。代わりに、何千ものトランスジェニック株と変異株が、Caenorhabditis Genetics Center(CGC)とNational Bioresource Project(NBRP)の両方で数ドルで容易に入手可能です。NBRPは、公開され、したがって検証された変異株、パイロットプロジェクトに由来する変異株、およびまだ特徴付けられていない変異株を含む、多数のC. elegans遺伝子の単離された変異体を提供する。対照的に、CGCは、研究コミュニティから主に出版され確立されたC. elegansラインの寄託所です。どちらも非常にリーズナブルな料金で世界中の株を出荷し、社内で株を合成する能力が限られている人のために多種多様なオプションを提供しています。
ここでは、C. elegansの寿命と健康寿命をアッセイするための最も低コストの方法である可能性が高い、キュレーションされたメソッドコレクションが提供されています。ここで紹介するすべての方法は、低コストの機器と消耗品を必要とし、CGCから容易に入手可能な株のみを利用する。おそらく、C. elegansにおける長寿および生存アッセイにとって最も法外なのは、線虫成長培地(NGM)プレートのコストである。C. elegansは雌雄同体であり、自己受精するので、標準的な生存アッセイでは、成体動物を子孫からの汚染を避けるために子孫から継続的に遠ざける必要があります。このプロセスには時間がかかるだけでなく、単一の寿命アッセイを実行するために条件ごとに約100枚のプレートが必要であるため、高価になる可能性があります。ここでは、温度感受性生殖細胞系列レス変異体glp-4(bn2)の利用、または5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(FUDR)を用いた化学滅菌の2つの選択肢が提供される。glp-4はバリルアミノアシルtRNA合成酵素をコードし、温度感受性glp-4(bn2)はタンパク質翻訳の減少により制限温度で生殖的に欠損している30,31。FUDRは、DNA複製を予防することによってC.エレガンスを化学的に滅菌し、したがって再生を阻害する堅牢な方法である32。FUDRは一部のラボでは法外に高価になる可能性がありますが、ワームを化学的に滅菌するために必要な量はわずかであり、粉末形態の安定性により、ほとんどのグループで実現可能になる可能性があります。温度に敏感なglp-4(bn2)変異体を利用することは、動物を制限的な25°Cにシフトさせるためのインキュベーターが唯一の要件であるため、確かに最も安価な選択肢です。ただし、25°Cでの成長は軽度の熱ストレス33,34を引き起こす可能性があることに注意してください。方法にかかわらず、滅菌動物を使用することで、加齢関連アッセイに必要な消耗品のコストを大幅に削減できます。
老化を研究するために、寿命を変えるパラダイムは老化に直接影響するため、標準的な寿命アッセイが一般的です。しかし、健康期間とストレス耐性の測定は、生物の健康に関する追加情報を提示する。ここでは、健康期間を測定するためにいくつかの方法が提供されています:1)リプロダクティブヘルスの尺度としての繁殖力。2)産まれた子孫の発達上の健康と生存可能性の尺度としてのひなの大きさ。3)筋肉機能および運動性の尺度としての自発運動行動は、いずれも加齢と直接相関している。さらに、ERストレスに対する生存、ミトコンドリア/酸化ストレス、および熱ストレス生存のストレス耐性のアッセイも提供されています。実際、ERストレス35、36、ミトコンドリアストレス37、および熱ストレス38に対する耐性の増加を有する動物は、寿命の延長を示す。小胞体ストレスは、C.エレガンスをツニカマイシンに曝露することによって加えられ、これはN結合型グリコシル化を遮断し、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積を引き起こす39。ミトコンドリア/酸化ストレスは、パラコートへの曝露によって誘発され、これはミトコンドリア40において特異的にスーパーオキシド形成を誘導する。熱ストレスは、34〜37°C33,41での動物のインキュベーションを通して加えられる。ここで説明するすべてのアッセイは、最小限の機器と資金で実行することができ、多様なグループの老化を研究するためのさまざまなツールを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

モデル生物としての Caenorhabditis elegansの 発見と開発は、生物学、特に老化の分野に影響を与えました。多くの歴史的および現代的な研究は、遺伝子変異、トランスジェニック遺伝子発現、およびストレスへの有益で低悪性度の曝露であるホルミシスを含む、寿命を変える何千ものパラダイムを特定している。 C. elegans は、寿命の短さ、簡単で低コストのメンテナンス、全ヒト遺伝子のほぼ3分の2と相同性のある完全に配列決定されたゲノムなど、多くの利点により、ストレスおよび老化生物学の優れたモデルとして急速に採用されています。ここでは、寿命と健康寿命を測定するためのいくつかの標準化された方法が調査されており、ほぼすべての研究環境、特に機器や資金が限られている研究環境に簡単に適応できます。 C. elegans の信じられないほどの有用性が紹介され、広範なインフラストラクチャを必要とせずに老化生物学における強力な遺伝子解析を実行する能力を強調しています。最後に、各分析の限界と代替アプローチについて検討のために説明します。

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Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegansは 、健康寿命、寿命、ストレスに対する回復力を調査するための堅牢で低コストの方法を備えた優れたモデルシステムとして機能します。

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

このプロトコルは、海のエレガンスの老化を提供するための最も低いコストと最も低い技術方法を提示します。老化生物学において影響力のあるモデル生物。これらの方法の最大の利点は、低コストの機器と材料を使用した実装の容易さです。経験や利用可能な資金に関係なく、どの研究者にも従順になるようにします。古い老化研究として、集団内の健康には自然なばらつきがあります。したがって、実験は健康で、十分に給餌され、緊密に同期された動物で行われることが不可欠です。リップ障害を確実にするために 1リットルの線虫増殖培地またはNGMオーガープレートの調製を開始します。2.5グラムのペップトーン、3.0グラムの塩化ナトリウム、20グラムのオーガーを攪拌子付きの1リットルのフラスコに加え、蒸留水を最終容量970ミリリットルまで加えます。NGMオーガー溶液を1リットルフラスコで、標準的なオートクレーブまたは培地滅菌器を使用して滅菌します。そして、それが摂氏60〜75度に冷えるまで溶液を攪拌します。溶液が冷えている間に、ビーズバスを摂氏65〜70度に加熱します。NGMオーガー溶液が摂氏60〜75度に冷却されると。液体添加剤を加え、溶液を5分間完全に混合させます。次に、フラスコを摂氏65〜70度のビーズバスに浸して、プレートに注ぐときにメディアが固化するのを防ぎます。各60ミリリットルプレートに9〜11ミリリットルの溶液をピペットで入れます。完了したら、ピペットを加熱溶液に戻し、温度を維持し、媒体がピペット内で固まるのを防ぎます。すべてのプレートに対してこの手順を繰り返し、NGM aプレートを一晩固化させます。固まったら、プレートにバクテリアを播種するか、プレートを密閉容器に摂氏4度で最大3か月間保管して、漂白を介してワームを同期させます。ペトリ皿をいっぱいにすることなく、ワームを含むプレートに少量のM9溶液を注ぐことにより、線虫を収集します。次に、M nine溶液を穏やかに回転させて、細菌の芝生からワームを緩めます。次に、成虫の妊娠虫を血清学的ピペットで15ミリリットルのチューブに集めます。ピペットチップでオーガーを突き刺さないでください。1100倍Gで30秒間セントrにより動物をペレット化し、上清を吸引した。5ミリリットルの新しく調製した漂白溶液をワームペレットに加え、すべての成虫の体が溶解し、卵だけが混合物に残るまで、断続的に激しく振とうしながら、数分ごとに解剖顕微鏡でワームをチェックします。次に、卵漂白ミックスを1100倍Gで30秒間スピンダウンして卵をペレット化し、漂白液を吸引します。次に、最大15ミリリットルのM9溶液を加え、チューブを4〜5回反転させて卵と溶液を分散させることにより、ペレット化された卵を洗浄します。再度、チューブを1100倍Gで30秒間遠心分離して卵をペレット化し、M9溶液を吸引します。卵ミックスから漂白剤を除去するために4回洗浄を実行します。4回目の洗浄遠心分離後、漂白されたワームの総数に応じてM9溶液を100マイクロリットルから2ミリリットルに吸引する。卵をよく振って塊を砕き、卵がM9溶液に完全に再懸濁されていることを確認します。あるいは、動物は、15ミリリットルのクロニクルチューブ内の卵ペレットに10〜12ミリリットルのM9溶液を加えることによって、より緊密な時間的同期のためにL1を逮捕することができる。ワームをローテーター内で摂氏20度で最大24時間回転させます。卵またはL1濃度ピペット4マイクロリットルの卵混合物を細菌を装着したNGMプレート上に近似する。次に、培地のマイクロリットルあたりに存在する卵を数えて計算します。近似を改善するためにカウントを3〜4回繰り返し、近似プレートに基づいて、適切な数の卵またはL1匹を、選択した細菌を播種したNGMオーガープレート上に1匹の動物を逮捕する。スラッシングを介してワームの機関車の行動を測定するため。少数の初日成虫をNGMオーガープレートから解剖スコープ下で10〜20マイクロリットルのM9溶液に移します。次に、一度に1つのワームに焦点を合わせ、標本が15秒で凹状から凸状に切り替わる回数を数えます。ハンドカウンターとタイマーを使用して、10〜15個のワームに対して手順を繰り返します。ワームを希望の年齢にエイジアウトし、すべての希望の年齢でスラッシング測定を繰り返します。視覚化されているように、古いワームはかなり遅い速度で叩きます。量と出生力の測定用。10〜15匹のカエノラブディティスエレガンスワームでは、L4匹のワームを選び出し、選択した細菌を播種した別のNGMオーガープレートに入れます。動物を摂氏20度で一晩成長させ、新しく播種したプレートのバッチが翌日の準備ができていることを確認します。Caenorhabditis elegansによって産まれた卵の量を測定するために、成虫をその略奪されたバクテリアを播種した新鮮なNGMオーガーブレードに7〜8日間、または卵が見えなくなるまで移し、プレートに置かれた卵の数を数えます。Caenorhabditis elegansのひなサイズを測定するには、成虫を12〜24時間ごと、または7〜8日ごと、または子孫が見えなくなるまで細菌を播種した新鮮なNGMオーガープレートに移します。卵を含むすべてのプレートを摂氏20度に保ちます。ワームを転送してから2日後。プレート上で発達した子孫を数えます。L 4段階以前のすべての生きているワームと発達中のワームを数えて、F 2世代が結果を混乱させないようにします。カウントされたら、プレートからすべてのワームを削除します。プレートをさらに1〜2日間維持してから再度採点し、孵化や発育が遅れた動物を見逃さないようにします。野生型N2線虫の寿命に及ぼす殺菌法の影響は、NGMオーガープレートで増殖した線虫の寿命の変化またはNGMオーガープレートで増殖したglp 4つのBN2変異動物の寿命の変化と類似していることを示した。短命のHSF1ノックダウン動物は、すべての条件で寿命の有意な低下を示しました。産卵数とひなのサイズの大幅な減少は、野生型対照と比較して、発現動物よりもHSFで見られました。一部のHSF一過剰発現動物は完全な不妊を示し、リプロダクティブヘルスが寿命と逆相関し得ることを示している。スラッシング率は、若い動物と比較して老いた動物のスラッシングの有意な減少によって測定されるように、老化中の健康を測定するための信頼できる方法を提供しました。ストレスに対する生存は、生物の健康状態を測定するための信頼できるアッセイであり、細網ストレスを引き起こすツニカマイシンは、DMSO対照と比較して濃度に関係なく寿命の低下をもたらした。高レベルのパラコートは寿命を著しく短くし、低濃度のパラコートはホルミティック効果のために寿命を延ばしました。耐熱性アッセイでは、HSF 1の過剰発現により、すべての寿命および老化実験で摂氏37度での耐熱性が増加しました。滅菌技術は生物の健康に多面的な影響を及ぼし、結果に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。転写、翻訳タンパク質凝集、オルガネラ、形態、代謝機能の測定など、機器やインフラストラクチャが利用可能であれば、健康寿命を測定するための多くの追加的かつ補完的なアプローチが存在します。

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Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...