Name: surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

G.G. T32AG052374 tarafından desteklenmektedir ve R.H.S. Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden R00AG065200 tarafından desteklenmektedir. CGC'ye (NIH Araştırma Altyapısı Programı P40 OD010440 tarafından finanse edilen) suşlar için teşekkür ederiz.

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

En basit şekilde yaşam süresi olarak tanımlanan yaşam süresi, çoğu organizmada açık bir ikili fenomendir - bir organizma yaşıyor ya da yaşamıyor. Bununla birlikte, uzun ömürlülük her zaman bir organizmanın sağlığı ile ilişkili değildir. Örneğin, mitokondriyal strese maruz kalmanın ömrünü önemli ölçüde artırdığı mitokondriyal hormez modelleri genellikle en uzun ömürlü hayvanlardan bazılarıdır, ancak bodur büyüme ve azalmış metabolik fonksiyon sergiler37,54. Benzer şekilde, hiperaktif endoplazmik retikulum stres yanıtı olan hayvanlar, protein homeostazını ve ömrünü önemli ölçüde iyileştirmiş olmalarına rağmen, azalmış sağlıkla ilişkili olabilecek belirli davranışlar ve fenotipler sergilerler 36,49. Son olarak, model organizmalarda artan HSF-1 fonksiyonu55, artmış XBP-1 fonksiyonu 56 ve değiştirilmiş FoxO sinyal57 dahil olmak üzere birçok uzun ömür paradigması, artan kanser riski ile ilişkilidir ve bir organizma kanser ve diğer sağlık hastalıkları ile sürekli bir mücadele içindeyse, uzun ömrün yararlı olmadığı tartışılmazdır. Bu nedenle, uzun ömürlülük yaşlanma biyolojisinde bağımsız bir ölçüm olamaz.
Bu nedenle, sağlık süresi kavramı yaşlanma biyolojisinde büyüyen bir alan olmuştur. Gevşek bir şekilde kişinin sağlıklı olduğu yaşam süresi olarak tanımlanan sağlık süresi, uzun ömürlülükten daha zordur. Bununla birlikte, uzun ömürlülüğün aksine, organizma sağlığına birçok farklı okuma olduğu için "sağlık" kavramı karmaşıktır: organizma düzeyinde, kas fonksiyonu / gücü, nöronal / bilişsel işlev, üreme sağlığı vb. Vardır; hücresel düzeyde protein homeostazı, lipid homeostazı, glikoz homeostazı, metabolizma vb. Vardır. 2014 yılında, yaşlanan biyologlar, yaşlanmanın biyolojik özelliklerini, yaşlanma sırasında doğal olarak parçalanan ve deneysel alevlenmenin yaşlanmayı hızlandırması ve deneysel müdahalenin yaşlanmayı yavaşlatması gerektiği şekilde deneysel olarak değiştirilebilecek bir şey olması gerektiği yapılandırılmış tanımıyla kesin olarak karakterize etmişlerdir. Yaşlanmanın bu dokuz ayırt edici özelliği arasında genomik instabilite, telomer yıpranması, epigenetik değişiklikler, protein homeostazı kaybı (proteostaz), kök hücre tükenmesi, değişmiş hücreler arası sinyalleşme, mitokondriyal disfonksiyon, deregüle besin algısı ve hücresel yaşlanma58 sayılabilir. O zamandan beri, çok sayıda çalışma, hücre dışı proteinler ve bağışıklık ve inflamasyon gibi sistemik fizyoloji de dahil olmak üzere diğer faktörlerin dahil edilmesi gerektiğini savunuyor59. Nihayetinde, healthspan'ın karmaşık tanımı, organizma sağlığının birden fazla farklı yöntem kullanılarak ölçülmesini zorunlu kılar.
Bu nedenle, bu makalede, nematod modeli C. elegans kullanılarak sağlığın çeşitli yönlerini ölçmek için birçok yöntem sunulmuştur. Lokomotor davranışlarını ezme tahlilleri, yumurta sayısı ve yavru büyüklüğünü kullanarak üreme sağlığını ve strese duyarlılığı test ediyoruz. Gerçekten de, lokomotor davranışı, organizmalar51 yaşlılık sırasında önemli hareketlilik ve hareket kaybı sergilediğinden, sağlık süresini ölçmek için altın standart bir yöntemdir. Lokomotor davranış kaybı, yaşlanmanın birçok ayırt edici özelliğine atfedilebilir, çünkü C. elegans'taki kas fonksiyonu uygun proteostaz60, mitokondriyal disfonksiyon61 ve nöron-kas sinyalizasyonu62'ye bağlıdır. Bu makale lokomotor davranışın bir ölçümüne odaklanırken, katı bir agar plakası üzerindeki hayvanların hareketliliği, dokunma51'e yanıt ve kemotaksis tahlilleri63 dahil olmak üzere birçok başka yöntemin var olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle daha karmaşık kayıt cihazları, solucan izleme yazılımının kullanımı veya pahalı, tehlikeli veya uçucu kimyasalların kullanılmasını gerektirir ve bunların hepsi bazı araştırma ortamlarında engelleyici olabilir.
Ek olarak, yumurta sayısı ve yavru büyüklüğü için yapılan tahliller, üreme sağlığını ölçmenin bir yöntemi ve yetişkin solucanlarda hücre bölünmesini ölçmek için en basit yöntem olarak sunulmaktadır, çünkü yetişkin solucanlar post-mitotiktir ve sadece germ hücreleri ve embriyolar yetişkin bir solucan içinde hücre bölünmesine uğrar64. Hücre bölünmesinin bir ölçüsü olarak, üreme sağlığı, hücresel yaşlanma ve kök hücre tükenmesinin yaşlanma özellikleri ile ilgili olabilir. Üreme sağlığı, patojenik enfeksiyon65 veya strese maruz kalma49 dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenebilir, ancak üreme sağlığı ile uzun ömürlülük arasında doğrudan bir ilişki yoktur. Aslında, bazı uzun ömürlü hayvanlar yavru büyüklüğü49'da önemli bir düşüş gösterir ve hatta uzun ömürlülük ile yavru büyüklüğü50 arasında ters bir korelasyon olması bile mümkündür. Bu, C. elegans'a özgü bir fenomen değildir, çünkü üremenin uzun ömürlülük üzerindeki zararlı etkileri uzun zamandır insanlarda66, refakatçi köpeklerde 67 ve farelerde68 gözlenmiştir. Yine de, üreme sağlığının uzun ömürlülük veya sağlık süresi ile ilişkili olmayabileceği uyarısıyla üreme sağlığını ölçmek için güvenilir ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yumurta sayısı ve yavru büyüklüğü sağlıyoruz.
Son olarak, hayatta kalma testleri organizma sağlığının dolaylı bir ölçüsü olarak sunulmaktadır. Önemli olarak, termal stres69 ve ER stres35'e yanıt da dahil olmak üzere hücresel stres tepkileri, yaşlanma sürecinde hızla azalır ve proteostaz 70,71'in yaşlanma özelliği ile doğrudan ilgilidir. Buna karşılık, aşırı aktive edici stres tepkileri, strese karşı direnci teşvik ederek ömrü önemli ölçüde artırabilir35,37,38. Bu çalışma en basit ve en düşük maliyetli yöntemlere odaklanırken, termotolerans41 ve oksidatif stres66 için stres direnci testleri için her biri farklı bir ekipman ve sarf malzemesi seti gerektiren çok sayıda alternatif yöntem bulunmaktadır. Stresörlere basit maruz kalma çalışmalarının ötesinde, ekipmana erişime bağlı olarak diğer fizyolojik yöntemler de uygulanabilir. Örneğin, bir hücre dışı akı analizörü mitokondriyal fonksiyonu ve hücresel solunumu izleyebilir73; floresan diseksiyon mikroskopları, stres yanıtı aktivasyonu için transkripsiyonel raporlayıcıların ölçümlerine izin verecektir20; ve yüksek çözünürlüklü bileşik veya konfokal mikroskoplar, mitokondri 74, endoplazmik retikulum 75,76 ve aktin sitoiskelet 77 için floresan problarla organel morfolojisini ölçmek içinkullanılabilir.
Uzun ömürlülük ölçümleri için son bir uyarı hikayesi olarak, solucanları sterilize etmek için kimyasal ve genetik yöntemler maliyeti önemli ölçüde azaltmak için sunulurken, her ikisinin de ömrü doğrudan etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Örneğin, FUDR'ye maruz kalmanın daha önce hem ömrü hem de termotoleransı etkilediği bildirilmiştir45. Glp-4 (bn2) mutantının kendisinin yaşam süresi üzerinde doğrudan bir etkisi olmasa da, 25 ° C'deki büyüme hafif bir ısı stresi 33,34'tür ve bu nedenle ömrü etkileyebilir 2. C. elegans'ı sterilize etmek için, oksin aracılı sterilite78 veya alternatif sıcaklığa duyarlı sperm eksikliği olan mutantlar79 dahil olmak üzere başka yöntemler de vardır. Bununla birlikte, tüm yöntemlerin bazı uyarıları vardır ve her laboratuvarın bilimsel ihtiyaçları için en az zararlı tahlilin kullanılmasına özen gösterilmelidir. Uzun ömürlülük çalışmalarının son bir sınırlaması, düşük örneklem büyüklükleri nedeniyle veya sadece araştırmacı tarafından yapılan objektif bir hatayla ortaya çıkabilecek potansiyel değişkenliktir. Yeni teknolojiler otomatik ömür teknolojileri80'de doğduğu için bu durum atlatılabilir, ancak yine de bu sistemler maliyetlidir ve bazı mühendislik ve hesaplama ekipmanı ve becerileri gerektirir. Nihayetinde, burada sağlanan yöntemlerin toplanması, hemen hemen her kurumda hızlı bir şekilde uyarlanabilen ve öğrenilebilen ve yaşlanma biyolojisi için sağlam bir temel sağlayan güvenilir bir araç setidir.

Sydney Brenner'in 1974'teki en etkili makalelerinden biri olan 'Caenorhabditis elegans'ın genetiği'nin yayınlanmasından bu yana, bu mikroskobik solucan biyolojik gizemleri incelemek için olağanüstü bir model sistem olarak kabul edilmiştir1. 1977'de Michael R. Klass, C. elegans'ın ömrünü ölçme yöntemini yayınladı ve yaşlanmayı incelemek için bu model sistemi kurdu2. Stres ve uzun ömürlülük arasındaki ilişkiyi anlamak için yapılan araştırma, yaş-1 genindeki tek bir mutasyonun tanımlanmasıyla başlamış ve bu da C. elegans3'te yaşam süresinin uzamasına neden olmuştur. Ayrıca, çağdaş çalışmalar, strese karşı artan direnç gösteren uzun ömürlü mutant solucanları ortaya çıkaran diğer yaşam süresini artıran mutasyonları tanımlamıştır 4,5,6. Kısa ömrü, kolay bakımı, insan hastalığına neden olan tüm genlerin yaklaşık üçte ikisine homoloji içeren tamamen sıralanmış genomu, RNA girişim (RNAi) kütüphanelerinin kullanılabilirliği ve kullanım kolaylığı ve insanlarla fizyolojik benzerliği 7,8,9 gibi birçok avantajı ile C. elegans, stres ve yaşlanma biyolojisi için olağanüstü bir model olarak hızla benimsenmiştir.
Belki de C. elegans'ın en büyük faydaları, son derece düşük bakım maliyeti, deney kolaylığı ve çalışmalar için mevcut genetik araçların çeşitliliğidir. C. elegans tipik olarak bir E. coli besin kaynağı ile katı bir agar ortamında yetiştirilir. Yaygın olarak kullanılan iki E. coli suşu standart OP50, belki de en yaygın kullanılan 10 olan bir B suşu ve öncelikle RNAi deneyleri için kullanılan bir K-12 suşu olan HT115'tir11,12. HT115 K-12 suşu, bireysel C. elegans genlerine karşılık gelen dsRNA'yı eksprese eden plazmidlerin kullanıldığı RNAi yöntemleri için gerekli olan bir mutasyon olan RNAIII RNaz'da bir delesyon taşır. dsRNA besleme vektörleri, karmaşık haçlara veya genom düzenlemesine gerek kalmadan C. elegans genlerinin sağlam bir şekilde parçalanmasına izin verir, çünkü bu plazmidleri taşıyan bakteriler doğrudan nematodlara beslenebilir. Bu bakteriyel RNAi vektörlerinin binlercesi, 19.000 > bireysel RNAi yapısı13 ve 16.757 RNAi yapısı14 olan Ahringer RNAi kütüphanesi de dahil olmak üzere HT115 arka planında bulunur. Bununla birlikte, OP50 ve HT115 bakteri diyetleri, B12 Vitamini 15,16'daki farklılıklar da dahil olmak üzere metabolik profilde büyük farklılıklara sahiptir. Bu nedenle, daha önce tarif edildiği gibi birden fazla kafa karıştırıcı faktör ortaya çıkarabilecek gen-diyet etkileşimlerinden kaçınmak için mümkünse tüm deneylerin tek bir bakteri kaynağı üzerinde yapılması önerilir17,18,19. Kolaylığı nedeniyle, hayvanlar burada açıklanan tüm deneysel koşullar için OP50'de tutulur, ancak tüm deneyler daha önce açıklandığı gibi HT115 üzerinde gerçekleştirilir20. Kısaca, hayvanlar OP50'de tutulur ve RNAi ile RNAi olmayan deneyler arasında tutarlılık için senkronizasyon sonrası HT115'e (ağartmadan sonra) aktarılır. Alternatif olarak, E. coli K12 HT115 suşunda bulunan RNAIII RNaz'ın benzer bir delesyonunu taşıyan RNAi yetkin bir OP50 suşu da kullanılabilir21.
Belki de C. elegans'taki RNAi deneylerinin en büyük sınırlamalarından biri, nakavt verimliliği endişesidir. Nakavt verimliliği qPCR veya batı lekelemesi ile doğrulanabilirken, bunlar pahalı ekipman ve reaktifler gerektirir ve toplu analizle sınırlıdır. Bu, RNAi'ye dirençli (daha az hassas) olan nöronlar gibi spesifik hücrelere bakmak için daha da endişe vericidir. Spesifik hücrelerdeki RNAi etkinliği, dsRNA alımı22 için gerekli olan transmembran proteini olan SID-1'in aşırı ekspresyonu ile arttırılabilirken, bu hala bu yapılar için kullanılan promotörlerin hücre tipine özgü ekspresyon kalıpları ile sınırlıdır ve bu nedenle gen nakavtları ve mutasyonları, gen fonksiyonlarını tüketmenin en kusursuz yoludur. RNAi aracılı nakavtın ötesinde, C. elegans ayrıca CRISPR tabanlı stratejilerle genom düzenlemeye23,24,25 ve mikroenjeksiyonlar yoluyla transgenik yapı aşırı ekspresyonuna oldukça uygundur ve transgenik yapıları ışınlama veya transpozon tabanlı entegrasyon yoluyla entegre etme seçeneği26,27,28,29 . Bununla birlikte, bu yöntemler pahalı mikroenjeksiyon ekipmanı gerektirir ve kılavuz RNA'ların veya Cas9 enziminin yüksek maliyeti, sınırlı finansmana sahip kurumlarda bu yöntemleri yasaklayabilir. Bunun yerine, binlerce transgenik çizgi ve mutant, hem Caenorhabditis Genetik Merkezi'nde (CGC) hem de Ulusal Biyokaynak Projesi'nde (NBRP) birkaç dolara kolayca bulunabilir. NBRP, yayınlanmış ve bu nedenle doğrulanmış mutant suşları, pilot projelerden türetilen mutantlar ve henüz karakterize edilmemiş mutantlar dahil olmak üzere çok sayıda C. elegans geni için izole mutantlar sunmaktadır. Buna karşılık, CGC, araştırma topluluğundan çoğunlukla yayınlanmış ve kurulmuş C. elegans hatlarının bir deposudur. Her ikisi de dünya çapında çok makul fiyatlarla suşlar gönderiyor ve şirket içinde suşları sentezlemek için sınırlı kapasiteye sahip olanlar için çok çeşitli seçenekler sunuyor.
Burada, C. elegans'ta yaşam süresini ve sağlık süresini analiz etmek için en düşük maliyetli yöntemler olması muhtemel olan küratörlü bir yöntem koleksiyonu sunulmaktadır. Burada sunulan tüm yöntemler düşük maliyetli ekipman ve sarf malzemeleri gerektirir ve yalnızca CGC'den kolayca temin edilebilen suşları kullanır. C. elegans'ta uzun ömürlülük ve hayatta kalma testleri için belki de en yasaklayıcı olanı, Nematod Growth Media (NGM) plakalarının maliyetidir. C. elegans hermafrodit olduğundan ve kendi kendine döllendiğinden, standart hayatta kalma testleri, yavrulardan kontaminasyonu önlemek için yetişkin hayvanların sürekli olarak soylarından uzaklaştırılmasını gerektirir. Bu işlem sadece zaman alıcı olmakla kalmaz, aynı zamanda tek bir ömür boyu tahlil yapmak için koşul başına yaklaşık 100 plaka gerekliliği nedeniyle pahalı hale gelebilir. Burada iki alternatif sunulmaktadır: sıcaklığa duyarlı germ çizgisi içermeyen mutant, glp-4 (bn2) kullanımı veya 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) kullanılarak kimyasal sterilizasyon. glp-4, bir valil aminoasil tRNA sentetazı kodlar ve sıcaklığa duyarlı glp-4 (bn2), azalmış protein translasyonu30,31 nedeniyle kısıtlayıcı sıcaklıklarda üreme açısından yetersizdir. FUDR, DNA replikasyonunu önleyerek C. elegans'ı kimyasal olarak sterilize etmek için sağlam bir yöntemdir, böylece üremeyi inhibe eder32. FUDR, bazı laboratuvarlar için engelleyici derecede pahalı olabilse de, solucanları kimyasal olarak sterilize etmek için sadece küçük bir miktar gereklidir ve toz formundaki stabilitesi çoğu grup için uygun hale getirebilir. Sıcaklığa duyarlı glp-4 (bn2) mutantını kullanmak kesinlikle en ucuz seçenektir, çünkü tek gereksinim hayvanları kısıtlayıcı 25 ° C'ye kaydırmak için bir inkübatördür; Bununla birlikte, 25 °C'de büyümenin hafif ısı stresine neden olabileceği unutulmamalıdır33,34. Yöntemden bağımsız olarak, steril hayvanların kullanılması, yaşa bağlı tahliller için gerekli sarf malzemelerinin maliyetlerini önemli ölçüde azaltabilir.
Yaşlanmayı incelemek için, standart ömür testleri gelenekseldir, çünkü uzun ömürlülüğü değiştiren paradigmaların yaşlanma üzerinde doğrudan etkileri vardır. Bununla birlikte, sağlık süresi ve stres toleransı ölçümleri, organizmanın sağlığı hakkında ek bilgiler sunmaktadır. Burada, sağlığı ölçmek için çeşitli yöntemler sunulmaktadır: 1) üreme sağlığının bir ölçüsü olarak doğurganlık; 2) Gelişimsel sağlığın ve serilen yavruların yaşayabilirliğinin bir ölçüsü olarak yavru büyüklüğü; ve 3) kas fonksiyonu ve hareketliliğinin bir ölçüsü olarak lokomotor davranış, her ikisi de yaşlanma ile doğrudan ilişkilidir. Ek olarak, stres toleransı testleri sunulmaktadır: ER stresine hayatta kalma, mitokondriyal / oksidatif stres ve termal stres sağkalımı. Gerçekten de, ER stresine karşı direnci artmış olan hayvanlar 35,36, mitokondriyal stres37 ve termal stres38 daha uzun ömür sergiler. ER stresi, C. elegans'ın N'ye bağlı glikozilasyonu bloke eden ve yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine neden olan tunikamisin'e maruz bırakılmasıyla uygulanır39. Mitokondriyal / oksidatif stres, özellikle mitokondri40'ta süperoksit oluşumunu indükleyen paraquat'a maruz kalarak indüklenir. Isı stresi, hayvanların 34-37°C 33,41'de kuluçkalanması yoluyla uygulanır. Burada açıklanan tüm tahliller minimum ekipman ve fonla gerçekleştirilebilir ve çeşitli gruplarda yaşlanmayı incelemek için çeşitli araçlar sunar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX IPTG</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>18-242</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-764</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-330</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76345-522</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80057-932</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95020-778</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-132</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-566</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7E Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450840</td>
			<td>Standard dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC7495.7-32</td>
			<td>for bleach solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-638</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ın model bir organizma olarak keşfi ve gelişimi, biyolojide, özellikle yaşlanma alanında etkili olmuştur. Birçok tarihsel ve çağdaş çalışma, genetik mutasyonlar, transgenik gen ekspresyonu ve strese faydalı, düşük dereceli bir maruz kalma olan hormesis de dahil olmak üzere binlerce yaşam süresini değiştiren paradigmayı tanımlamıştır. Kısa bir ömür, kolay ve düşük maliyetli bakım ve tüm insan genlerinin neredeyse üçte ikisine homoloji ile tamamen sıralanmış genom dahil olmak üzere birçok avantajı ile C. elegans, stres ve yaşlanma biyolojisi için olağanüstü bir model olarak hızla benimsenmiştir. Burada, kullanım ömrünü ve sağlık süresini ölçmek için, özellikle sınırlı ekipman ve fonlara sahip olanlar olmak üzere hemen hemen her araştırma ortamına kolayca uyarlanabilen çeşitli standartlaştırılmış yöntemler araştırılmaktadır. C. elegans'ın inanılmaz faydası, kapsamlı bir altyapıya ihtiyaç duymadan yaşlanma biyolojisinde güçlü genetik analizler yapma kapasitesini vurgulayarak öne çıkıyor. Son olarak, her analizin sınırlamaları ve alternatif yaklaşımlar dikkate alınmak üzere tartışılmaktadır.

C. elegans, yaşlanma mekanizmalarının büyük çoğunluğunun insanlarla korunması nedeniyle yaşlanma araştırmaları için mükemmel bir model organizmadır. Daha da önemlisi, ekipman ve sarf malzemeleri için minimum gereksinimlerle bakım ve deney konusunda çok düşük bir maliyete sahiptirler, bu da onları sınırlı fonlara sahip kurumlar için imrenilen bir model sistem haline getirir. Dahası, sığ öğrenme eğrilerine sahip basit tahlillerin bolluğu, onları çok az deneyime sahip veya hiç deneyimi olmayan en genç araştırmacı için bile mükemmel bir sistem haline getirir. Tüm bu faktörler, genom düzenleme kolaylığı, nominal maliyetlerle binlerce mevcut mutant ve transgenik hayvan ve hemen hemen her genin genetik olarak yıkılması için mevcut RNAi kütüphaneleri de dahil olmak üzere C. elegans'ın güçlü genetiği ile birleştiğinde, onları lisans kurumları için ideal bir sistem haline getirmektedir. Burada, C. elegans'ta yaşlanmayı incelemek için en düşük maliyetli yöntemlerden bazıları araştırılmış, öncelikle minimum ekipman ve sarf malzemesi maliyeti ile yapılan tahlillere ve sığ öğrenme eğrilerine odaklanılmıştır. Aslında, protokollerin ve veri toplamanın tamamı, çoğunlukla lisans öğrencileri olmak üzere <5 aylık araştırma deneyimine sahip genç araştırmacılar tarafından yazılmıştır / gerçekleştirilmiştir.
C. elegans'taki uzun ömürlülük çalışmaları, hayvanların 14-20 gün arasında değişen kısa ömürleri nedeniyle çok basittir. Daha da önemlisi, ömür boyu testler son derece standartlaştırılmıştır ve sadece bir inkübatör, standart bir diseksiyon mikroskobu, standart bir solucan toplama ve NGM-agar plakalarını hazırlamak için sarf malzemeleri gerektirir. C. elegans'taki ömür ölçümlerinin belki de en maliyet engelleyici yönü, gerekli sarf malzemeleridir. Bunun nedeni, C. elegans'ın kendi kendini dölleyen hermafroditler olmasıdır; bu nedenle, uzun ömür tahlilleri için izlenen yetişkinlerin günlük olarak soydan uzaklaştırılması gerekir. Bununla birlikte, hayvanlar FUDR'ye maruz bırakılarak veya30,31,32 gereken sarf malzemesi miktarını azaltmak için yasaklayıcı 25 ° C'de yetiştirilen sıcaklığa duyarlı germ çizgisi içermeyen glp-4 (bn2) mutantı gibi mutantlar kullanılarak sterilize edilebilir. Burada, yaşam süresi testleri FUDR veya glp-4 (bn2) germ çizgisi olmayan mutantlarla gerçekleştirildi ve bu da steril olmayan hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen standart yaşam sürelerine benzer sonuçlar gösterdi. FUDR 45'in veya25 ° C'de büyümenin yaşam süresi 2 üzerindeki etkileri nedeniyle vahşi tip ömürler aynı olmasa da, kısa ömürlü hsf-1 nakavt hayvanı, tüm koşullar için yaşam süresinde önemli bir azalma olduğunu güvenilir bir şekilde göstermektedir (Şekil 1). hsf-1, termal stres tepkisinin düzenlenmesinde rol oynayan ısı-şok faktörü-1 transkripsiyon faktörünü kodlar ve nakavt, yaşam süresi 38,46'da önemli bir azalmaya neden olur.
Uzun ömürlülük, yaşlanma biyolojisinde dikkate alınması gereken önemli bir faktör olsa da, çoğu zaman, uzun ömürlülük, C. elegans47'de bile, artan sağlıkla ilişkili değildir. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, üreme sağlığı, lokomotor davranış ve stres direnci dahil olmak üzere organizma sağlığını ölçmek için çeşitli yöntemler sunuyoruz. Üreme sağlığı iki yoldan biriyle ölçülebilir. İlk olarak, yumurta sayımı ölçümleri, kendi kendine döllenen tek bir hermafrodit tarafından kaç yumurta bırakıldığının doğrudan bir ölçümünü verecektir. Bununla birlikte, hayvanlar spermden daha fazla yumurta ürettiğinden, asla canlı soy üretmeyecek bazı döllenmemiş yumurtalar daserilir 48. Bu nedenle, bir hayvanın gerçek üreme kapasitesini daha iyi anlamak için, yavru büyüklüğünün ölçümleri, kaç tane canlı yavru üretildiğinin bir ölçüsünü sağlar. Çoğu zaman, artan stres direnci, potansiyel olarak algılanan stresin üreme üzerindeki doğal etkisinden dolayı üreme kapasitesini azaltabilir49. Benzer şekilde, hem yumurtlayan yumurta sayısında hem de yavru boyutunda, vahşi tip kontrollere kıyasla hsf-1 aşırı ekspresyon hayvanlarında önemli bir azalma bulunmuştur (Şekil 2A, B). Aslında, bazı hsf-1 aşırı ekspresyon hayvanları, üreme sağlığının uzun ömürlülükle ters orantılı olabileceğine dair kanıt sağlayan tam sterilite sergiler.
Üreme sağlığı, germline sağlığını, fonksiyonel mayozu ve üreme kapasitesini anlamak için önemli olsa da, genel olarak, uzun ömürlülük ile yavru büyüklüğü50 arasında doğrudan bir ilişki yoktur. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, lokomotor davranışı,51 yaşı sırasında C. elegans sağlık süresini test etmek için altın standart bir yöntem olarak sunulmaktadır. Lokomotor davranışını ölçmek için birçok yöntem vardır, ancak çoğu yöntem sofistike kameralar, izleme yazılımları veya pahalı kimyasallar gerektirir. Buna karşılık, ezme testleri, standart bir C. elegans laboratuvarının sahip olduğu ekipmanın ötesinde neredeyse hiçbir ekipman gerektirmez: diseksiyon mikroskobu, solucan toplama, pipet ve NGM-agar plakaları yapmak için sarf malzemeleri. Thrashing oranları, yaşlı hayvanlarda genç hayvanlara kıyasla thrashing'de önemli bir azalma ile ölçüldüğü gibi, yaşlanma sırasında sağlık süresini ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlar (Şekil 2C).
Son olarak, stres tahlillerine hayatta kalmak, esnekliğin ek bir fizyolojik ölçümüdür. Stres tepkilerini aktive etme kapasitesi genellikle yaşlanma sürecinde azalır, bu da hayvanları daha az esnek ve strese karşı daha duyarlı hale getirir. Böylece, stres direnci organizma sağlığı için güvenilir bir vekil olarak kullanılabilir. Burada, 1) N'ye bağlı glikozilasyonu bloke eden ve ER'de yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine neden olan kimyasal bir ajan olan tunikamisin maruziyetine yanıt olarak ER stresine duyarlılığı araştırmak için yöntemler sunulmaktadır; 2) mitokondride süperoksit oluşumunu indükleyen kimyasal bir ajan olan paraquat'a maruz kalma yoluyla mitokondriyal / oksidatif stres; ve 3) yüksek sıcaklıklara maruz kalma yoluyla termal stres. Tunikamisin ve paraquat tahlilleri için, ilaç plaka üretimi sırasında NGM-agar plakasına dahil edilir. Yüksek konsantrasyonlarda tunikamisin için, döl genellikle gelişmez ve bu nedenle sterilizasyon tekniklerinin kullanılmasına gerek yoktur. Burada sunulan protokol, tunikamisinin nihai konsantrasyonu olarak 25 ng / μL'yi önermektedir, ancak sınırlı fonları olanlar için 10 ng / μL de sağkalımda önemli bir azalma göstermektedir (Şekil 3A). Her iki konsantrasyon da döl gelişimini sınırlar ve bu nedenle sterilizasyon yöntemlerine gerek yoktur, ancak DMSO kontrolü bir sterilizasyon tekniği veya hayvanların yeni plakalara taşınmasını gerektirecektir. Bunun nedeni, tunikamisin toksisitesinin döl gelişimini önlemesidir, ancak DMSO neredeyse toksik değildir, bu da tunikamisin üzerinde yetiştirildiğinde soyunun tamamen gelişmesine izin verir.
Paraquat tahlilleri için, paraquat tedavisi döllerin yetişkinliğe kadar gelişmesini engellemediğinden, bir sterilizasyon tekniği veya hayvanların hareketi gereklidir. Yüksek paraquat seviyeleri (4 mM) ömrü önemli ölçüde kısaltırken, düşük paraquat seviyeleri (0.25 mM), daha önce yayınlanan sonuçlarla tutarlı olarak hormetik bir etki nedeniyle ömrü uzatır (Şekil 3B)52. Son olarak, termotolerans testleri sadece 30-37 ° C'ye ulaşabilen bir inkübatör gerektirir ve ek reaktiflere gerek yoktur. HSF-1'in aşırı ekspresyonu, daha önce yayınlandığı gibi 37 ° C'de termotoleransı arttırır (Şekil 3C)53. Bununla birlikte, diğerlerinin daha önce ve mevcut verilerden gösterdiği gibi, termotolerans testleri ile ilgili en büyük sorun değişkenlikleridir. Termotolerans analizlerindeki değişkenliğe birçok faktör katkıda bulunabilir, inkübatörler arasındaki farklar ve hayvanların her saat termotoleransı puanlarken inkübatörün dışında geçirdikleri zaman da dahil olmak üzere. Kapsamlı bir termotolerans kılavuzu için, referans 41'e bakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg"> Şekil 1: Sterilizasyonlu ve sterilizasyonsuz ömür ölçümlerinin karşılaştırılması. (A) 20 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi bakterileri ile tohumlanmış NGM-agar plakalarında yetiştirilen vahşi tip N2 nematodlarının ömrü. Hayvanlar, yetişkinliğin 1, 3, 5 ve 7. günlerinde soydan uzaklaştırıldı. (B) 20 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi bakterileri ile tohumlanan NGM-agar-FUDR plakalarında yetiştirilen vahşi tip N2 nematodlarının ömrü. Hayvanlar standart ev veya hsf-1 RNAi plakalarında yetişkinliğe yetiştirildi ve daha sonra yetişkinliğin 1. gününde FUDR plakalarına taşındı. (C) 25 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi ile tohumlanmış NGM-agar plakaları üzerinde yetiştirilen glp-4(bn2) mutant hayvanların ömürleri. Tüm koşullar için, tüm hayvanlar ölü olarak kaydedilene veya sansürlenene kadar her 2 günde bir hayvanlar ölüm için puanlandı. Vulvanın torbalanması, çıkıntısı veya patlaması olan veya plakaların kenarlarından yukarı doğru sürünen ve kurutulan hayvanlar sansürlendi. Tüm istatistikler Log-Rank Mantel-Cox testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve Tablo 2'de bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg"> Şekil 2: Yumurta sayısı, yavru büyüklüğü ve sağlık ölçümü olarak thrashing . (A) Thrashing testleri, 1. gün (mavi), 4. gün (kırmızı) ve 9. gün (yeşil) hayvanlarda 25 °C'de boş vektörle tohumlanmış NGM-agar plakaları üzerinde yetiştirilen glp-4 (bn2) mutant hayvanlar üzerinde gerçekleştirildi. Bir NGM-agar plakası üzerinde M9 çözeltisine yerleştirilen hayvanlarda thrashing puanlandı, standart bir diseksiyon kapsamının göz merceğine monte edilmiş standart bir akıllı telefon kamerası kullanılarak video kaydedildi ve doğruluk için ağır çekimde thrashing puanlandı. n = koşul başına 15 hayvan. (B) Yumurta sayıları vahşi tip N2 (mavi) ve sur-5p::hsf-1 (kırmızı) hayvanlarda ölçülmüştür. Hayvanlar 20 ° C'de yetiştirildi ve taze plakalara taşındı ve yumurtalar her 12 saatte bir sayıldı. Atılan toplam yumurta sayısı toplandı. n = vahşi tip için 7 hayvan ve sur-5p için 9 hayvan::hsf-1. (C) Kuluçka tahlilleri, yumurtaların kuluçkaya izin vermek için 2 gün boyunca 20 ° C'de yetiştirildiği (B) ile aynı hayvanlar üzerinde ölçüldü ve yumurtadan çıkan tüm yumurtalar sayıldı. = p < 0.001 parametrik olmayan Mann-Whitney testi kullanılarak hesaplanmıştır. Her nokta tek bir hayvanı temsil eder ve çizgiler medyan ve çeyrekler arası aralığı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg"> Şekil 3: Organizma sağlığına bir vekil olarak stres direnci. (A) 20 ° C'de boş vektör RNAi bakterilerinde yetiştirilen N2 hayvanlarının hayatta kalma testi. Hayvanlar, yetişkinliğin 1. gününde %1 DMSO, 10 ng/μL tunikamisin (TM) veya 25 ng/μL TM içeren plakalara taşındı. (B) 20 °C'de boş vektör RNAi bakterileri üzerinde yetiştirilen N2 hayvanlarının hayatta kalma testi. Hayvanlar, kapaktan su, 0.25 mM paraquat (PQ) veya 4 mM PQ içeren plakalar üzerinde yetiştirildi. A-B için, tüm hayvanlar ölü olarak kaydedilene veya sansürlenene kadar her 2 günde bir hayvanlar ölüm için puanlandı. Vulvanın torbalanması, çıkıntısı veya patlaması olan veya plakaların kenarlarından yukarı doğru sürünen ve kurutulan hayvanlar sansürlendi. Tüm istatistikler Log-Rank Mantel-Cox testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Tablo 2). (C) Vahşi tip N2 hayvanları için tüm 37 °C termotolerans testlerinin hsf-1'in aşırı ekspresyonuna karşı toplanan veriler (sur-5p::hsf-1). Veriler, bir termotolerans testinin 9 saati olan zamanda canlı yüzde = 9 saat olarak temsil edilir ve her çizgi aynı gün gerçekleştirilen eşleşen bir deneyi temsil eder. Hayvanlar 20 ° C'de boş vektör RNAi bakterileri üzerinde yetiştirildi ve tahlil için yetişkinliğin 1. gününde 37 ° C'ye taşındı. n = replika başına suş başına 60 hayvan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td colspan="3">Yemek tarifi</td>
		</tr><tr><td>Ağartıcı çözeltisi</td>
			<td colspan="3">%1,8 (v/v) sodyum hipoklorit, 0,375 M KOH</td>
		</tr><tr><td>Karbenisilin</td>
			<td colspan="3">Suda 100 mg/mL stok çözeltisi (1000x). 6 aya kadar 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın</td>
		</tr><tr><td>FUDR</td>
			<td colspan="3">Suda 10 mg/mL çözelti. -20 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>IPTG</td>
			<td colspan="3">Suda 1 M çözelti.</td>
		</tr><tr><td>Lizojen Et Suyu (LB)</td>
			<td colspan="3">Bu protokolde, ticari LB kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu), ancak Bacto-tripton, maya özü ve NaCl kullanan tüm standart LB ev yapımı tarifler yeterlidir.</td>
		</tr><tr><td>M9 çözümü</td>
			<td colspan="3">22 mM KH 2 PO4 monobazik, 42,3 mM Na2HPO 4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSOİ 4</td>
		</tr><tr><td>Nematod Büyüme Ortamı (NGM)</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgS.4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bakto-Pepton, 51.3 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi plakaları</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin. 4 ° C'de karanlıkta 3 aya kadar saklayın</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin; %1 DMSO</td>
		</tr><tr><td>(tunikamisin için kontrol)</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi TM</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin; %1 DMSO, 25 ng/μL tunikamisin</td>
		</tr><tr><td>Paraquat</td>
			<td colspan="3">Suda 400 mM çözelti – taze hazırlanmalıdır</td>
		</tr><tr><td>Tetrasiklin</td>
			<td colspan="3">%100 etanol içinde 10 mg/mL stok çözeltisi (500x). -20 °C'de saklayın</td>
		</tr><tr><td>Tunikamisin</td>
			<td colspan="3">%100 DMSO'da 2,5 mg/mL stok çözeltisi. Uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın. Bu 100x çözümdür (25 ng/μL çalışma çözümü)</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1. Protokoller için reaktifler ve medya tarifleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>İlgili Şekil paneli</td>
			<td colspan="2">Gerinim, Tedavi</td>
			<td>Ortalama Ömrü</td>
			<td># Ölümler/# Toplam</td>
			<td>p-değeri (Log-Rank)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1A</td>
			<td colspan="2">N2, RNAi vektörü, 20 °C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1B</td>
			<td colspan="2">N2, vektör RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1C</td>
			<td colspan="2">N2, glp-4(bn2), RNAi vektörü, 25 °C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>< 0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2, vektör RNAi, 20 °C, %1 DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vektör RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunikamisin</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vektör RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycin</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2, RNAi vektörü, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vektör RNAi, 20 °C, 0.25 mM paraquat</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, vektör RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td><0,001</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2. Yaşam süresi ve strese dayanıklılık istatistikleri.

Watch this Scientific Journal Video about Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Bu protokol, deniz eleganlarında yaşlanmaya hizmet etmek için en düşük maliyetli ve en düşük teknoloji yöntemlerini sunar. Yaşlanma biyolojisinde etkili bir model organizma. Bu yöntemlerin en büyük avantajı, düşük maliyetli ekipman ve malzeme kullanarak uygulama kolaylığıdır.Onları deneyim veya mevcut finansmandan bağımsız olarak herhangi bir araştırmacıya uygun hale getirmek. Yaşlı bir yaşlanma çalışması olarak, popülasyonlarda sağlıkta doğal değişkenlik vardır. Bu nedenle, deneylerin sağlıklı, iyi beslenmiş ve sıkı bir şekilde senkronize edilmiş hayvanlar üzerinde yapılması önemlidir.Yırtılma sakatlığını sağlamak için Bir litre nematod büyüme ortamının veya NGM burgu plakasının hazırlanmasına başlayın. Bir karıştırma çubuğuna sahip bir litrelik şişeye 2,5 gram pep tonu, 3,0 gram sodyum klorür ve 20 gram burgu ekleyin ve 970 mililitrelik son hacme damıtılmış su ekleyin. Standart bir otoklav veya ortam sterilizatörü kullanarak NGM burgu çözeltisini bir litrelik şişede sterilize edin.Ve çözeltinin 60 ila 75 santigrat dereceye kadar soğuyana kadar karıştırılmasına izin verin. Çözelti soğurken, bir boncuk banyosunu 65 ila 70 santigrat dereceye ısıtın. NGM burgu çözeltisi 60 ila 75 santigrat dereceye soğuduktan sonra.Sıvı katkı maddelerini ekleyin ve çözeltinin beş dakika boyunca tamamen karışmasına izin verin. Ardından, plakaya dökülürken ortamın katılaşmasını önlemek için şişeyi 65 ila 70 santigrat derecede bir boncuk banyosuna batırın. Her 60 mililitrelik plakaya çözeltinin dokuz ila 11 mililitresini pipetleyin.İşiniz bittiğinde, sıcaklığı korumak ve pipetteki herhangi bir ortamın katılaşmasını önlemek için pipeti ısıtılmış çözeltiye geri yerleştirin. Tüm plakalar için prosedürü tekrarlayın ve NGM plakalarının gece boyunca katılaşmasına izin verin. Katılaştıktan sonra, bunları bakteri içeren tohumlama plakaları için kullanın veya solucanları ağartma yoluyla senkronize etmek için plakaları dört santigrat derecede üç aya kadar kapalı kaplarda saklayın.Petri kabını fazla doldurmadan solucanları içeren bir tabağa az miktarda M9 çözeltisi dökerek nematodları toplayın. Daha sonra solucanları bakteri çimlerinden gevşetmek için M nine çözeltisini yavaşça döndürün. Daha sonra, yetişkin gravid solucanları serolojik pipetli 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.Burguyu pipet ucuyla delmekten kaçının. Hayvanları 1100 kez G'de 30 saniye boyunca merkeze toplayın ve süpernatanı aspire edin. Solucan peletine taze hazırlanmış ağartma çözeltisinden beş mililitre ekleyin ve solucanları, tüm yetişkin solucan gövdeleri çözülene ve karışımda sadece yumurtalar kalana kadar aralıklı kuvvetli sallama ile birlikte birkaç dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.Daha sonra, yumurta ağartıcı karışımını 1100 kat G'de 30 saniye boyunca döndürerek yumurtaları pelet ve ağartma çözeltisini aspire edin. Daha sonra peletlenmiş yumurtaları, 15 mililitreye kadar M9 çözeltisi ekleyerek ve yumurtaları ve çözeltiyi dağıtmak için tüpü dört veya beş kez ters çevirerek yıkayın. Yine, yumurtaları peletlemek ve M9 çözeltisini aspire etmek için tüpü 1100 kez G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın.Yumurta karışımından herhangi bir ağartıcıyı ortadan kaldırmak için yıkamayı dört kez yapın. Dördüncü yıkama santrifüzyonundan sonra, ağartılan toplam solucan sayısına bağlı olarak M9 çözeltisini 100 mikrolitreden iki mililitreye aspire edin. Kümeleri parçalamak için yumurtaları iyice çalkalayın ve yumurtaların M9 çözeltisinde tamamen yeniden askıya alındığından emin olun.Alternatif olarak, hayvanlar, 15 mililitrelik bir kronik tüpte yumurta peletine 10 ila 12 mililitre M9 çözeltisi eklenerek daha sıkı bir zamansal senkronizasyon için tutuklanabilir. Solucanların 20 santigrat derecede 24 saate kadar bir rotatörde dönmesine izin verin. Yumurta veya L'ye yaklaşık olarak bir konsantrasyon pipeti, yumurta karışımının dört mikrolitresini bakterilerle oturmuş bir NGM plakasına monte eder.Ardından, mikrolitre ortam başına mevcut yumurtaları sayın ve hesaplayın. Yaklaşım plakasına, uygun yumurta sayısına veya L'de bir tutuklu hayvanın, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış NGM burgu plakasına göre yaklaşımı iyileştirmek için sayımı üç veya dört kez tekrarlayın. Solucanların lokomotif davranışını thrashing yoluyla ölçmek.Bir NGM burgu plakasından az sayıda yetişkin solucanı, diseksiyon kapsamı altında 10 ila 20 mikrolitre M9 çözeltisine taşıyın. Ardından, bir seferde bir solucana odaklanın ve numunenin 15 saniye içinde içbükey bir oluşumdan dışbükey formasyona kaç kez geçtiğini sayın. Bir el sayacı ve bir zamanlayıcı kullanın ve 10 ila 15 solucan için prosedürü tekrarlayın.Solucanları istenen yaşa kadar yaşlandırın ve istenen tüm yaşlarda ezme ölçümlerini tekrarlayın. Görselleştirildiği gibi, yaşlı solucanlar önemli ölçüde daha yavaş hızlarda parçalanır. Miktar ve doğurganlık ölçümleri için.10 ila 15 Caenorhabditis elegans solucanında, L dört solucanını, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış ayrı bir NGM burgu plakasına ayırır. Hayvanların gece boyunca 20 santigrat derecede büyümesine izin verin ve yeni tohumlanmış bir tabak grubunun ertesi gün için hazır olduğundan emin olun. Caenorhabditis elegans tarafından bırakılan yumurta miktarını ölçmek için, yetişkin solucanları, yedi ila sekiz gün boyunca her 12 ila 24 saatte bir yağmalanmış bakterilerle tohumlanmış taze bir NGM burgu bıçağına aktarın veya yumurtalar artık görünür hale gelene kadar ve plakalara bırakılan yumurta sayısını sayın.Caenorhabditis elegans'ın yavru boyutunu ölçmek için yetişkin solucanları, her 12 ila 24 saatte bir, yedi ila sekiz günde bir veya soy artık görünmeyene kadar bakterilerle tohumlanmış taze bir NGM burgu plakasına aktarın. Yumurta içeren tüm plakaları 20 santigrat derecede tutun. Solucanları aktardıktan iki gün sonra.Plakadaki gelişmiş soyu sayın. F iki neslinin sonuçları karıştırmadığından emin olmak için L dört aşamasında veya daha önceki tüm canlı ve gelişmekte olan solucanları sayın. Tüm solucanları sayıldıkları gibi plakadan çıkarın.Gecikmiş kuluçka veya gelişime sahip hayvanların kaçırılmamasını sağlamak için plakaları tekrar puanlamadan önce bir ila iki gün daha saklayın. Sterilizasyon yönteminin vahşi tip N2 nematodlarının ömürleri üzerindeki etkisi, NGM burgu plakalarında yetişen solucanların ömürlerindeki değişikliklerin, NGM burgu FUDR plakalarında yetiştirilen solucanların veya NGM burgu plakalarında yetişen glp dört BN2 mutant hayvanınınkine benzer olduğunu göstermiştir. Kısa ömürlü HSF bir nakavt hayvanı, tüm koşullar için yaşam süresinde önemli bir düşüş gösterdi.HSF'de, vahşi tip kontrollerine kıyasla yumurtlayan yumurta sayısında ve yavru büyüklüğünde önemli bir azalma bulunmuştur. Bazı HSF bire bir ekspresyon hayvanları, üreme sağlığının uzun ömürlülükle ters orantılı olabileceğini gösteren tam sterilite sergiledi. Çarpma oranı, yaşlı hayvanlarda gençlere kıyasla ezmede önemli bir azalma ile ölçüldüğü gibi, yaşlanma sırasında sağlığı ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlamıştır.Strese karşı sağkalım, organizma sağlığını ölçmek için güvenilir testlerdir, retikulum stresine neden olan Tunicamisin, DMSO kontrolüne kıyasla konsantrasyondan bağımsız olarak daha kısa bir ömürle sonuçlanmıştır. Yüksek paraquat seviyeleri ömrü önemli ölçüde kısaltırken, düşük paraquat konsantrasyonları hormetik etki nedeniyle ömrü arttırdı. Termo tolerans tahlillerinde, HSF'nin aşırı ekspresyonu, tüm yaşam süresi ve yaşlanma deneyleri için termo toleransı 37 santigrat derecede arttırdı.Sterilizasyon tekniklerinin sonuçları etkileyen organizma sağlığı üzerinde pleiotropik bir etkiye sahip olabileceğini hatırlamak önemlidir. Transkripsiyon, translasyon protein agregasyonu, organel, morfoloji ve metabolik fonksiyonların ölçümleri dahil olmak üzere ekipman ve altyapı mevcutsa, sağlık süresini ölçmek için birçok ek ve tamamlayıcı yaklaşım mevcuttur.

Research

JoVE Journal

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...