Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

G.G. поддерживается T32AG052374, а R.H.S. поддерживается R00AG065200 из Национального института старения. Мы благодарим CGC (финансируется Управлением исследовательской инфраструктуры NIH P40 OD010440) за штаммы.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Продолжительность жизни, наиболее просто определяемая как продолжительность жизни, является явным бинарным явлением в большинстве организмов - либо организм жив, либо нет. Однако долголетие не всегда коррелирует со здоровьем организма. Например, модели митохондриального гормеза, в которых воздействие митохондриального стресса резко увеличивает продолжительность жизни, как правило, являются одними из самых долгоживущих животных, но демонстрируют задержку роста и снижение метаболической функции37,54. Аналогичным образом, животные с гиперактивными реакциями на стресс эндоплазматического ретикулума также демонстрируют определенное поведение и фенотипы, которые могут быть коррелированы с ухудшением здоровья, несмотря на значительное улучшение гомеостаза белка и продолжительности жизни36,49. Наконец, многие парадигмы долголетия в модельных организмах, включая повышенную функцию HSF-155, повышенную функцию XBP-156 и измененную передачу сигналов FoxO57, коррелируют с повышенным риском развития рака, и бесспорно, что увеличение продолжительности жизни не приносит пользы, если организм находится в постоянной борьбе с раком и другими заболеваниями здоровья. Поэтому долголетие не может быть самостоятельным измерением в биологии старения.
Таким образом, концепция healthspan была растущей областью в биологии старения. Продолжительность здоровья, свободно определяемую как период жизни, в течение которого человек здоров, труднее определить, чем долголетие. Однако, в отличие от долголетия, понятие «здоровье» является сложным, поскольку существует много различных показателей здоровья организма: на уровне организма существуют мышечная функция / сила, нейронная / когнитивная функция, репродуктивное здоровье и т. Д.; на клеточном уровне различают белковый гомеостаз, липидный гомеостаз, глюкозный гомеостаз, обмен веществ и др. В 2014 году биологи старения окончательно охарактеризовали биологические признаки старения структурированным определением, что это должно быть что-то, что естественным образом разрушается во время старения и может быть экспериментально изменено таким образом, что экспериментальное обострение должно ускорить старение, а экспериментальное вмешательство должно замедлить старение. Эти девять признаков старения включают геномную нестабильность, истощение теломер, эпигенетические изменения, потерю белкового гомеостаза (протеостаза), истощение стволовых клеток, измененную межклеточную сигнализацию, митохондриальную дисфункцию, дерегулированное восприятие питательных веществ и клеточное старение58. С тех пор многочисленные исследования утверждают, что следует включить другие факторы, включая внеклеточные белки и системную физиологию, такие как иммунитет и воспаление59. В конечном счете, сложное определение healthspan требует, чтобы здоровье организма измерялось с использованием нескольких различных методов.
Поэтому в этой рукописи представлено несколько методов измерения различных аспектов здоровья с использованием модели нематоды C. elegans. Мы анализируем поведение опорно-двигательного аппарата с помощью анализов, репродуктивное здоровье с использованием количества яиц и размера расплода, а также чувствительность к стрессу. Действительно, локомоторное поведение является золотым стандартом для измерения продолжительности здоровья, поскольку организмы демонстрируют значительную потерю подвижности и движения во время старения51 года. Потеря опорно-двигательного поведения может быть отнесена к множественным признакам старения, поскольку мышечная функция у C. elegans зависит от правильного протеостаза60, митохондриальной дисфункции61 и передачи сигналов нейронами-мышцами62. Хотя эта рукопись фокусируется на одном измерении двигательного поведения, важно отметить, что существует много других методов, включая подвижность животных на твердой агаровой пластине, реакцию на прикосновение51 и анализы хемотаксиса63. Однако эти методы, как правило, требуют более сложных записывающих устройств, использования программного обеспечения для отслеживания червей или использования дорогих, опасных или летучих химических веществ, все из которых могут быть непомерно высокими в некоторых исследовательских условиях.
Кроме того, анализы на количество яйцеклеток и размер расплода представлены как метод измерения репродуктивного здоровья и как простейший метод измерения деления клеток у взрослых червей, поскольку взрослые черви являются постмитотическими и только половые клетки и эмбрионы подвергаются делению клеток у взрослого червя64. Как мера деления клеток, репродуктивное здоровье может иметь отношение к возрастным признакам клеточного старения и истощения стволовых клеток. На репродуктивное здоровье могут влиять многие факторы, включая патогенную инфекцию65 или воздействие стресса49, хотя прямой корреляции между репродуктивным здоровьем и долголетием нет. Фактически, некоторые долгоживущие животные демонстрируют значительное уменьшение размера расплода49, и даже возможно, что существует обратная корреляция между долголетием и размером расплода50. Это не является явлением , характерным для C. elegans, так как пагубное влияние размножения на долголетие уже давно наблюдается у людей66, собак-компаньонов67 и мышей68. Тем не менее, мы предоставляем подсчет яиц и размер расплода в качестве надежного и недорогого метода измерения репродуктивного здоровья с оговоркой, что репродуктивное здоровье может не коррелировать с долголетием или продолжительностью здоровья.
Наконец, анализы выживания предлагаются в качестве косвенной меры здоровья организма. Важно отметить, что клеточные стрессовые реакции, включая реакцию на тепловой стресс69 и стресс ER35, быстро снижаются во время процесса старения и имеют прямое отношение к отличительной черте старения протеостаза70,71. Напротив, гиперактивирующие стрессовые реакции могут значительно увеличить продолжительность жизни, повышая устойчивость к стрессу 35,37,38. В то время как это исследование фокусируется на самых простых и дешевых методах, существует большое количество альтернативных методов анализа стрессоустойчивости для термотолерантности41 и окислительного стресса66, каждый из которых требует различного набора оборудования и расходных материалов. Помимо простых исследований воздействия стрессоров, другие физиологические методы могут быть выполнены в зависимости от доступа к оборудованию. Например, внеклеточный анализатор потока может контролировать функцию митохондрий и клеточное дыхание73; флуоресцентные рассеченные микроскопы позволят измерять транскрипционные репортеры для активации реакции на стресс20; и компаундные или конфокальные микроскопы высокого разрешения могут быть использованы для измерения морфологии органелл с флуоресцентными зондами для митохондрий74, эндоплазматического ретикулума 75,76 и актинового цитоскелета77.
В качестве последнего предостережения для измерений долголетия, в то время как химические и генетические методы стерилизации червей предлагаются для значительного снижения стоимости, важно отметить, что оба могут напрямую влиять на продолжительность жизни. Например, ранее сообщалось, что воздействие FUDR влияет как на продолжительность жизни, так и на термотолерантность45. И хотя сам мутант glp-4(bn2) не оказывает прямого влияния на продолжительность жизни, рост при 25 °C является умеренным тепловым стрессом33,34 и, таким образом, может повлиять на продолжительность жизни2. Существуют и другие методы стерилизации C. elegans, включая ауксин-опосредованную стерильность78 или альтернативные чувствительные к температуре мутанты с дефицитом сперматозоидов79. Тем не менее, все методы имеют некоторые предостережения, и следует позаботиться о том, чтобы использовать наименее вредный анализ для научных потребностей каждой лаборатории. Одним из последних ограничений исследований долголетия является потенциальная изменчивость, которая может возникнуть из-за низких размеров выборки или просто из-за объективной ошибки исследователя. Это можно обойти, поскольку новые технологии рождаются в автоматизированных технологиях продолжительности жизни80, но опять же эти системы являются дорогостоящими и требуют некоторого инженерного и вычислительного оборудования и навыков. В конечном счете, коллекция методов, представленная здесь, представляет собой надежный набор инструментов, которые могут быть быстро адаптированы и изучены практически в любом учреждении и обеспечивают прочную основу для биологии старения.

Со времени публикации «Генетики Caenorhabditis elegans», одной из самых влиятельных статей Сиднея Бреннера в 1974 году, этот микроскопический червь считался выдающейся модельной системой для изучения биологических тайн1. В 1977 году Майкл Р. Класс опубликовал метод измерения продолжительности жизни C. elegans и создал эту модельную систему для изучения старения2. Исследование, чтобы понять связь между стрессом и долголетием, началось с идентификации одной мутации в гене age-1, что привело к увеличению продолжительности жизни у C. elegans3. Кроме того, современные исследования выявили другие мутации, увеличивающие продолжительность жизни, которые выявили долгоживущих мутантных червей, которые проявляют повышенную устойчивость к стрессу 4,5,6. Благодаря своим многочисленным преимуществам, включая короткую продолжительность жизни, простоту обслуживания, полностью секвенированный геном, содержащий гомологию примерно для двух третей всех болезнетворных генов человека, доступность и простоту использования библиотек РНК-интерференции (РНКи) и физиологическое сходство с людьми 7,8,9, C. elegans быстро был принят в качестве выдающейся модели для биологии стресса и старения.
Возможно, самыми большими преимуществами C. elegans являются его чрезвычайно низкая стоимость обслуживания, простота экспериментов и разнообразие генетических инструментов, доступных для исследований. C. elegans обычно выращивают на твердой агаровой среде с пищевым источником E. coli. Двумя широко используемыми штаммами E. coli являются стандартный OP50, штамм B, который, пожалуй, является наиболее часто используемым10, и HT115, штамм K-12, который используется в основном для экспериментов RNAi11,12. Штамм HT115 K-12 несет делецию в RNAIII RNase, мутацию, которая необходима для методов RNAi, где используются плазмиды, экспрессирующие дцРНК, соответствующие отдельным генам C. elegans. Питающие векторы дцРНК позволяют надежно нокдаунировать гены C. elegans без необходимости сложных скрещиваний или редактирования генома, поскольку бактерии, несущие эти плазмиды, могут напрямую питаться нематодам. Тысячи из этих бактериальных векторов РНКи существуют на фоне HT115, в том числе самая популярная библиотека РНКи Видаля с >19 000 отдельных РНКи конструирует13 и библиотека РНКИ Арингера с 16 757 РНКи конструирует14. Тем не менее, бактериальные диеты OP50 и HT115 имеют значительные различия в метаболическом профиле, включая различия в витамине B1215,16. Поэтому рекомендуется проводить все эксперименты на одном источнике бактерий, если это возможно, чтобы избежать взаимодействия генов и диеты, которые могут вводить несколько смешанных факторов, как описано ранее 17,18,19. Из-за своей легкости животные содержатся на OP50 для всех экспериментальных условий, описанных здесь, но все эксперименты проводятся на HT115, как описано ранее20. Вкратце, животных поддерживают на уровне OP50 и переводят в HT115 после синхронизации (после отбеливания) для согласованности между RNAi и экспериментами без RNAi. Альтернативно, также может быть использован РНAi-компетентный штамм OP50, несущий аналогичную делецию RNAIII РНКазы, обнаруженной в штамме E. coli K12HT115.
Возможно, одним из основных ограничений экспериментов RNAi у C. elegans является проблема эффективности нокдауна. В то время как эффективность нокдауна может быть проверена с помощью qPCR или западного блоттинга, они требуют дорогостоящего оборудования и реагентов и ограничены объемным анализом. Это еще больше беспокоит, глядя на конкретные клетки, такие как нейроны, которые являются рефрактерными (менее чувствительными) к РНК. В то время как эффективность РНКи в конкретных клетках может быть повышена за счет сверхэкспрессии SID-1, трансмембранного белка, необходимого для поглощения дцРНК22, это по-прежнему ограничено специфическими для типа клеток паттернами экспрессии промоторов, используемых для этих конструкций, и, таким образом, нокауты и мутации генов являются наиболее надежными средствами истощения функций генов. Помимо РНКи-опосредованного нокдауна, C. elegans также очень поддаются редактированию генома с помощью стратегий на основе CRISPR 23,24,25 и трансгенной гиперэкспрессии конструкций через микроинъекции, с возможностью интеграции трансгенных конструкций посредством облучения или интеграции на основе транспозонов 26,27,28,29 . Однако эти методы требуют дорогостоящего микроинъекционного оборудования, а высокая стоимость направляющих РНК или фермента Cas9 может запретить эти методы в учреждениях с ограниченным финансированием. Вместо этого тысячи трансгенных линий и мутантов легко доступны за несколько долларов как в Центре генетики Кенорхабдита (CGC), так и в Национальном проекте биоресурсов (NBRP). NBRP предлагает изолированные мутанты для большого количества генов C. elegans, включая опубликованные и, следовательно, проверенные мутантные штаммы, мутанты, полученные из пилотных проектов, и мутанты, которые еще предстоит охарактеризовать. Напротив, CGC является хранилищем в основном опубликованных и установленных линий C. elegans из исследовательского сообщества. Оба они поставляют штаммы по всему миру по очень разумным ценам и предлагают широкий спектр вариантов для тех, у кого ограниченные возможности синтезировать штаммы собственными силами.
Здесь предлагается кураторская коллекция методов, которые, вероятно, будут самыми дешевыми методами анализа продолжительности жизни и продолжительности здоровья у C. elegans. Все методы, представленные здесь, требуют недорогого оборудования и расходных материалов и используют только штаммы, легко доступные из CGC. Возможно, наиболее непомерно высоким для анализов долголетия и выживания у C. elegans является стоимость пластин Nematode Growth Media (NGM). Поскольку C. elegans являются гермафродитами и самооплодотворяются, стандартные анализы выживания требуют, чтобы взрослые животные постоянно удалялись от своего потомства, чтобы избежать загрязнения от потомства. Мало того, что этот процесс занимает много времени, он может стать дорогостоящим из-за необходимости примерно 100 пластин на условие для проведения одного анализа продолжительности жизни. Здесь представлены две альтернативы: использование мутанта без зародышевой линии, glp-4(bn2), или химическая стерилизация с использованием 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUDR). glp-4 кодирует валилоаминоацил-тРНК-синтетазу, а чувствительные к температуре glp-4(bn2) репродуктивно дефицитны при ограничительных температурах из-за снижения трансляции белка30,31. FUDR является надежным методом химической стерилизации C. elegans путем предотвращения репликации ДНК, тем самым ингибируя размножение32. Хотя FUDR может быть непомерно дорогим для некоторых лабораторий, для химической стерилизации червей требуется лишь небольшое количество, и его стабильность в виде порошка может сделать его осуществимым для большинства групп. Использование термочувствительного мутанта glp-4(bn2), безусловно, является самым дешевым вариантом, поскольку единственным требованием является инкубатор для перемещения животных на ограничительные 25 °C; однако следует отметить, что рост при 25 °C может вызвать умеренный тепловой стресс 33,34. Независимо от способа, использование стерильных животных может значительно снизить затраты на расходные материалы, необходимые для возрастных анализов.
Для изучения старения стандартные анализы продолжительности жизни являются обычными, поскольку парадигмы, которые изменяют долголетие, оказывают непосредственное влияние на старение. Тем не менее, измерения продолжительности здоровья и стрессоустойчивости предоставляют дополнительную информацию о здоровье организма. Здесь предлагается несколько методов измерения продолжительности здоровья: 1) плодовитость как мера репродуктивного здоровья; 2) размер расплода как мера здоровья развития и жизнеспособности заложенного потомства; и 3) двигательное поведение как мера мышечной функции и моторики, которые напрямую коррелируют со старением. Кроме того, предлагаются анализы стрессоустойчивости: выживание при стрессе ER, митохондриальный / окислительный стресс и выживание при тепловом стрессе. Действительно, животные с повышенной устойчивостью к стрессу ER35,36, митохондриальномустрессу 37 и тепловому стрессу38 демонстрируют увеличенную продолжительность жизни. Эр-стресс применяется путем воздействия C. elegans на туникамицин, который блокирует N-связанное гликозилирование и вызывает накопление неправильно свернутых белков39. Митохондриальный/окислительный стресс индуцируется воздействием параквата, который индуцирует образование супероксида, особенно в митохондриях40. Тепловой стресс применяется через инкубацию животных при 34-37 °C33,41. Все описанные здесь анализы могут быть выполнены с минимальным оборудованием и средствами, и предлагают различные инструменты для изучения старения в различных группах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

Открытие и развитие Caenorhabditis elegans как модельного организма оказало влияние на биологию, особенно в области старения. Многие исторические и современные исследования выявили тысячи парадигм, изменяющих продолжительность жизни, включая генетические мутации, трансгенную экспрессию генов и гормезис, полезное, низкосортное воздействие стресса. Благодаря своим многочисленным преимуществам, включая короткую продолжительность жизни, простое и недорогое обслуживание и полностью секвенированный геном с гомологией почти двух третей всех человеческих генов, C. elegans быстро был принят в качестве выдающейся модели для биологии стресса и старения. Здесь исследуется несколько стандартизированных методов измерения продолжительности жизни и здоровья, которые могут быть легко адаптированы практически в любой исследовательской среде, особенно с ограниченным оборудованием и средствами. Невероятная полезность C. elegans подчеркивает способность выполнять мощные генетические анализы в биологии старения без необходимости обширной инфраструктуры. Наконец, для рассмотрения обсуждаются ограничения каждого анализа и альтернативные подходы.

Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans служат отличной модельной системой с надежными и недорогими методами обследования продолжительности здоровья, продолжительности жизни и устойчивости к стрессу.

Исследование недорогих методов измерения продолжительности жизни и продолжительности здоровья у Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Этот протокол представляет собой самые дешевые и самые низкие технологические методы для обслуживания старения в морских элеганах. Влиятельный модельный организм в биологии старения. Наибольшим преимуществом этих методов является простота реализации, использование недорогого оборудования и материала.Делая их поддающимися любому исследователю, независимо от опыта или доступного финансирования. В старых исследованиях старения наблюдается естественная изменчивость здоровья в популяциях. Поэтому важно, чтобы эксперименты проводились на здоровых, хорошо сытых и плотно синхронизированных животных.Для обеспечения нарушения разрыва начните приготовление одной литровой среды роста нематоды или шнековой пластины NGM. Добавьте 2,5 грамма пеп-тонуса, 3,0 грамма хлорида натрия и 20 грамм шнека в литровую колбу с перемешивающим батончиком и добавьте дистиллированную воду до конечного объема 970 миллилитров. Стерилизуйте раствор шнека NGM в литровой колбе с помощью стандартного автоклава или стерилизатора среды.И дайте раствору перемешаться, пока он не остынет до 60-75 градусов цельсия. Пока раствор остынет, нагрейте бисерную ванну до 65-70 градусов по Цельсию. После этого шнековый раствор NGM охлаждается до 60-75 градусов цельсия.Добавьте жидкие добавки и дайте раствору полностью перемешаться в течение пяти минут. Затем погрузите колбу в бисериновую ванну при температуре от 65 до 70 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевание среды при заливке в тарелку. Пипетка от девяти до 11 миллилитров раствора в каждую 60-миллилитровую пластину.Когда все будет готово, поместите пипетку обратно в нагретый раствор, чтобы поддерживать температуру и предотвратить затвердевание любых сред в пипетке. Повторите процедуру для всех пластин и дайте пластинам NGM затвердеть в течение ночи. После затвердевания используйте их для посева пластин с бактериями или храните пластины в герметичных контейнерах до трех месяцев при четырех градусах Цельсия, чтобы синхронизировать червей с помощью отбеливания.Соберите нематод, вылив небольшое количество раствора M9 на тарелку, содержащую червей, не переполняя чашку Петри. Затем осторожно закрутите раствор М девять, чтобы ослабить червей с бактериальных газонов. Затем соберите взрослых гравидных червей в 15-миллилитровую трубку с серологической пипеткой.Избегайте прокалывания шнека наконечником пипетки. Гранулируйте животных центром в течение 30 секунд при 1100 G и аспирируйте супернатант. Добавьте пять миллилитров свежеприготовленного отбеливающего раствора в гранулу червя и проверяйте червей под рассекающим микроскопом каждые несколько минут вместе с прерывистым энергичным встряхиванием, пока все тела взрослых червей не растворятся и в смеси не останутся только яйца.Затем гранулируйте яйца, вращая смесь яичного отбеливателя в течение 30 секунд при 1100 g и аспирируйте отбеливающий раствор. Затем промыть гранулированные яйца, добавив до 15 миллилитров раствора М9 и перевернув трубку четыре или пять раз, чтобы диспергировать яйца и раствор. Опять же, центрифугируйте трубку в течение 30 секунд при 1100 G, чтобы гранулировать яйца и аспирировать раствор M9.Выполните промывку четыре раза, чтобы исключить любой отбеливатель из яичной смеси. После четвертой промывки центрифузии аспирируют раствор М9 от 100 микролитров до двух миллилитров в зависимости от общего количества отбеливаемых червей. Тщательно встряхните яйца, чтобы разбить комочки и убедиться, что яйца полностью повторно суспендированы в растворе M9.Альтернативно, животные могут быть арестованы для более плотной временной синхронизации путем добавления от 10 до 12 миллилитров раствора M9 к грануле яйца в 15-миллилитровой летописной трубке. Позвольте червям вращаться в ротаторе до 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Для аппроксимации яйца или L одной концентрации пипетки четыре микролитра яичной смеси на пластину NGM, сидящую с бактериями.Затем подсчитайте и рассчитайте яйца, присутствующие на микролитр среды. Повторите подсчет три или четыре раза, чтобы улучшить приближение, исходя из аппроксимационной пластины, соответствующего количества яиц или L одного арестованного животного на шнековой пластине NGM, засеянной бактериями по выбору. Измерить поведение локомотива червей с помощью трэшинга.Переместите небольшое количество взрослых червей с шнековой пластины NGM на 10-20 микролитров раствора M9 под рассекающим прицелом. Затем сосредоточьтесь на одном черве за раз и подсчитайте, сколько раз образец переключается с вогнутого на выпуклое образование за 15 секунд. Используйте счетчик рук и таймер и повторите процедуру для 10-15 червей.Старейте червей до желаемого возраста и повторяйте измерения во всех желаемых возрастах. Как визуализируется, старые черви мечутся со значительно более медленными скоростями. Для измерения количества и фертильности.Из 10-15 червей Caenorhabditis elegans выделяют L четыре червя в отдельную шнековую пластину NGM, засеянную бактериями выбора. Дайте животным расти ночью при температуре 20 градусов по Цельсию и убедитесь, что недавно посеянная партия тарелок готова к следующему дню. Чтобы измерить количество яиц, отложенных Caenorhabditis elegans, переносят взрослых червей в свежую шнековую лопатку NGM, засеянную этими награбленными бактериями, каждые 12-24 часа в течение семи-восьми дней или до тех пор, пока яйца больше не будут видны, и подсчитайте количество яиц, отложенных на пластинах.Чтобы измерить размер расплода Caenorhabditis elegans, переносите взрослых червей на свежую шнековую пластину NGM, засеянную бактериями каждые 12-24 часа, или семь-восемь дней, или до тех пор, пока потомство больше не будет видно. Держите все тарелки, содержащие яйца, при температуре 20 градусов по Цельсию. Через два дня после переноса глистов.Подсчитайте развитое потомство на тарелке. Подсчитайте всех живых и развивающихся червей на стадии L four или ранее, чтобы убедиться, что F два поколения не путают результаты. Удалите всех червей с тарелки по мере их подсчета.Поддерживайте пластины в течение дополнительного одного-двух дней, прежде чем забить их снова, чтобы гарантировать, что любые животные с задержкой вылупления или развития не будут пропущены. Влияние метода стерилизации на продолжительность жизни диких нематод типа N2 показало, что изменения в продолжительности жизни червей, выращенных на шнековых пластинах NGM, были аналогичны изменениям в продолжительности жизни червей, выращенных на пластинах шнека FDR NGM или мутантных животных glp four BN2, выращенных на шнековых пластинах NGM. Недолговечное животное HSF one knockdown показало значительное снижение продолжительности жизни при всех условиях.Существенное снижение количества отложенных яиц и размера расплода было обнаружено у HSF над экспрессивными животными по сравнению с контролем дикого типа. Некоторые животные СНВ продемонстрировали полную стерильность, что указывает на то, что репродуктивное здоровье может быть обратно коррелировано с долголетием. Скорость метания обеспечила надежный метод измерения здоровья во время старения, измеряемый значительным снижением трэшинга у старых животных по сравнению с молодыми.Выживаемость в стрессе является надежным анализом для измерения здоровья организма, туникамицин, который вызывает стресс ретикулума, привел к сокращению продолжительности жизни независимо от концентрации по сравнению с контролем ДМСО. Высокие уровни параквата значительно сократили продолжительность жизни, в то время как низкие концентрации параквата увеличили продолжительность жизни из-за горметического эффекта. В анализах термотолерантности повышенная экспрессия HSF один увеличила термодвижимость на 37 градусов Цельсия Для всех экспериментов по продолжительности жизни и старению.Важно помнить, что методы стерилизации могут оказывать плейотропное воздействие на здоровье организма, что влияет на результаты. Существует множество дополнительных и дополнительных подходов к измерению продолжительности здоровья при наличии оборудования и инфраструктуры, включая измерения транскрипции, агрегации трансляционного белка, органелл, морфологии и метаболических функций.

Research

JoVE Journal

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Конструкция и использование низкой стоимости, Автоматизированная Morbidostat для адаптивной эволюции бактерий в Антибиотик Выбор лекарственных средств

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Культура и анализ крупномасштабных смешанных популяций Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Измерение Caenorhabditis elegans Чувствительность к агонисту рецепторов ацетилхолина Левамизол

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Измерение эмбриональной жизнеспособности и размера расплода у Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Анализ трансгенерационного эпигенетического наследования C. elegans с использованием флуоресцентного репортера и хроматиновой иммунопреципитации (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...