Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
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G.G. es compatible con T32AG052374 y R.H.S. es compatible con R00AG065200 del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Agradecemos al CGC (financiado por la Oficina de Investigación del Programa de Infraestructura de Investigación P40 OD010440 de los NIH) por las cepas.

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

La esperanza de vida, definida más simplemente como la duración de la vida, es un fenómeno binario claro en la mayoría de los organismos: ya sea que un organismo esté vivo o no lo esté. Sin embargo, la longevidad no siempre se correlaciona con la salud de un organismo. Por ejemplo, los modelos de hormesis mitocondrial donde la exposición al estrés mitocondrial aumenta dramáticamente la vida útil son generalmente algunos de los animales más longevos, sin embargo, exhiben retraso en el crecimiento y disminución de la función metabólica37,54. Del mismo modo, los animales con respuestas de estrés del retículo endoplásmico hiperactivo también exhiben ciertos comportamientos y fenotipos que pueden correlacionarse con una disminución de la salud, a pesar de haber mejorado drásticamente la homeostasis de las proteínas y la vida útil36,49. Finalmente, muchos paradigmas de longevidad en organismos modelo, incluido el aumento de la función HSF-155, el aumento de la función XBP-156 y la señalización alterada de FoxO57, se correlacionan con un mayor riesgo de cáncer, y es indiscutible que la vida útil prolongada no es beneficiosa si un organismo está en una lucha constante contra el cáncer y otras enfermedades de salud. Por lo tanto, la longevidad no puede ser una medida independiente en la biología del envejecimiento.
Por lo tanto, el concepto de healthspan ha sido un campo creciente en la biología del envejecimiento. Healthspan, definido vagamente como el período de la vida en el que uno está sano, es más difícil de determinar que la longevidad. Sin embargo, a diferencia de la longevidad, el concepto de "salud" es complicado, ya que hay muchas lecturas diferentes a la salud del organismo: a nivel del organismo, hay función / fuerza muscular, función neuronal / cognitiva, salud reproductiva, etc.; a nivel celular hay homeostasis proteica, homeostasis lipídica, homeostasis de glucosa, metabolismo, etc. En 2014, los biólogos del envejecimiento han caracterizado definitivamente las características biológicas del envejecimiento con la definición estructurada de que debe ser algo que se descompone naturalmente durante el envejecimiento y puede alterarse experimentalmente de tal manera que la exacerbación experimental debería acelerar el envejecimiento y la intervención experimental debería retrasar el envejecimiento. Estas nueve características del envejecimiento incluyen inestabilidad genómica, desgaste de los telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de homeostasis de proteínas (proteostasis), agotamiento de células madre, señalización intercelular alterada, disfunción mitocondrial, detección desregulada de nutrientes y senescencia celular58. Desde entonces, numerosos estudios argumentan que se deben incluir otros factores, incluidas las proteínas extracelulares y la fisiología sistémica como la inmunidad y la inflamación59. En última instancia, la compleja definición de healthspan exige que la salud de los organismos se mida utilizando múltiples métodos diferentes.
Por lo tanto, en este manuscrito, se presentan múltiples métodos para medir diversos aspectos de la salud utilizando el modelo de nematodos, C. elegans. Evaluamos el comportamiento locomotor utilizando ensayos de golpeo, la salud reproductiva utilizando el recuento de huevos y el tamaño de la cría, y la sensibilidad al estrés. De hecho, el comportamiento locomotor es un método estándar de oro para medir la salud, ya que los organismos exhiben una pérdida significativa de motilidad y movimiento durante el envejecimiento51. La pérdida del comportamiento locomotor puede atribuirse a múltiples características del envejecimiento, ya que la función muscular en C. elegans depende de la proteostasis adecuada60, la disfunción mitocondrial61 y la señalización neuron-muscular62. Si bien este manuscrito se centra en una medición del comportamiento locomotor, es importante tener en cuenta que existen muchos otros métodos, incluida la motilidad de los animales en una placa de agar sólido, la respuesta al tacto51 y los ensayos de quimiotaxis63. Sin embargo, estos métodos generalmente requieren dispositivos de grabación más sofisticados, el uso de software de seguimiento de gusanos o el uso de productos químicos caros, peligrosos o volátiles, todo lo cual puede ser prohibitivo en algunos entornos de investigación.
Además, los ensayos para el recuento de huevos y el tamaño de la cría se presentan como un método para medir la salud reproductiva y como el método más simple para medir la división celular en gusanos adultos, ya que los gusanos adultos son postmitóticos y solo las células germinales y los embriones se someten a la división celular dentro de un gusano adulto64. Como medida de la división celular, la salud reproductiva puede ser relevante para las características del envejecimiento de la senescencia celular y el agotamiento de las células madre. La salud reproductiva puede verse afectada por muchos factores, incluida la infección patógena65 o la exposición al estrés49, aunque no existe una correlación directa entre la salud reproductiva y la longevidad. De hecho, algunos animales longevos exhiben una disminución significativa en el tamaño de la cría49, e incluso es posible que exista una correlación inversa entre la longevidad y el tamaño de la cría50. Este no es un fenómeno específico de C. elegans, ya que los efectos perjudiciales de la reproducción sobre la longevidad se han observado durante mucho tiempo en humanos66, perros de compañía67 y ratones68. Aún así, proporcionamos el recuento de huevos y el tamaño de la cría como un método confiable y de bajo costo para medir la salud reproductiva con la advertencia de que la salud reproductiva puede no correlacionarse con la longevidad o la duración de la salud.
Finalmente, los ensayos de supervivencia se ofrecen como una medida indirecta de la salud del organismo. Es importante destacar que las respuestas al estrés celular, incluida la respuesta al estrés térmico69 y al estrés ER35, disminuyen rápidamente durante el proceso de envejecimiento y tienen una relevancia directa con el sello de envejecimiento de la proteostasis70,71. Por el contrario, las respuestas de estrés hiperactivantes pueden aumentar significativamente la esperanza de vida al promover la resiliencia al estrés 35,37,38. Si bien este estudio se centra en los métodos más simples y de menor costo, existe un gran número de métodos alternativos para los ensayos de resiliencia al estrés para la termotolerancia41 y el estrés oxidativo66, cada uno de los cuales requiere un conjunto diferente de equipos y consumibles. Más allá de los simples estudios de exposición a factores estresantes, se pueden realizar otros métodos fisiológicos dependiendo del acceso al equipo. Por ejemplo, un analizador de flujo extracelular puede monitorear la función mitocondrial y la respiración celular73; los microscopios de disección fluorescentes permitirán mediciones de reporteros transcripcionales para la activación de la respuesta al estrés20; y se pueden utilizar microscopios compuestos o confocales de alta resolución para medir la morfología de los orgánulos con sondas fluorescentes para las mitocondrias74, el retículo endoplásmico75,76 y el citoesqueleto de actina77.
Como una advertencia final para las mediciones de la longevidad, si bien se ofrecen métodos químicos y genéticos para esterilizar gusanos para disminuir significativamente el costo, es importante tener en cuenta que ambos pueden afectar directamente la vida útil. Por ejemplo, se ha informado previamente que la exposición a FUDR afecta tanto la vida útil como la termotolerancia45. Y mientras que el mutante glp-4 (bn2) en sí mismo no tiene ningún efecto directo sobre la vida útil, el crecimiento a 25 ° C es un estrés por calor leve33,34 y, por lo tanto, puede afectar la vida útil2. Existen otros métodos para esterilizar C. elegans, incluida la esterilidad mediada por auxina78 o mutantes alternativos con deficiencia de espermatozoides sensibles a la temperatura79. Sin embargo, todos los métodos tienen algunas advertencias, y se debe tener cuidado de utilizar el ensayo menos perjudicial para las necesidades científicas de cada laboratorio. Una limitación final de los estudios de longevidad es la variabilidad potencial que puede ocurrir debido a los bajos tamaños de la muestra o simplemente por un error objetivo del investigador. Esto se puede eludir a medida que nacen nuevas tecnologías en tecnologías de vida útilautomatizadas 80, pero nuevamente estos sistemas son costosos y requieren algunos equipos y habilidades de ingeniería y computacionales. En última instancia, la colección de métodos proporcionados aquí es un conjunto confiable de herramientas que se pueden adaptar y aprender rápidamente en casi cualquier institución y proporcionar una base sólida para la biología del envejecimiento.

Desde el momento de la publicación de 'La genética de Caenorhabditis elegans', uno de los artículos más influyentes de Sydney Brenner en 1974, este gusano microscópico ha sido considerado un sistema modelo sobresaliente para estudiar misterios biológicos1. En 1977, Michael R. Klass publicó el método para medir la vida útil de C. elegans y estableció este sistema modelo para estudiar el envejecimiento2. La investigación para comprender la relación entre el estrés y la longevidad ha comenzado con la identificación de una sola mutación en el gen age-1, lo que resultó en una extensión de la vida útil en C. elegans3. Además, estudios contemporáneos han identificado otras mutaciones que aumentan la esperanza de vida, que revelaron gusanos mutantes de larga vida que exhiben una mayor resistencia al estrés 4,5,6. Con sus muchas ventajas, incluida una vida útil corta, fácil mantenimiento, genoma completamente secuenciado que contiene homología de aproximadamente dos tercios de todos los genes que causan enfermedades humanas, disponibilidad y facilidad de uso de bibliotecas de interferencia de ARN (ARNi) y similitud fisiológica con humanos 7,8,9, C. elegans se ha adoptado rápidamente como un modelo sobresaliente para la biología del estrés y el envejecimiento.
Quizás las mayores utilidades de C. elegans son su costo extremadamente bajo de mantenimiento, la facilidad de experimentación y la variedad de herramientas genéticas disponibles para los estudios. C. elegans se cultiva típicamente en un medio de agar sólido con una fuente de alimento de E. coli. Dos cepas de E. coli de uso común son OP50 estándar, una cepa B que es quizás la10 más utilizada, y HT115, una cepa K-12 que se usa principalmente para experimentos de ARNi11,12. La cepa HT115 K-12 lleva una deleción en RNAIII RNasa, una mutación que es esencial para los métodos de ARNi, donde se utilizan plásmidos que expresan dsRNA correspondiente a genes individuales de C. elegans. Los vectores de alimentación de dsRNA permiten un derribo robusto de genes de C. elegans sin la necesidad de cruces complejos o edición del genoma, ya que las bacterias que transportan estos plásmidos pueden ser alimentadas directamente a los nematodos. Miles de estos vectores de ARNi bacteriano existen en el fondo de HT115, incluida la biblioteca de ARNi de Vidal más popular con >19,000 construcciones de ARNi individuales13 y la biblioteca de ARNi de Ahringer con 16,757 construcciones de ARNi14. Sin embargo, las dietas bacterianas OP50 y HT115 tienen grandes diferencias en el perfil metabólico, incluidas las diferencias en la vitamina B1215,16. Por lo tanto, se recomienda realizar todos los experimentos en una sola fuente de bacterias, si es posible, para evitar interacciones gen-dieta que puedan introducir múltiples factores de confusión como se describió anteriormente 17,18,19. Debido a su facilidad, los animales se mantienen en OP50 para todas las condiciones experimentales descritas aquí, pero todos los experimentos se realizan en HT115 como se describió anteriormente20. Brevemente, los animales se mantienen en OP50 y se transfieren a HT115 después de la sincronización (después del blanqueamiento) para la consistencia entre los experimentos de ARNi vs. no ARNi. Alternativamente, también se puede utilizar una cepa OP50 competente en ARNi que lleve una deleción similar de RNAIII RNasa que se encuentra en la cepa E. coli K12HT115 21.
Quizás una limitación importante de los experimentos de ARNi en C. elegans es la preocupación por la eficiencia de derribo. Si bien la eficiencia de derribo se puede validar a través de qPCR o western blotting, estos requieren equipos y reactivos costosos y se limitan al análisis a granel. Esto es aún más preocupante al observar células específicas, como las neuronas, que son refractarias (menos sensibles) al ARNi. Si bien la eficiencia del ARNi en células específicas se puede mejorar a través de la sobreexpresión de SID-1, la proteína transmembrana esencial para la absorción de dsRNA22, esto todavía se limita a los patrones de expresión específicos del tipo de célula de los promotores utilizados para estas construcciones, y por lo tanto los knockouts y mutaciones de genes son el medio más infalible de agotar las funciones del gen. Más allá del derribo mediado por RNAi, los C. elegans también son altamente susceptibles a la edición del genoma con estrategias basadas en CRISPR 23,24,25 y a la sobreexpresión de constructos transgénicos a través de microinyecciones, con la opción de integrar construcciones transgénicas a través de irradiación o integración basada en transposones 26,27,28,29 . Sin embargo, estos métodos requieren costosos equipos de microinyección, y el alto costo de los ARN guía o la enzima Cas9 puede prohibir estos métodos en instituciones con fondos limitados. En cambio, miles de líneas transgénicas y mutantes están disponibles por unos pocos dólares tanto en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) como en el Proyecto Nacional de Biorecursos (NBRP). El NBRP ofrece mutantes aislados para un gran número de genes de C. elegans, incluidas cepas mutantes publicadas y, por lo tanto, verificadas, mutantes derivados de proyectos piloto y mutantes que aún no se han caracterizado. En contraste, CGC es un depósito de líneas de C. elegans en su mayoría publicadas y establecidas de la comunidad investigadora. Ambos envían cepas a todo el mundo a precios muy razonables y ofrecen una amplia variedad de opciones para aquellos con capacidad limitada para sintetizar cepas internamente.
Aquí, se ofrece una colección de métodos curados, que probablemente sean los métodos de menor costo para evaluar la vida útil y la salud en C. elegans. Todos los métodos presentados aquí requieren equipos y suministros de bajo costo, y solo utilizan cepas fácilmente disponibles en el CGC. Quizás lo más prohibitivo para los ensayos de longevidad y supervivencia en C. elegans es el costo de las placas de nematodos growth media (NGM). Dado que C. elegans son hermafroditas y autofertilizados, los ensayos de supervivencia estándar requieren que los animales adultos se alejen continuamente de su progenie para evitar la contaminación de la descendencia. Este proceso no solo consume mucho tiempo, sino que puede llegar a ser costoso debido a la necesidad de aproximadamente 100 placas por condición para ejecutar un solo ensayo de vida útil. Aquí, se proporcionan dos alternativas: la utilización del mutante sensible a la temperatura sin germinación, glp-4 (bn2), o la esterilización química con 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR). glp-4 codifica una VALIL aminoacil ARNt sintetasa, y la glp-4(bn2) sensible a la temperatura es reproductivamente deficiente a temperaturas restrictivas debido a la disminución de la traducción de proteínas30,31. FUDR es un método robusto para esterilizar químicamente C. elegans previniendo la replicación del ADN, inhibiendo así la reproducción32. Aunque FUDR puede ser prohibitivamente caro para algunos laboratorios, solo se requiere una pequeña cantidad para esterilizar químicamente a los gusanos, y su estabilidad en forma de polvo puede hacerlo factible para la mayoría de los grupos. La utilización del mutante glp-4 (bn2) sensible a la temperatura es sin duda la opción más barata, ya que el único requisito es una incubadora para cambiar a los animales a los restrictivos 25 ° C; sin embargo, cabe señalar que el crecimiento a 25 °C puede causar estrés por calor leve33,34. Independientemente del método, el uso de animales estériles puede disminuir significativamente los costos de los consumibles necesarios para los ensayos relacionados con la edad.
Para estudiar el envejecimiento, los ensayos estándar de vida útil son convencionales, ya que los paradigmas que alteran la longevidad tienen un impacto directo en el envejecimiento. Sin embargo, las mediciones de la duración de la salud y la tolerancia al estrés presentan información adicional sobre la salud del organismo. Aquí, se ofrecen varios métodos para medir la salud: 1) fecundidad como medida de la salud reproductiva; 2) el tamaño de la cría como una medida de la salud del desarrollo y la viabilidad de la descendencia puesta; y 3) el comportamiento locomotor como una medida de la función muscular y la motilidad, los cuales están directamente correlacionados con el envejecimiento. Además, se ofrecen ensayos de tolerancia al estrés: supervivencia al estrés ER, estrés mitocondrial / oxidativo y supervivencia al estrés térmico. De hecho, los animales con mayor resistencia al estrés ER35,36, estrés mitocondrial37 y estrés térmico38 exhiben una mayor vida útil. El estrés ER se aplica exponiendo C. elegans a la tunicamicina, que bloquea la glicosilación ligada a N y causa la acumulación de proteínas mal plegadas39. El estrés mitocondrial/oxidativo es inducido por la exposición al paraquat, que induce la formación de superóxidos específicamente en las mitocondrias40. El estrés por calor se aplica a través de la incubación de animales a 34-37 °C33,41. Todos los ensayos descritos aquí se pueden realizar con equipos y fondos mínimos, y ofrecen una variedad de herramientas para estudiar el envejecimiento en diversos grupos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

El descubrimiento y desarrollo de Caenorhabditis elegans como organismo modelo fue influyente en la biología, particularmente en el campo del envejecimiento. Muchos estudios históricos y contemporáneos han identificado miles de paradigmas que alteran la esperanza de vida, incluidas las mutaciones genéticas, la expresión génica transgénica y la hormesis, una exposición beneficiosa y de bajo grado al estrés. Con sus muchas ventajas, incluida una vida útil corta, un mantenimiento fácil y de bajo costo, y un genoma completamente secuenciado con homología de casi dos tercios de todos los genes humanos, C. elegans se ha adoptado rápidamente como un modelo excepcional para la biología del estrés y el envejecimiento. Aquí, se estudian varios métodos estandarizados para medir la vida útil y la duración de la salud que se pueden adaptar fácilmente a casi cualquier entorno de investigación, especialmente aquellos con equipos y fondos limitados. Se destaca la increíble utilidad de C. elegans , destacando la capacidad de realizar potentes análisis genéticos en biología del envejecimiento sin la necesidad de una infraestructura extensa. Finalmente, las limitaciones de cada análisis y enfoques alternativos se discuten para su consideración.

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Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans sirve como un excelente sistema modelo con métodos robustos y de bajo costo para estudiar la duración de la salud, la vida útil y la resistencia al estrés.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Este protocolo presenta los métodos de menor costo y menor tecnología para servir el envejecimiento en elegans marinos. Un organismo modelo influyente en la biología del envejecimiento. La mayor ventaja de estos métodos es la facilidad de implementación, utilizando equipos y materiales de bajo costo.Haciéndolos susceptibles para cualquier investigador, independientemente de su experiencia o financiación disponible. Como un viejo estudio de envejecimiento hay variabilidad natural en la salud dentro de las poblaciones. Por lo tanto, es esencial que los experimentos se realicen en animales sanos, bien alimentados y estrechamente sincronizados.Para garantizar la discapacidad por rasgadura, comience la preparación de un medio de crecimiento de nematodos de un litro o una placa de barrena NGM. Agregue 2.5 gramos de tono pep, 3.0 gramos de cloruro de sodio y 20 gramos de barrena en un matraz de un litro con una barra de agitación y agregue agua destilada a un volumen final de 970 mililitros. Esterilizar la solución de sinfín NGM en un matraz de un litro utilizando un esterilizador de medios o autoclave estándar.Y deje que la solución se revuelva hasta que se enfríe a 60 a 75 grados centígrados. Mientras la solución se enfría, caliente un baño de cuentas a 65 a 70 grados centígrados. Una vez que la solución de barrena NGM se enfría a 60 a 75 grados centígrados.Agregue los aditivos líquidos y deje que la solución se mezcle completamente durante cinco minutos. Luego sumerja el matraz en un baño de cuentas a 65 a 70 grados centígrados para evitar que el medio se solidifique mientras se vierte en la placa. Pipete de nueve a 11 mililitros de la solución en cada placa de 60 mililitros.Cuando haya terminado, vuelva a colocar la pipeta en la solución calentada para mantener la temperatura y evitar que cualquier medio se solidifique en la pipeta. Repita el procedimiento para todas las placas y permita que las placas NGM se solidifiquen durante la noche. Una vez solidificados, utilícelos para sembrar placas con bacterias o almacene las placas en recipientes sellados hasta por tres meses a cuatro grados centígrados para sincronizar los gusanos a través del blanqueo.Recoja los nematodos vertiendo una pequeña cantidad de solución M9 en una placa que contenga los gusanos sin llenar demasiado la placa de Petri. Luego agite suavemente la solución M nueve para aflojar los gusanos de los céspedes bacterianos. A continuación, recoja los gusanos grávidos adultos en un tubo de 15 mililitros con una pipeta serológica.Evitar perforar la barrena con la punta de la pipeta. Pellet los animales por centr durante 30 segundos a 1100 veces G, y aspirar el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de la solución blanqueadora recién preparada a la bolita de gusano y verifique los gusanos bajo un microscopio de disección cada pocos minutos junto con una agitación vigorosa intermitente hasta que todos los cuerpos de gusanos adultos se disuelvan y solo queden huevos en la mezcla.A continuación, pellet los huevos girando la mezcla de blanqueador de huevo durante 30 segundos a 1100 veces G y aspirar la solución blanqueadora. Luego lave los huevos granulados agregando hasta 15 mililitros de solución M9 e invirtiendo el tubo cuatro o cinco veces para dispersar los huevos y la solución. Nuevamente, centrifugar el tubo durante 30 segundos a 1100 veces G para granular los huevos y aspirar la solución M9.Realice el lavado cuatro veces para eliminar cualquier blanqueador de la mezcla de huevo. Después del cuarto lavado, la centrifusión aspire la solución M9 de 100 microlitros a dos mililitros, dependiendo del número total de gusanos blanqueados. Agite bien los huevos para romper los grumos y asegúrese de que los huevos estén completamente resuspendidos en la solución M9.Alternativamente, los animales pueden ser detenidos para una sincronización temporal más estrecha agregando de 10 a 12 mililitros de solución M9 a la bolita de huevo en un tubo de crónica de 15 mililitros. Deje que los gusanos giren en un rotador durante un máximo de 24 horas a 20 grados centígrados. Para aproximar el huevo o L una concentración pipeta cuatro microlitros de la mezcla de huevo en una placa NGM asentada con bacterias.Luego cuente y calcule los huevos presentes por microlitro de medio. Repita el conteo tres o cuatro veces para mejorar la aproximación, basándose en la placa de aproximación, el número apropiado de huevos o L uno de animales detenidos en la placa de barrena NGM sembrada con bacterias de elección. Para medir el comportamiento locomotor de los gusanos a través de golpes.Mueva un pequeño número de gusanos adultos del día uno de una placa de barrena NGM a 10 a 20 microlitros de solución M9 bajo un endoscopio de disección. Luego concéntrese en un gusano a la vez y cuente el número de veces que la muestra cambia de una formación cóncava a una convexa en 15 segundos. Use un contador de manos y un temporizador y repita el procedimiento para 10 a 15 gusanos.Envejecer los gusanos a la edad deseada y repetir las mediciones de golpeo en todas las edades deseadas. Como se visualiza, los gusanos más viejos golpean a velocidades significativamente más lentas. Para mediciones de cantidad y fertilidad.En 10 a 15 gusanos Caenorhabditis elegans, seleccione L cuatro gusanos en una placa de barrena NGM separada sembrada con bacterias de elección. Permita que los animales crezcan durante la noche a 20 grados centígrados y asegúrese de que un lote de placas recién sembrado esté listo para el día siguiente. Para medir la cantidad de huevos puestos por Caenorhabditis elegans, transfiera los gusanos adultos a una hoja de barrena NGM fresca sembrada con esa bacteria saqueada cada 12 a 24 horas durante siete a ocho días o hasta que los huevos ya no sean visibles y cuente el número de huevos puestos en las placas.Para medir el tamaño de la cría de Caenorhabditis elegans Transfiera los gusanos adultos a una placa de barrena NGM fresca sembrada con bacterias cada 12 a 24 horas, o de siete a ocho días o hasta que la progenie ya no sea visible. Mantenga todos los platos que contienen huevos a 20 grados centígrados. Dos días después de transferir los gusanos.Cuenta la progenie desarrollada en el plato. Cuente todos los gusanos vivos y en desarrollo en la etapa L cuatro o antes para asegurarse de que la generación F dos no confunda los resultados. Retire todos los gusanos del plato a medida que se cuentan.Mantenga las placas durante uno o dos días adicionales antes de volver a marcarlas para asegurarse de que no se pierda ningún animal con retraso en la eclosión o el desarrollo. El efecto del método de esterilización en la esperanza de vida de los nematodos salvajes de tipo N2 mostró que los cambios en la vida útil de los gusanos cultivados en las placas de barrena NGM fueron similares a los de los gusanos cultivados en las placas FUDR de barrena NGM o los cuatro animales mutantes BN2 de glp cultivados en las placas de barrena NGM. El animal de corta duración HSF One knockdown mostró una disminución significativa en la vida útil de todas las condiciones.Se encontró una disminución sustancial en el número de huevos puestos y el tamaño de la cría en el HSF uno sobre los animales de expresión en comparación con los controles de tipo salvaje. Algunos animales HSF uno sobre expresión exhibieron esterilidad total, lo que indica que la salud reproductiva puede correlacionarse inversamente con la longevidad. La tasa de golpes proporcionó un método confiable para medir la salud durante el envejecimiento, medido por una disminución significativa en la paliza en animales viejos en comparación con los jóvenes.La supervivencia al estrés son ensayos confiables para medir la salud del organismo, la tunicamicina que causa estrés del retículo resultó en una vida útil reducida independientemente de la concentración en comparación con el control de DMSO. Los altos niveles de paraquat acortaron significativamente la vida útil, mientras que las bajas concentraciones de paraquat aumentaron la vida útil debido al efecto hormético. En los ensayos de tolerancia térmica, la sobreexpresión de HSF uno aumentó la tolerancia térmica a 37 grados centígrados para todos los experimentos de vida útil y envejecimiento.Es importante recordar que las técnicas de esterilización pueden tener un efecto pleiotrópico en la salud del organismo, lo que afecta los resultados. Existen muchos enfoques adicionales y complementarios para medir la duración de la salud si se dispone de equipos e infraestructura, incluidas las mediciones de transcripción, agregación de proteínas de traducción, orgánulos, morfología y funciones metabólicas.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

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Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Medición de la sensibilidad de Caenorhabditis elegans al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...