Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

G.G.는 T32AG052374에 의해 지원되며 R.H.S.는 국립 노화 연구소의 R00AG065200에 의해 지원됩니다. 균주에 대한 CGC (NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440)에 감사드립니다.

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

수명은 가장 간단하게 삶의 기간으로 정의되며, 대부분의 유기체에서 명확한 이진 현상입니다 - 유기체가 살아 있거나 그렇지 않습니다. 그러나 장수가 항상 유기체의 건강과 관련이있는 것은 아닙니다. 예를 들어, 미토콘드리아 스트레스에 노출되면 수명이 극적으로 증가하는 미토콘드리아 hormesis 모델은 일반적으로 가장 오래 살았던 동물 중 일부이지만 성장 둔화 및 대사 기능 저하를 나타냅니다37,54. 마찬가지로, 과민성 소포체 스트레스 반응을 보이는 동물은 또한 단백질 항상성 및 수명이 극적으로 개선되었음에도 불구하고 건강 감소와 상관관계가 있을 수 있는 특정 행동 및 표현형을 나타낸다(36,49). 마지막으로, HSF-1 기능 증가(55), XBP-1 기능 증가(56), 변경된 FoxO 신호전달(57)을 포함하는 모델 유기체의 많은 장수 패러다임은 모두 암 위험 증가와 상관관계가 있으며, 유기체가 암 및 기타 건강 질환과 지속적으로 투쟁하는 경우 연장된 수명이 유익하지 않다는 것은 논쟁의 여지가 없다. 따라서 수명은 노화 생물학에서 독립형 측정이 될 수 없습니다.
따라서 건강 기간의 개념은 노화 생물학에서 성장하는 분야였습니다. 건강하다는 삶의 기간으로 느슨하게 정의 된 건강 수명은 장수보다 확인하기가 더 어렵습니다. 그러나 장수와는 달리 "건강"의 개념은 유기체 건강에 대한 많은 다른 판독 값이 있기 때문에 복잡합니다 : 유기체 수준에는 근육 기능 / 강도, 신경 / 인지 기능, 생식 건강 등이 있습니다. 세포 수준에는 단백질 항상성, 지질 항상성, 포도당 항상성, 신진 대사 등이 있습니다. 2014년, 노화 생물학자들은 노화의 생물학적 특징을 노화 중에 자연적으로 분해되는 것이어야 하고 실험적 악화가 노화를 가속화하고 실험적 개입이 노화를 늦추어야 한다는 구조화된 정의와 함께 결정적으로 특징지었다. 노화의 이러한 아홉 가지 특징은 게놈 불안정, 텔로미어 감소, 후성유전학적 변화, 단백질 항상성 상실(프로테오스타시스), 줄기 세포 고갈, 세포간 신호전달 변화, 미토콘드리아 기능장애, 탈조절된 영양소 감지, 및 세포 노화58을 포함한다. 그 이후로, 수많은 연구들은 세포외 단백질과 면역과 염증과 같은 전신 생리학을 포함한 다른 요인들이 포함되어야 한다고 주장한다59. 궁극적으로, 건강 범위에 대한 복잡한 정의는 유기체 건강이 여러 가지 다른 방법을 사용하여 측정되도록 요구합니다.
따라서이 원고에서는 선충류 모델 인 C. elegans를 사용하여 건강 기간의 다양한 측면을 측정하기 위해 여러 가지 방법이 제시됩니다. 우리는 스래싱 분석을 사용하여 운동 행동, 계란 수와 새끼 크기를 사용한 생식 건강, 스트레스에 대한 민감도를 분석합니다. 실제로, 운동 행동은 유기체가51 세 동안 운동성과 운동의 상당한 손실을 나타내기 때문에 건강 범위를 측정하기위한 황금 표준 방법입니다. 운동 행동의 손실은 C. elegans의 근육 기능이 적절한 프로테오스타시스60, 미토콘드리아 기능 장애 61 및 뉴런 근육 신호 전달 (62)에 의존하기 때문에 노화의 여러 특징에 기인 할 수 있습니다. 이 원고는 운동 행동의 한 측정에 초점을 맞추지 만, 단단한 한천 판에서 동물의 운동성, 터치51에 대한 반응 및 화학 축성 분석(63)을 포함한 많은 다른 방법이 존재한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 방법에는 일반적으로 더 정교한 기록 장치, 웜 추적 소프트웨어 사용 또는 고가, 위험 또는 휘발성 화학 물질의 사용이 필요하며 이들 모두는 일부 연구 설정에서 금지 될 수 있습니다.
또한, 난자 수 및 새끼 크기에 대한 분석은 생식 건강을 측정하는 방법과 성체 웜의 세포 분열을 측정하는 가장 간단한 방법으로 제시되는데, 성충은 유사분열 후 생식 세포와 배아 만 성체 웜(64) 내에서 세포 분열을 겪기 때문입니다. 세포 분열의 척도로서, 생식 건강은 세포 노화 및 줄기 세포 고갈의 노화 특징과 관련 될 수 있습니다. 생식 건강은 병원성 감염(65) 또는 스트레스(49)에 대한 노출을 포함하는 많은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있지만, 생식 건강과 장수 사이에는 직접적인 상관관계가 없다. 사실, 일부 장수 동물은 새끼 크기49에서 상당한 감소를 나타내며, 장수와 새끼 크기50 사이에 반비례 상관 관계가 존재할 수도 있습니다. 이것은 C. elegans에 특유한 현상이 아니며, 장수에 대한 번식의 해로운 영향은 인간66, 동반자 개 67 및 마우스68에서 오랫동안 관찰되어 왔기 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 생식 건강이 장수 또는 건강과 관련이 없을 수 있다는 경고와 함께 생식 건강을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 저렴한 방법으로 계란 수와 새끼 크기를 제공합니다.
마지막으로, 생존 분석은 유기체 건강의 간접적 인 척도로 제공됩니다. 중요하게도, 열 스트레스(69) 및 ER 스트레스(35)에 대한 반응을 포함하는 세포 스트레스 반응은 노화 과정 동안 급격히 감소하고 프로테오스타시스(proteostasis)70,71의 노화 특징과 직접적인 관련성을 갖는다. 대조적으로, 스트레스 반응을 과도하게 활성화시키는 것은 스트레스35,37,38에 대한 탄력성을 촉진함으로써 수명을 상당히 증가시킬 수 있다. 본 연구가 가장 단순하고 가장 낮은 비용의 방법에 초점을 맞추는 동안, 응력 복원력 분석을 위한 다수의 대안적인 방법들이 열관용(41) 및 산화 응력(66)에 대해 존재하며, 각각은 상이한 장비 및 소모품 세트를 필요로 한다. 스트레스 요인에 대한 간단한 노출 연구 외에도 장비에 대한 접근에 따라 다른 생리적 방법을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포외 플럭스 분석기는 미토콘드리아 기능 및 세포 호흡(73)을 모니터링할 수 있다; 형광 해부 현미경은 스트레스 반응 활성화를 위한 전사 리포터의 측정을 허용할 것이다(20); 고분해능 화합물 또는 공초점 현미경을 사용하여 미토콘드리아(74), 소포체(75,76), 및 액틴 세포골격(77)에 대한 형광 프로브를 사용하여 소기관 형태를 측정할 수있다.
장수 측정을위한 마지막 경고의 이야기로서, 웜을 살균하기위한 화학적 및 유전 적 방법이 비용을 크게 줄이기 위해 제공되지만, 둘 다 수명에 직접적인 영향을 줄 수 있다는 점에 유의해야합니다. 예를 들어, FUDR에 대한 노출은 수명과 내열성(45) 모두에 영향을 미치는 것으로 이전에 보고되었다. glp-4(bn2) 돌연변이체 자체는 수명에 직접적인 영향을 미치지 않지만, 25°C에서의 성장은 온화한 열 응력(33,34)이므로 수명2에 영향을 미칠 수 있다. C. elegans를 살균하기 위한 다른 방법들이 존재하는데, 여기에는 옥신-매개된 멸균성(78) 또는 대안적인 온도-민감성 정자-결핍 돌연변이체(79)가 포함된다. 그러나 모든 방법에는 몇 가지주의 사항이 있으며 각 실험실의 과학적 요구에 가장 해로운 분석을 활용하기 위해주의를 기울여야합니다. 수명 연구의 마지막 한계 중 하나는 낮은 표본 크기 또는 단순히 조사자의 객관적인 오류로 인해 발생할 수있는 잠재적 인 변동성입니다. 이것은 자동화 된 수명 기술(80)에서 새로운 기술이 탄생함에 따라 회피될 수 있지만, 다시 이러한 시스템은 비용이 많이 들고 일부 엔지니어링 및 전산 장비 및 기술을 필요로 한다. 궁극적으로, 여기에 제공된 방법의 수집은 거의 모든 기관에서 신속하게 적응하고 배울 수 있으며 노화 생물학을위한 견고한 토대를 제공 할 수있는 신뢰할 수있는 도구 세트입니다.

1974 년 시드니 브레너 (Sydney Brenner)가 가장 영향력있는 기사 중 하나 인 'Caenorhabditis elegans의 유전학'이 출판 된 이래로,이 현미경 웜은 생물학적 신비를 연구하는 뛰어난 모델 시스템으로 간주되어 왔습니다1. 1977년, 마이클 R. 클라스는 C. 엘레간스의 수명을 측정하는 방법을 발표하고 노화를 연구하기 위해 이 모델 시스템을 확립했다 2. 스트레스와 장수의 관계를 이해하기위한 조사는 1 세 유전자의 단일 돌연변이를 확인함으로써 시작되었으며, 이로 인해 C. elegans3의 수명 연장이 이루어졌습니다. 또한, 현대 연구는 스트레스에 대한 저항력을 증가시키는 오래 살았던 돌연변이 웜을 밝혀 낸 다른 수명을 증가시키는 돌연변이를 밝혀 냈습니다 4,5,6. 짧은 수명, 쉬운 유지, 모든 인간 질병 유발 유전자의 약 삼분의 일과의 상동성을 포함하는 완전히 서열화 된 게놈, RNA 간섭 (RNAi) 라이브러리의 가용성 및 용이성, 인간과의 생리적 유사성 7,8,9을 포함한 많은 장점을 통해 C. elegans는 스트레스 및 노화 생물학을위한 뛰어난 모델로 빠르게 채택되었습니다.
아마도 C. elegans의 가장 큰 유용성은 매우 낮은 유지 보수 비용, 실험 용이성 및 연구에 사용할 수있는 다양한 유전 도구입니다. C. 엘레간은 전형적으로 대장균 식품 공급원을 갖는 고체 한천 배지 상에서 성장한다. 일반적으로 사용되는 두 가지 대장균 균주는 표준 OP50, 아마도 가장 일반적으로 사용되는 B 균주 10 및 RNAi 실험 11,12 에 주로 사용되는K-12 균주HT115입니다. HT115 K-12 균주는 RNAi 방법에 필수적인 돌연변이인 RNAIII RNase에서 결실을 운반하며, 여기서 개별 C. 엘레간 유전자에 상응하는 dsRNA를 발현하는 플라스미드가 사용된다. dsRNA 공급 벡터는 이러한 플라스미드를 운반하는 박테리아가 선충류에 직접 공급될 수 있기 때문에 복잡한 교차 또는 게놈 편집 없이도 C. elegans 유전자의 강력한 녹다운을 허용합니다. 이러한 박테리아 RNAi 벡터의 수천은 HT115 배경에 존재하며, 여기에는 >19,000개의 개별 RNAi 구축물(13)을 갖는 가장 인기 있는 Vidal RNAi 라이브러리와 16,757개의 RNAi 구축물(14)이 있는 Ahringer RNAi 라이브러리가 포함된다. 그러나 OP50 및 HT115 박테리아 식단은 비타민 B1215,16의 차이를 포함하여 대사 프로파일에 큰 차이가 있습니다. 따라서 가능한 경우 단일 박테리아 공급원에 대한 모든 실험을 수행하여 앞서 설명한17,18,19와 같이 여러 가지 교란 요인을 도입 할 수있는 유전자 - 다이어트 상호 작용을 피하는 것이 좋습니다. 그것의 용이성으로 인해, 동물은 여기에 설명된 모든 실험 조건에 대해 OP50 상에서 유지되지만, 모든 실험은 앞서 설명된 바와 같이 HT115 상에서 수행된다20. 간략하게, 동물은 OP50에서 유지되고 RNAi 대 RNAi 실험 사이의 일관성을 위해 동기화 후 (표백 후) HT115로 옮겨진다. 대안적으로, 대장균 K12 HT115 균주에서 발견되는 RNAIII RNase의 유사한 결실을 운반하는 RNAi-적격 OP50 균주도 또한 사용될 수 있다(21).
아마도 C. elegans의 RNAi 실험에 대한 한 가지 주요 한계는 녹다운 효율성에 대한 우려입니다. 녹다운 효율은 qPCR 또는 웨스턴 블롯팅을 통해 검증할 수 있지만, 고가의 장비와 시약이 필요하며 대량 분석으로 제한됩니다. 이것은 RNAi에 불응성 (덜 민감한) 뉴런과 같은 특정 세포를 보는 것이 훨씬 더 우려됩니다. 특정 세포에서의 RNAi 효율은 dsRNA 흡수22에 필수적인 막횡단 단백질인 SID-1의 과발현을 통해 향상될 수 있지만, 이것은 여전히 이들 구축물에 사용되는 프로모터의 세포 유형-특이적 발현 패턴에 제한되며, 따라서 유전자 녹아웃 및 돌연변이는 유전자 기능을 고갈시키는 가장 확실한 수단이다. RNAi 매개 녹다운 외에도 C. elegans는 CRISPR 기반 전략 23,24,25 및 미세 주사를 통한 트랜스제닉 구축물 과발현을 통한 게놈 편집에 매우 적합하며, 조사 또는 트랜스포존 기반 통합을 통해 트랜스제닉 구축물을 통합할 수 있는 옵션 26,27,28,29 . 그러나 이러한 방법은 값 비싼 미세 주입 장비를 필요로하며, 가이드 RNA 또는 Cas9 효소의 높은 비용은 제한된 자금을 가진 기관에서 이러한 방법을 금지 할 수 있습니다. 대신, 수천 개의 트랜스제닉 라인과 돌연변이체는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)와 National Bioresource Project (NBRP)에서 몇 달러에 쉽게 구할 수 있습니다. NBRP는 공개되고 따라서 검증 된 돌연변이 균주, 파일럿 프로젝트에서 파생 된 돌연변이 및 아직 특성화되지 않은 돌연변이를 포함하여 많은 수의 C. elegans 유전자에 대해 분리 된 돌연변이를 제공합니다. 대조적으로, CGC는 연구 공동체에서 주로 출판되고 확립 된 C. elegans 라인의 보관소입니다. 둘 다 매우 합리적인 가격으로 전 세계적으로 균주를 운송하고 사내에서 균주를 합성 할 수있는 능력이 제한된 사람들에게 다양한 옵션을 제공합니다.
여기에서는 C. elegans의 수명과 건강 범위를 분석하기위한 가장 낮은 비용 방법 일 수있는 선별 된 방법 모음이 제공됩니다. 여기에 제시된 모든 방법은 저가의 장비와 소모품이 필요하며 CGC에서 쉽게 구할 수있는 균주 만 활용합니다. 아마도 C. elegans의 장수 및 생존 분석에서 가장 금지 된 것은 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트의 비용입니다. C. elegans는 hermaphrodite이고 자기 수정이기 때문에, 표준 생존 분석은 성인 동물이 자손의 오염을 피하기 위해 자손으로부터 지속적으로 멀리 이동하도록 요구합니다. 이 공정은 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 단일 수명 분석을 실행하기 위해 조건당 약 100개의 플레이트가 필요하기 때문에 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서, 두 가지 대안이 제공된다: 온도-민감성 생식계열이 없는 돌연변이체, glp-4(bn2)의 활용, 또는 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)을 이용한 화학적 멸균. glp-4는 발릴아미노아실 tRNA 신테타제를 코딩하고, 온도-민감성 glp-4(bn2)는 단백질 번역30,31 감소로 인해 제한적인 온도에서 생식적으로 결핍된다. FUDR은 DNA 복제를 방지하여 C. elegans를 화학적으로 살균하여 재생32를 억제하는 강력한 방법입니다. FUDR은 일부 실험실에서 엄청나게 비쌀 수 있지만 웜을 화학적으로 살균하는 데 소량 만 필요하며 분말 형태의 안정성으로 인해 대부분의 그룹에서 실현 가능할 수 있습니다. 온도에 민감한 glp-4 (bn2) 돌연변이를 활용하는 것은 동물을 제한적인 25 °C로 이동시키는 인큐베이터이기 때문에 확실히 가장 저렴한 옵션입니다. 그러나, 25°C에서의 성장은 가벼운 열 응력(33,34)을 야기할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 방법에 관계없이 멸균 동물을 사용하면 연령 관련 분석에 필요한 소모품 비용을 크게 줄일 수 있습니다.
노화를 연구하기 위해 표준 수명 분석은 수명을 변화시키는 패러다임이 노화에 직접적인 영향을 미치기 때문에 전통적입니다. 그러나 건강 범위 및 스트레스 내성의 측정은 유기체의 건강에 대한 추가 정보를 제공합니다. 여기에서, 건강 범위를 측정하기 위해 몇 가지 방법이 제공됩니다 : 1) 생식 건강의 척도로서의 번식력; 2) 해고 된 자손의 발달 건강과 생존 가능성의 척도로서의 새끼 크기; 3) 근육 기능과 운동성의 척도로서의 운동 적 행동, 둘 다 노화와 직접 관련이 있습니다. 또한, 응력 내성에 대한 분석이 제공됩니다 : ER 스트레스에 대한 생존, 미토콘드리아 / 산화 스트레스 및 열 스트레스 생존. 실제로, ER 스트레스35,36, 미토콘드리아 스트레스(37), 및 열 스트레스(38)에 대한 저항성이 증가된 동물은 증가된 수명을 나타낸다. ER 스트레스는 C. elegans를 tunicamycin에 노출시킴으로써 적용되며, 이는 N-연결된 글리코실화를 차단하고 미스폴딩된 단백질(39)의 축적을 야기한다. 미토콘드리아 / 산화 스트레스는 파라콰트에 노출되어 미토콘드리아에서 특히 수퍼 옥사이드 형성을 유도합니다40. 열 스트레스는 34-37°C에서 33,41의 동물 인큐베이션을 통해 가해진다. 여기에 설명 된 모든 분석은 최소한의 장비와 자금으로 수행 할 수 있으며 다양한 그룹에서 노화를 연구하기위한 다양한 도구를 제공합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

모델 유기체로서의 Caenorhabditis elegans의 발견과 개발은 생물학, 특히 노화 분야에서 영향을 미쳤습니다. 많은 역사적, 현대적 연구에서는 유전자 돌연변이, 트랜스제닉 유전자 발현, 스트레스에 대한 유익하고 낮은 등급의 노출인 hormesis를 포함한 수천 가지의 수명을 변화시키는 패러다임을 확인했습니다. 짧은 수명, 쉽고 저렴한 유지 보수, 모든 인간 유전자의 거의 삼분의 일에 대한 상동성을 가진 완전히 서열화 된 게놈을 포함한 많은 장점을 통해 C. elegans 는 스트레스 및 노화 생물학을위한 뛰어난 모델로 빠르게 채택되었습니다. 여기에서는 거의 모든 연구 환경, 특히 장비 및 자금이 제한된 연구 환경에 쉽게 적용 할 수있는 수명과 건강 상태를 측정하기 위해 몇 가지 표준화 된 방법이 조사됩니다. C. elegans 의 놀라운 유용성은 광범위한 인프라의 필요없이 노화 생물학에서 강력한 유전 분석을 수행 할 수있는 능력을 강조합니다. 마지막으로, 각 분석의 한계와 대안적인 접근법이 고려를 위해 논의된다.

C. elegans 는 인간과 함께 보존되는 노화 메커니즘의 대다수로 인해 노화 연구를위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 중요한 것은 장비 및 소모품에 대한 최소한의 요구 사항으로 유지 보수 및 실험 비용이 매우 저렴하여 자금이 제한된 기관을위한 탐나는 모델 시스템이된다는 것입니다. 또한, 얕은 학습 곡선을 가진 수많은 간단한 분석은 경험이 거의 없거나 전혀없는 가장 어린 조사관에게도 훌륭한 시스템입니다. 이러한 모든 요인들은 게놈 편집의 용이성, 명목상의 비용으로 수천 개의 사용 가능한 돌연변이 및 트랜스제닉 동물, 거의 모든 유전자의 유전 적 붕괴를위한 사용 가능한 RNAi 라이브러리를 포함하여 C. elegans 의 강력한 유전학과 결합하여 학부 기관에 이상적인 시스템이됩니다. 여기에서는 C. elegans 의 노화를 연구하는 가장 저렴한 방법 중 일부를 조사하여 주로 최소한의 장비와 소모품 비용뿐만 아니라 얕은 학습 곡선을 가진 분석에 중점을 둡니다. 사실, 프로토콜 및 데이터 수집의 전체는 <5 개월의 연구 경험을 가진 주니어 조사관, 주로 학부생에 의해 작성 / 수행되었습니다.
C. elegans의 장수 연구는 14-20 일에 이르는 동물의 수명이 짧기 때문에 매우 간단합니다. 중요한 것은 수명 분석이 고도로 표준화되어 있으며 NGM-한천 플레이트를 준비하기위한 인큐베이터, 표준 해부 현미경, 표준 웜 픽 및 소모품 만 필요하다는 것입니다. 아마도 C. elegans의 수명 측정에서 가장 비용이 많이 드는 측면은 소모품이 필요합니다. 이것은 C. elegans가 자기 비옥하게하는 헤르마프로디테스이기 때문입니다. 따라서 장수 분석을 위해 추적되는 성인은 매일 자손으로부터 멀어지게해야합니다. 그러나, 동물은 이들을 FUDR에 노출시키거나 25°C에서 성장한 온도 민감성 생식계열이 없는 glp-4(bn2) 돌연변이체와 같은 돌연변이체를 사용하여 멸균될 수 있으며, 필요한 소모품의 양을30,31,32로 감소시킬 수 있다. 여기서, 수명 분석은 FUDR 또는 glp-4(bn2) 생식계열이 없는 돌연변이체와 함께 수행되었으며, 이는 비멸균 동물에서 수행된 표준 수명과 유사한 결과를 보여준다. 야생형 수명은 FUDR 45 또는 수명 2에 대한 25°C에서의 성장의 영향으로 인해 동일하지않지만, 수명이 짧은 hsf-1 녹다운 동물은 모든 조건에서 수명이 크게 감소한 것을 확실하게 보여줍니다(그림 1). hsf-1은 열 스트레스 반응의 조절에 관여하는 열 충격 인자-1 전사 인자를 인코딩하며, 그 녹다운은 수명38,46의 현저한 감소를 초래한다.
장수는 노화 생물학에서 고려해야 할 중요한 요소이지만, 종종 수명은 C. elegans47에서도 건강 증가와 관련이 없습니다. 따라서 보완적인 접근 방식으로 우리는 생식 건강, 운동 행동 및 스트레스 탄력성을 포함하여 유기체 건강을 측정하는 몇 가지 방법을 제공합니다. 생식 건강은 두 가지 방법 중 하나로 측정 할 수 있습니다. 첫째, 난자 수를 측정하면 단일 자체 수정 hermaphrodite에 의해 얼마나 많은 알이 낳히는지 직접 측정 할 수 있습니다. 그러나 동물은 정자보다 더 많은 난모세포를 생산하기 때문에 생존 가능한 자손을 결코 생산하지 않는 수정되지 않은 난자도 배치됩니다48. 따라서 동물의 진정한 생식 능력을 더 잘 이해하기 위해 새끼 크기의 측정은 얼마나 많은 생존 가능한 자손이 생산되는지에 대한 척도를 제공합니다. 종종, 증가된 스트레스 회복력은 실제로 생식 능력을 감소시킬 수 있는데, 이는 잠재적으로 재생산에 대한 인지된 스트레스의 내재적 효과로 인한것이다(49). 유사하게, 알을 낳는 수와 새끼 크기 모두에서 유의한 감소가 야생형 대조군에 비해 hsf-1 과발현 동물에서 발견된다(도 2A,B). 사실, 일부 hsf-1 과발현 동물은 완전한 불임성을 나타내며, 생식 건강이 장수와 반비례 할 수 있다는 증거를 제공합니다.
생식 건강은 생식계열 건강, 기능적 meiosis 및 생식 능력을 이해하는 데 중요하지만, 일반적으로 장수와 새끼 크기50 사이에는 직접적인 상관 관계가 없습니다. 따라서, 보완적인 접근법으로서, 운동 행동은51 세 동안 C. elegans 건강 범위를 분석하기위한 황금 표준 방법으로 제공됩니다. 운동 행동을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있지만 대부분의 방법에는 정교한 카메라, 추적 소프트웨어 또는 값 비싼 화학 물질이 필요합니다. 대조적으로, 스래싱 분석법은 표준 C. elegans 실험실이 장착 한 것 이상의 장비가 거의 필요하지 않습니다 : 해부 현미경, 웜 픽, 피펫 및 NGM-한천 플레이트를 만들기위한 소모품. 스래싱 속도는 어린 동물에 비해 오래된 동물의 스래싱이 크게 감소하여 측정 된 노화 중 건강 상태를 측정하는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다 (그림 2C).
마지막으로, 스트레스 분석에 대한 생존은 탄력성의 추가적인 생리학적 측정이다. 스트레스 반응을 활성화시키는 능력은 일반적으로 노화 과정에서 감소하여 동물이 덜 탄력적이고 스트레스에 더 민감하게 만듭니다. 따라서, 스트레스 회복력은 유기체 건강을위한 신뢰할 수있는 프록시로 사용될 수 있습니다. 여기서, 1) 튜니카마이신 노출에 반응하여 ER 스트레스에 대한 민감성을 조사하기 위한 방법이 제공되며, 이는 N-연결된 글리코실화를 차단하고 ER에서 미스폴딩된 단백질의 축적을 초래하는 화학 작용제; 2) 미토콘드리아에서 수퍼 옥사이드 형성을 유도하는 화학 물질 인 파라콰트에 대한 노출을 통한 미토콘드리아 / 산화 스트레스; 3) 고온에 노출을 통한 열 응력. 튜니카마이신 및 파라콰트 분석의 경우, 약물은 플레이트 생산 동안 NGM-한천 플레이트에 통합됩니다. 고농도의 tunicamycin의 경우, 자손은 일반적으로 발달하지 않으므로 살균 기술을 사용할 필요가 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 튜니카마이신의 최종 농도로 25ng/μL를 권장하지만, 자금이 제한된 사람들에게는 10ng/μL가 생존율이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 3A). 두 농도 모두 자손 발달을 제한하므로 DMSO 제어에는 멸균 기술이나 동물을 새로운 판으로 이동시켜야하지만 멸균 방법이 필요하지 않습니다. 이것은 tunicamycin 독성이 자손의 발달을 막지 만, DMSO는 사실상 독성이 없기 때문에 자손이 tunicamycin에서 자랄 때 자손이 완전히 발달 할 수 있기 때문입니다.
파라콰트 분석의 경우, 파라콰트 치료가 자손이 성인기까지 발전하는 것을 막지 못하기 때문에 살균 기술이나 동물의 움직임이 필요합니다. 높은 수준의 파라콰트(4mM)는 수명을 상당히 단축시키는 반면, 낮은 수준의 파라콰트(0.25mM)는 이전에 발표된 결과(52)와 일치하는 호르몬 효과로 인해 수명을 증가시킨다(그림 3B). 마지막으로, 열관용 분석에는 30-37°C에 도달할 수 있는 인큐베이터만 필요하며 추가 시약은 필요하지 않습니다. hsf-1의 과발현은 이전에 발표된53과 같이 37°C에서 열관용을 증가시킨다(도 3C). 그러나 다른 사람들이 이전에 그리고 현재의 데이터에서 보여 주듯이, 열관용 분석의 주요 문제점은 가변성입니다. 많은 요인들이 인큐베이터 간의 차이와 동물이 매 시간마다 열관용을 채점하면서 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 포함하여 열관용 분석 내에서 변동성에 기여할 수 있습니다. 열관용에 대한 철저한 지침은 참조문헌 41을 참조한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg"> 그림 1: 멸균 유무에 관계없이 수명 측정의 비교. (A) 20°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi 박테리아로 시딩된 NGM-한천 플레이트에서 성장한 야생형 N2 선충류의 수명. 동물들은 성인기의 1일, 3일, 5일, 및 7일에 자손으로부터 멀어졌다. (b) 20°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi 박테리아로 시딩된 NGM-agar-FUDR 플레이트 상에서 성장한 야생형 N2 선충류의 수명. 동물을 표준 ev 또는 hsf-1 RNAi 플레이트 상에서 성인기까지 성장시킨 다음, 성인기의 1일째에 FUDR 플레이트로 이동시켰다. (c) 25°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi로 시딩된 NGM-한천 플레이트 상에서 성장한 glp-4(bn2) 돌연변이 동물의 수명. 모든 조건에 대해, 동물은 모든 동물이 사망 또는 검열된 것으로 기록될 때까지 매 2일마다 죽음에 대해 점수화되었다. 외음부의 배깅, 돌출 또는 폭발이있는 동물 또는 판의 측면을 기어 올라 건조시킨 동물은 검열되었습니다. 모든 통계는 Log-Rank Mantel-Cox 테스트를 사용하여 수행되었으며 표 2에서 확인할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg"> 도 2: 달걀 계수, 새끼 크기 및 스래싱을 건강 기간의 측정으로서 측정함 . (A) Thrashing assay는 1일째(파란색), 4일째(적색) 및 9일째(녹색) 동물에 25°C에서 빈 벡터로 시딩된 NGM-한천 플레이트 상에서 성장한 glp-4(bn2) 돌연변이 동물에 대해 수행되었다. NGM-한천 플레이트의 M9 용액에 넣은 동물에서 스래싱을 채점하고, 표준 해부 범위의 아이피스에 장착된 표준 스마트폰 카메라를 사용하여 비디오를 촬영하고, 정확성을 위해 슬로우 모션으로 스래싱을 채점했습니다. n = 조건 당 15 마리의 동물. (B) 계란 카운트는 야생형 N2(파란색) 및 sur-5p::hsf-1 (적색) 동물에서 측정하였다. 동물을 20°C에서 성장시키고 신선한 플레이트 상으로 이동시키고, 12시간마다 알을 계수하였다. 누워있는 알의 총 수를 합산했다. n = 야생형의 경우 7 마리의 동물과 sur-5p의 경우 9 마리의 동물입니다 ::hsf-1. (C) 부화를 허용하기 위해 20°C에서 2일 동안 알을 성장시킨 (B)와 동일한 동물에서 Brood 검정을 측정하고, 부화한 모든 알을 계수하였다. = p < 0.001은 비모수 만-휘트니 검정을 사용하여 계산하였다. 각 점은 단일 동물을 나타내고 선은 중앙값 및 사분위수 범위를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg"> 도 3: 유기체 건강에 대한 대리자로서의 스트레스 탄력성. (A) 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장한 N2 동물의 생존 검정. 동물을 성인 1일째에 1% DMSO, 10ng/μL 튜니카마이신 (상표명) 또는 25ng/μLTM을 함유하는 플레이트로 옮겼다. (b) 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장한 N2 동물의 생존 검정. 동물을 물, 0.25 mM 파라콰트 (PQ), 또는 4 mM PQ를 함유하는 플레이트 상에서 해치로부터 성장시켰다. A-B의 경우, 모든 동물이 사망 또는 검열된 것으로 기록될 때까지 2일마다 동물을 죽음에 대해 점수화하였다. 외음부의 배깅, 돌출 또는 폭발이있는 동물 또는 판의 측면을 기어 올라 건조시킨 동물은 검열되었습니다. 모든 통계는 로그-랭크 Mantel-Cox 테스트를 사용하여 수행되었다(표 2). (C) 야생형 N2 동물에 대한 모든 37°C 열관용 검정 대 hsf-1의 과발현에 대한 풀링된 데이터(sur-5p::hsf-1). 데이터는 열관용 분석의 시간 = 9h에서 생존 백분율로 표시되며, 각 라인은 같은 날에 수행된 매칭된 실험을 나타냅니다. 동물을 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장시키고, 분석을 위해 성인기의 1일째에 37°C로 이동시켰다. n = 반복실험당 균주당 60마리의 동물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td colspan="3">처방</td>
		</tr><tr><td>표백제 용액</td>
			<td colspan="3">1.8% (v/v) 차아염소산나트륨, 0.375 M KOH</td>
		</tr><tr><td>카베니실린</td>
			<td colspan="3">물에 100 mg / mL 원액 (1000x). 최대 6개월 동안 4°C에서 보관하거나 장기간 보관을 위해 -20°C에서 보관하십시오.</td>
		</tr><tr><td>푸드르</td>
			<td colspan="3">물에 10 mg / mL 용액. -20°C에서 보관한다.</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td colspan="3">물에 1 M 용액.</td>
		</tr><tr><td>리소제니 국물 (LB)</td>
			<td colspan="3">이 프로토콜에서는 상업용 LB가 사용되었지만 (재료 표 참조), 박토 트립톤, 효모 추출물 및 NaCl을 사용하는 모든 표준 LB 수제 요리법으로 충분합니다.</td>
		</tr><tr><td>M9 솔루션</td>
			<td colspan="3">22 mM KH2PO4 단염기성, 42.3 mMNa2HPO4, 85.6 mM NaCl,1 mMMgSO4</td>
		</tr><tr><td>선충류 성장 미디어 (NGM)</td>
			<td colspan="3">1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi 플레이트</td>
			<td colspan="3">1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토-펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린. 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 3 개월 동안 보관하십시오.</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린; 1% DMSO</td>
		</tr><tr><td>(튀니카마이신에 대한 대조군)</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAiTM</td>
			<td colspan="3">1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린; 1% DMSO, 25 ng/μL 튜니카마이신</td>
		</tr><tr><td>파라콰트</td>
			<td colspan="3">물 중 400 mM 용액 - 신선한 것을 준비해야합니다.</td>
		</tr><tr><td>테트라 사이클린</td>
			<td colspan="3">100% 에탄올에 10mg/mL 원액(500x). -20 °C에서 보관</td>
		</tr><tr><td>튀니카마이신</td>
			<td colspan="3">100% DMSO에 있는 2.5 mg/mL 원액. 장기간 보관을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 이것은 100x 용액 (25 ng / μL 작업 용액)입니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1. 프로토콜을위한 시약 및 매체에 대한 조리법.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>해당 그림 패널</td>
			<td colspan="2">변형, 치료</td>
			<td>중간 수명</td>
			<td># 사망자/# 합계</td>
			<td>p-값 (로그 랭크)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1A</td>
			<td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, 20°C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1B</td>
			<td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, FUDR, 20°C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20°C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1C</td>
			<td colspan="2">N2, glp-4(bn2), 벡터 RNAi, 25°C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25°C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C, 1% DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C, 10 ng/μL 튜니카마이신</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C, 25 ng/μL 튜니카마이신</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C, 0.25 mM 파라콰트</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, 벡터 RNAi, 20°C, 4 mM 파라콰트</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td>0.001<</td>
		</tr></tbody></table>표 2. 수명과 스트레스 회복력에 대한 통계.

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Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

이 프로토콜은 바다 엘레 간에서 노화를 제공하기위한 가장 낮은 비용과 가장 낮은 기술 방법을 제시합니다. 노화 생물학에서 영향력있는 모델 유기체. 이러한 방법의 가장 큰 장점은 저렴한 장비와 재료를 사용하여 구현이 쉽다는 것입니다.경험이나 사용 가능한 자금에 관계없이 모든 연구자에게 복종할 수 있도록 합니다. 오래된 노화 연구로서 인구 내 건강에는 자연적인 변동성이 있습니다. 따라서 건강하고 잘 먹으며 단단히 동기화 된 동물에 대한 실험을 수행하는 것이 필수적입니다.찢어짐 장애를 보장하기 위해 1 리터 선충 성장 배지 또는 NGM 오거 플레이트의 준비를 시작하십시오. 2.5g의 펩 톤, 3.0g의 염화나트륨 및 20g의 오거를 교반 막대가있는 1 리터 플라스크에 넣고 증류수를 최종 부피 970ml로 첨가하십시오. 표준 오토클레이브 또는 매체 멸균기를 사용하여 1리터 플라스크에서 NGM 오거 용액을 멸균합니다.그리고 용액을 섭씨 60도에서 75도까지 식을 때까지 저어줍니다. 용액이 냉각되는 동안 비드 배스를 섭씨 65도에서 70도까지 가열합니다. NGM 오거 용액이 섭씨 60도에서 75도까지 냉각되면.액체 첨가제를 넣고 용액이 5 분 동안 완전히 혼합되도록하십시오. 그런 다음 플라스크를 섭씨 65도에서 70도의 비드 배스에 담그면 플레이트에 붓는 동안 매체가 응고되는 것을 방지할 수 있습니다. 9 내지 11 밀리리터의 용액을 각각의 60 밀리리터 플레이트에 피펫팅한다.완료되면 온도를 유지하고 피펫에서 매체가 응고되는 것을 방지하기 위해 가열된 용액에 피펫을 다시 놓습니다. 모든 플레이트에 대해 이 절차를 반복하고 NGM A 플레이트가 밤새 응고되도록 합니다. 일단 응고되면 박테리아로 접시를 파종하는 데 사용하거나 표백을 통해 벌레를 동기화하기 위해 섭씨 4도에서 최대 3 개월 동안 밀봉 된 용기에 보관하십시오.페트리 접시를 과도하게 채우지 않고 벌레가 들어있는 접시에 소량의 M9 용액을 부어 선충류를 수집합니다. 그런 다음 M 9 용액을 부드럽게 소용돌이 치며 박테리아 잔디에서 벌레를 풀어줍니다. 다음으로, 혈청 학적 피펫으로 15 밀리리터 튜브에 성인 gravid 벌레를 수집합니다.피펫 팁으로 오거를 관통하지 마십시오. 동물을 1100배 G에서 30초 동안 센트르씩 펠렛화하고, 상청액을 흡인한다. 새로 준비한 표백 용액 5 밀리리터를 벌레 펠릿에 넣고 모든 성인 벌레 몸체가 녹고 계란 만 혼합물에 남을 때까지 간헐적으로 격렬한 흔들림과 함께 몇 분마다 해부 현미경으로 벌레를 확인합니다.다음으로, 계란 표백제 혼합물을 1100배 G에서 30초 동안 스핀다운하여 계란을 펠릿하고 표백액을 흡인합니다. 그런 다음 최대 15ml의 M9 용액을 추가하고 튜브를 4-5 번 뒤집어 계란과 용액을 분산시켜 펠렛 계란을 씻습니다. 다시 튜브를 1100배 G에서 30초 동안 원심분리하여 계란을 펠릿화하고 M9 용액을 흡인합니다.계란 믹스에서 표백제를 제거하기 위해 네 번 세척하십시오. 네 번째 세척 후 원심 주입은 표백 된 웜의 총 수에 따라 100 마이크로 리터에서 2 밀리리터까지 M9 용액을 흡인합니다. 계란을 완전히 흔들어 덩어리를 부수고 계란이 M9 용액에 완전히 재현되도록 합니다.대안적으로, 동물은 15 밀리리터 크로니클 튜브의 달걀 펠릿에 10 내지 12 밀리리터의 M9 용액을 첨가함으로써 더 엄격한 시간적 동기화를 위해 L1 체포될 수 있다. 벌레가 섭씨 20도에서 최대 24시간 동안 회전 장치에서 회전하도록 합니다. 계란 L 또는 L 농도를 근사화하기 위해 4 마이크로리터의 계란 혼합물을 박테리아가 장착된 NGM 플레이트 상에 피펫팅한다.그런 다음 마이크로 리터의 배지 당 존재하는 알을 세고 계산하십시오. 근사치를 개선하기 위해 3 또는 4회 반복하여, 근사 플레이트, 적절한 수의 알 또는 L개의 포획된 동물을 선택한 박테리아가 파종된 NGM 오거 플레이트 상에 기초한다. 스래싱을 통해 웜의 기관차 동작을 측정합니다.NGM 오거 플레이트에서 소량의 성인 벌레를 해부 범위 아래 10-20 마이크로 리터의 M9 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 한 번에 하나의 웜에 초점을 맞추고 시편이 15초 안에 오목한 형태에서 볼록한 형태로 전환되는 횟수를 세십시오. 핸드 카운터와 타이머를 사용하여 10-15 개의 웜에 대해 절차를 반복하십시오.웜을 원하는 나이로 노화시키고 원하는 모든 연령에서 스래싱 측정을 반복합니다. 시각화 된 바와 같이, 오래된 웜은 상당히 느린 속도로 스래시합니다. 수량 및 출산율 측정용.10-15 개의 Caenorhabditis elegans 웜에서 L 4 개의 웜을 선택하여 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM 오거 플레이트에 넣습니다. 동물이 섭씨 20도에서 밤새 자라도록 하고 새로 씨를 뿌린 접시 배치가 다음 날을 위해 준비되었는지 확인하십시오. Caenorhabditis elegans가 낳은 알의 양을 측정하기 위해 성인 벌레를 약탈 된 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 오거 블레이드로 옮기고 7-8 일 동안 또는 알이 더 이상 보이지 않을 때까지 12-24 시간마다 접시에 놓인 알의 수를 세십시오.Caenorhabditis elegans의 무리 크기를 측정하려면 성인 벌레를 12-24 시간마다 또는 7-8 일마다 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 오거 플레이트로 옮깁니다. 계란이 들어있는 모든 접시를 섭씨 20도에 보관하십시오. 웜을 옮긴 지 이틀 후.접시에 개발 된 자손을 세십시오. F 2 세대가 결과를 혼동하지 않도록 L 4 단계 또는 그 이전에 살아있는 웜과 발달하는 웜을 모두 세십시오. 계산되는 대로 플레이트에서 모든 벌레를 제거합니다.부화 또는 발달이 지연된 동물을 놓치지 않도록 다시 점수를 매기기 전에 추가로 1-2 일 동안 플레이트를 유지하십시오. 야생형 N2 선충류의 수명에 대한 살균 방법의 효과는 NGM 오거 플레이트에서 자란 벌레의 수명 변화가 NGM 오거 FUDR 플레이트 또는 NGM 오거 플레이트에서 자란 GLP 4 BN2 돌연변이 동물의 수명과 유사하다는 것을 보여주었습니다. 수명이 짧은 HSF 한 넉다운 동물은 모든 조건에서 수명이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다.야생형 대조군에 비해 HSF 발현 동물에서 알을 낳는 수 및 새끼 크기의 실질적인 감소가 발견되었다. 일부 HSF를 오버 발현한 동물은 생식 건강이 수명과 반비례할 수 있음을 나타내는 완전 불임을 나타내었다. 스래싱 비율은 어린 동물에 비해 늙은 동물의 스래싱이 크게 감소하여 측정된 노화 중 건강을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공했습니다.스트레스에 대한 생존은 유기체 건강을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석이며, 세망 스트레스를 유발하는 Tunicamycin은 DMSO 대조군에 비해 농도에 관계없이 수명을 단축시켰습니다. 높은 수준의 파라콰트는 수명을 크게 단축시킨 반면 낮은 농도의 파라콰트는 호르메틱 효과로 인해 수명을 늘렸습니다. 내열 분석에서, HSF의 과발현은 모든 수명 및 노화 실험에 대해 섭씨 37도에서 열 내성을 증가시켰다.살균 기술은 유기체 건강에 다방성 영향을 미칠 수 있으며 이는 결과에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 전사, 번역 단백질 응집, 세포 기관, 형태학 및 대사 기능 측정을 포함하여 장비 및 인프라를 사용할 수 있는 경우 건강 기간을 측정하기 위한 많은 추가 및 보완 접근 방식이 존재합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

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C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

형광 리포터 및 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)를 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 세대 간 후성유전학적 유전 분석

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...