Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

نحن ممتنون للغاية للدكتور ب. هيربوميل (معهد باستور ، فرنسا) ومختبره ، وخاصة فاليري بريولات ، وإيما كولوتشي جويون لتزويدنا بخطوط الزرد والعفن البلاستيكي لألواح الحقن المجهري ، ولخبرتهم القيمة في الإجراءات التجريبية لسمك الزرد. نحن نعرب عن امتناننا ل UtechS Photonic BioImaging (C2RT ، معهد باستور ، بدعم من وكالة البحوث الوطنية الفرنسية France BioImimaging ، و ANR-10-INBS-04; استثمارات للمستقبل). تم دعم هذا العمل من قبل الرابطة لمكافحة السرطان (EL2017. LNCC) ، والمركز الوطني للبحوث العلمية ، ومعهد باستور وبالتبرعات السخية للسيدة مارغريت ميشيل والسيد بوركيه.

أجريت التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات الاتحاد الأوروبي للتعامل مع المختبر. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات في معهد باستور - CEEA 89 ووزارة البحث والتعليم الفرنسية (تصريح # 01265.03). أثناء الحقن أو جلسات التصوير الحية ، تم تخدير الحيوانات Tricaine...

من المرجح أن يصبح تصوير الطعوم الخارجية للورم بدقة خلية واحدة أداة لا غنى عنها لتحسين فهمنا لبيولوجيا GBM. أدى التصوير المباشر في نماذج PDX للفأر إلى اكتشافات قيمة حول كيفية غزو GBM بشكل جماعي لأنسجة المخ18. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن الدقة الزمانية المكانية ليست عالية بما يكفي للكشف ?...

حركة الخلية هي عملية نمطية تتطلب إنشاء محور قطبية وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي المولدة للقوة. تعرف بلمرة الأكتين وارتباطها بالميوسين بأنهما المساهمان الرئيسيان في القوى البارزة والانقباضية اللازمة لحركة الخلية1. تعتبر الأنابيب الدقيقة هي الجهات الفاعلة الرئيسية في استقطاب الخلايا وثبات الاتجاه أثناء الهجرة2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أيضا أن MTs تخلق وتثبت نتوءات لدعم قوى الضغط الميكانيكي أثناء غزو الخلايا في 3D3. في الآونة الأخيرة ، شاركت MTs بشكل مباشر في النقل الميكانيكي في الالتصاقات البؤرية والهجرة الحساسة للميكانيكا4. يتكون عدم الاستقرار الديناميكي الذي يميز ديناميكيات نهاية MT-plus من مراحل متكررة من البلمرة (النمو) وإزالة البلمرة (الانكماش) ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة عدد كبير من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة وشلالات الإشارات داخل الخلايا ، مثل تلك التي يحكمها RHO-GTPases5،6،7. جعل دور شبكة MT في هجرة الخلايا وغزوها التحقيق في ديناميكيات MT عنصرا أساسيا لفهم آليات توجيه الخلايا المناعية والتئام الجروح وغزو السرطان بشكل أفضل.
تعد قدرة الخلايا السرطانية على الهروب من قلب الورم الرئيسي ، والانتشار في الأنسجة ، وتوليد أورام ثانوية خطوة حاسمة في منع النجاح العالمي في الحرب ضد السرطان التي أعلنت قبل 50 عاما 8,9. كانت إحدى أكبر العقبات هي فهم كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة بنشاط. تعتمد آليات الغزو الرئيسية على نفس المبادئ التي تحكم هجرة الخلايا غير السرطانية10. ومع ذلك ، ظهرت خصائص هجرة الخلايا السرطانية11 ، مما أثار الحاجة إلى توصيف أفضل لهذا النوع من الهجرة. على وجه التحديد ، نظرا لأن البيئة المكروية للورم تظهر كلاعب رئيسي في تطور السرطان12 ، فإن مراقبة وتحليل غزو الخلايا السرطانية في سياق فسيولوجي ذي صلة أمر ضروري لكشف آليات نشر الخلايا السرطانية.
تعتبر MTs أساسية لتطور السرطان ، للحفاظ على كل من الانتشار والغزو. يمكن أن يساعد التحليل الدقيق لديناميكيات MT في الموقع في تحديد عوامل تغيير MT (MTA) في كلتا العمليتين. تختلف ديناميكيات MT بشكل كبير عند حدوث تغيير في البيئة. في المختبر ، يمنع العلاج بعوامل مزعزعة للاستقرار MT مثل نوكودازول تكوين نتوء الخلايا عندما يتم تضمين الخلايا في المواد الهلامية في 3D ، في حين أنه ليس له تأثير يذكر على هجرة الخلايا ثنائية الأبعاد13,14. على الرغم من التحدي الفني ، إلا أن التقدم في التصوير داخل الجسم يسمح بتحليل ديناميكيات MT أثناء غزو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، كشفت ملاحظة MTs في خلايا الساركوما الليفية المطعمة تحت الجلد في الفئران أن الضامة المرتبطة بالورم تؤثر على ديناميكيات MT في الخلايا السرطانية15. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران هذه تنطوي على إجراءات جراحية واسعة النطاق وتظل غير مرضية للسرطانات التي يصعب الوصول إليها ، مثل ورم الدماغ شديد التوغل ، GBM.
على الرغم من متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب لمدة 15 شهرا16 ، لا يعرف سوى القليل عن طريقة انتشار GBM داخل حمة الدماغ أو العناصر الجزيئية الرئيسية التي تدعم غزو خلايا GBM في أنسجة المخ. قدم التحسين في نموذج xenograft التقويمي للفأر (PDX) وإنشاء نوافذ الجمجمة آفاقا جديدة لدراسات غزو خلايا GBM17,18. ومع ذلك ، نظرا لجودة التصوير دون المستوى الأمثل ، فقد سمح هذا النموذج في الغالب بالتصوير الطولي للطعوم الخارجية السطحية ولم يتم استخدامه بنجاح لدراسة التصوير تحت الخلوي لبروتينات الهيكل الخلوي حتى الآن. علاوة على ذلك ، في أعقاب الأمر القضائي "3Rs" للحد من استخدام القوارض واستبدالها بالفقاريات السفلية ، تم إنشاء نماذج بديلة.
الاستفادة من المناعة البدائية التي لوحظت في يرقات الزرد (Danio rerio) ، تم تطوير الحقن التقويمي لخلايا GBM في دماغ الأسماك19،20،21. الحقن بالقرب من البطينين في الدماغ المتوسط النامي يلخص معظم الفيزيولوجيا المرضية GBM البشرية21 ، ويلاحظ نفس النمط المفضل لغزو GBM كما هو الحال في خيار الأوعية البشرية22. بفضل شفافية يرقات الأسماك ، يسمح هذا النموذج بتصور خلايا GBM التي تغزو الدماغ من المناطق المحيطة بالبطين حيث يعتقد أن معظم GBMs تنشأ23.
نظرا لأن MTs ضرورية لغزو خلايا GBM في المختبر24,25 ، فهناك حاجة إلى توصيف أفضل لديناميكيات MT وتحديد المنظمين الرئيسيين أثناء غزو الخلايا. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم تتضمن البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام نموذج تقويم الزرد تحليلا تحت خلوي لديناميكيات MT أثناء عملية الغزو. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لدراسة ديناميكيات MT في الجسم الحي وتحديد دورها أثناء غزو سرطان الدماغ. بعد وضع علامات على الأنابيب الدقيقة المستقرة ، يتم حقن خلايا GBM الدقيقة عند 3 dpf في أدمغة يرقات الزرد وتصويرها في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية أثناء تقدمها في أنسجة المخ. يسمح التصوير المباشر ل MTs الفلوري بالتحليل النوعي والكمي لديناميكيات MT plus-end. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النموذج تقييم تأثير MTAs على ديناميكيات MT وعلى الخصائص الغازية لخلايا GBM في الوقت الفعلي. هذا البروتوكول غير الجراحي نسبيا جنبا إلى جنب مع عدد كبير من اليرقات التي يتم التعامل معها في وقت واحد وسهولة تطبيق الدواء (في مياه السمك) يجعل النموذج أحد الأصول للاختبار قبل السريري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب في السكان الحقيقيين - ما بين 6 إلى 15 شهرا - الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الخبيث الأكثر تدميرا. يرجع فشل العلاج بشكل أساسي إلى غزو خلايا GBM ، مما يدل على الحاجة إلى فهم أفضل لخصائص GBM المتحركة. للتحقيق في الآلية الجزيئية التي تدعم غزو GBM ، هناك حاجة إلى نماذج فسيولوجية جديدة تتيح توصيفا متعمقا لديناميكيات البروتين أثناء الغزو. هذه الملاحظات من شأنها أن تمهد الطريق لاكتشاف أهداف جديدة لمنع تسلل الورم وتحسين نتائج المرضى. تشير هذه الورقة إلى كيفية السماح للطعم الخارجي التقويمي لخلايا GBM في دماغ الزرد بالتصوير الحي داخل الخلايا تحت الخلوية. بالتركيز على الأنابيب الدقيقة (MTs) ، نصف إجراء لوضع العلامات على MT في خلايا GBM ، والحقن الدقيق لخلايا GBM في الدماغ الشفاف لمدة 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) يرقات الزرد ، والتصوير داخل الجسم ل MTs في نشر الطعوم الأجنبية ، وتغيير ديناميكيات MT لتقييم دورها أثناء غزو GBM ، وتحليل البيانات المكتسبة.

لتحليل الدور الذي تلعبه MTs أثناء غزو GBM في الجسم الحي ، نصف هنا الخطوات الرئيسية لأداء وضع علامات MT مستقرة في خلايا GBM عن طريق العدوى الفيروسية العدسية ، وزرع xenotransplantation التقويمي لخلايا GBM في 3 يرقات الزرد dpf ، والتصوير عالي الدقة داخل الجسم لديناميكيات MT ، وعلاج MTA وتأثيراته على غزو GBM ، وتحلي?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

أبلغنا عن تقنية تسمح بالتصوير الحي لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) التي تغزو أنسجة المخ الفقارية. يسمح اقتران الحقن التقويمي لخلايا GBM الموسومة بالفلورسنت في دماغ الزرد الشفاف مع التصوير الداخلي عالي الدقة بقياس ديناميكيات الهيكل الخلوي أثناء غزو السرطان في الموقع .

التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو دماغ الزرد

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

هذه الطريقة مخصصة للتحقيق في دور الأنابيب الدقيقة أثناء غزو سرطان الدماغ عن طريق اقتران الحقن التأتبي لخلية سرطان الدماغ في الزرد بالتصوير داخل الخلايا تحت الخلوية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الدقة الزمنية المكانية العالية التي يتم فيها الحصول على الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة. إنه فريد من نوعه لنماذج غزو سرطان الدماغ في الجسم الحي ويسمح بتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بعمق.يمكن استخدام التصوير تحت الخلوي لغزو خلايا سرطان الدماغ في الموقع لتحليل أي بروتين مهم يحتمل أن يكون متورطا في غزو السرطان. للبدء ، اغسل خلايا الورم الأرومي الدبقي المزروعة عند 37 درجة مئوية باستخدام PBS. افصل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تربسين EDTA واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا حتى يتم فصل جميع الخلايا بالكامل.أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط خلية الورم الأرومي الدبقي الكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. أضف 45 ملليلترا من PBS البارد المثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 134 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بملليلتر واحد من PBS المثلج البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل جيدا.أضف 49 ملليلترا أخرى من PBS البارد وأجهزة الطرد المركزي عند 134 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS البارد الجليدي. تخزينها على الجليد طوال مدة إجراء الزرع.للحقن الدقيق لخلايا الورم الأرومي الدبقي في الدماغ المتوسط ليرقات الزرد ، املأ صفيحة مصبوبة بالحقن الدقيق بستة ملليلتر من وسط E3 مع 160 ملليغرام لكل لتر من التريكائين. انقل عشرات يرقات DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED إلى صفيحة الحقن المجهري. بمجرد تخدير اليرقة وعدم استجابتها تماما للمس ، قم بمحاذاتها في الخنادق على جانبها ، ورأسها لأعلى ودفع كيس الصفار على جدار الخندق بفرشاة رسم مقاس 00.ثم قم بتحميل خمسة ميكرولتر من خلايا الورم الأرومي الدبقي في الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام نصائح التحميل الدقيق وأدخل الشعيرات الدموية في حامل الشعيرات الدموية العالمي. ضع صفيحة الحقن المجهري التي تحتوي على اليرقات المخدرة على مرحلة مجهر الاستريو. ضع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة على حدود لوحة الحقن الدقيق باستخدام مقابض المناور الدقيقة.ثم كسرها بمشرط لإنشاء نقطة دخول حادة بحجم قطر الخلية تقريبا. تحقق من أن الخلايا تتدفق من الشعيرات الدموية عن طريق تشغيل الزيت برفق في الحاقن الدقيق وإغراق طرف الإبرة في الوسط. ركز الخلايا عند طرف الشعيرات الدموية لزيادة عدد الخلايا المحقونة لكل حجم يتم حقنه وتجنب ملء أنسجة المخ ب PBS.افحص بعناية الخلايا الخارجة من الشعيرات الدموية الدقيقة حيث يتم إدخال الزيت يدويا في الحاقن. حدد تجريبيا عدد الدورات اللازمة على المقبض اليدوي لتوصيل 20 إلى 50 خلية. عادة ، إذا كانت الخلايا مركزة بدرجة كافية ، فإن دورة واحدة لطيفة تكفي لإخراج ما يقرب من 10 خلايا.اقترب من طرف الشعيرات الدموية ضد الحاجز البصري الأيسر فوق الوريد الدماغي الأوسط مباشرة. اضغط برفق على الشعيرات الدموية ضد اليرقات حتى ينكسر غشاء الجلد. بمجرد الوصول إلى موضع مناسب في الحاجز البصري ، أخرج الخلايا.راقب بعناية طرف الشعيرات الدموية لتصور تيار الخلايا التي تدخل داخل الحيوان وبالتالي ضمان الحقن الناجح. كرر الإجراء لأكبر عدد ممكن من الحيوانات حسب الحاجة. اعتمادا على مدى سرعة المجرب في الحقن ، قد تكون هناك حاجة لتغيير الإبرة كل 10 إلى 20 يرقة بسبب التكتل السريع للخلايا في الشعيرات الدموية.بمجرد اكتمال عملية زرع xeno ، قم بإزالة اليرقة من لوحة الحقن الدقيق وفردها في صفيحة 24 بئر مملوءة بمياه مصدر معدني PTU ووسط أزرق الميثيلين. تحضير محلول AH-KROH منخفض الانصهار بنسبة 1٪. انقل 500 ميكرولتر من محلول AH-KROH المغلي منخفض الانصهار بنسبة 1٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، واتركه يبرد عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية.أضف 160 ميكروغرام لكل لتر من التريكائين إلى AH-KROHS واخلطه جيدا. انقل واحدة إلى أربع يرقات مطعمة بالأجانب إلى طبق بتري 3.5 سم مملوء بمياه مصدر معدني PTU ووسط الميثيلين يكمله 160 ميكروغرام لكل لتر من التريكائين. بمجرد تخدير اليرقة وعدم استجابتها تماما للمس، قم بنقلها بعناية إلى الأنبوب الذي يحتوي على AH-KROHS والتريكائين باستخدام ماصة نقل ذات طرف رفيع.امزج اليرقة بلطف مع AH-KROHS. باستخدام ماصة نقل لمبة كبيرة ، ضع اليرقات المخلوطة في AH-KROHS على مركز طبق تصوير فيديو ذو قاع زجاجي 3.5 سم تحت مجهر ستيريو ضع اليرقات بسرعة على ظهرها. باستخدام طرف تحميل دقيق ، قم بإزالة AH-KROHS الإضافي للحفاظ على أنحف طبقة AH-KROHS ممكنة.بمجرد أن تصلب AH-KROHS ، أضف 2.5 ملليلتر من وسيط التصوير. بالنسبة للتصوير الحي في الجسم الحي ، لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية ، ضع طبق التصوير بالفيديو الذي يحتوي على يرقات AH-KROHS المطعمة بالأشعة السينية المضمنة في الغرفة البيئية لمجهر متحد البؤر مقلوب مع درجة حرارة محددة عند 32 درجة مئوية. ابحث عن اليرقات في طبق تصوير الفيديو بهدف 10x باستخدام مرحلة XY الآلية.اضغط على الهروب لخفض برج الأهداف وإضافة الزيت المعدني على هدف زيت 60x ، واضغط على الهروب للعودة إلى الوضع البؤري الأولي. راقب خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية في القناة الحمراء المحددة على مصدر ليزر 561 نانومتر ، وطاقة ليزر 20٪ ، وتعرض زمني يبلغ 200 مللي ثانية. ثم حدد خلية ذات شبكة أنابيب دقيقة منتشرة وخيوط الأنابيب الدقيقة التي يمكن تمييزها بسهولة.اضبط إعدادات السلسلة Z. باستخدام مرحلة بيزو بنطاق 200 ميكرومتر ، حدد المواضع العلوية والسفلية لشبكة الأنابيب الدقيقة حيث يكفي مكدس Z بعمق 10 إلى 30 ميكرومتر لتصور الشبكة الميكروبية في نتوء الخلية المهاجرة بخطوة شريحة Z تبلغ 0.3 ميكرومتر. اضبط إعدادات اكتساب الفاصل الزمني للسماح بالتوازن الأمثل بين سرعة الاكتساب وعمق Z-stack وإشارة الفلورسنت لتجنب التبييض السريع للصور.الحصول على صور من الأنابيب الدقيقة كل خمس إلى 10 ثوان لعدة دقائق وحفظ 5D hyper-stack. تم قياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة عن طريق بناء كيموغراف على طول الأنابيب الدقيقة المتنامية والمتقلصة وتتبع حواف الأنابيب الدقيقة الفردية يدويا بمرور الوقت. تم تقييم العلاج الدوائي الذي يتم إعطاؤه في وسط اليرقة وتأثيره العكسي على تنظيم شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال العلاج بجرعة 200 نانومولار من نوكودازول.أدى ذلك إلى انكماش تدريجي لشبكة الأنابيب الدقيقة واختفاء نتوء خلايا الورم الأرومي الدبقي بعد أربع ساعات. غسل الدواء استعادة قدرة خلايا الورم الأرومي الدبقي لتشكيل نتوءات. استأنفت الخلايا الهجرة على طول الأوعية الدموية بعد 12 ساعة من الغسل مما يشير إلى أن جرعة 200 نانومول من نوكودازول كانت كافية لتعطيل شبكة الأنابيب الدقيقة ومنع غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي في الجسم الحي بسرعة.كشف تحليل لمدة ثلاثة أيام لنفس العلاج على غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي العالمي أن نوكودازول أوقف غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي على المدى الطويل في الجسم الحي دون التأثير على الصحة العامة للأسماك مقارنة بالسيطرة. تذكر أن تبدأ بثلاثة أيام صحية بعد الإخصاب من اليرقات لتركيز الخلايا في الشعيرات الدموية ، لتقليل الحجم المحقون في الدماغ ، وتشكيل كتلة ورم فريدة ، ومحاولة تجنب الحقن في البطينين الدماغيين.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...