Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Vi er meget taknemmelige for Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrig) og hans laboratorium, især Valérie Briolat og Emma Colucci-Guyon for at give os zebrafisklinjerne og plastformen til mikroinjektionsplader og for deres værdifulde ekspertise om zebrafiskeksperimentelle procedurer. Vi anerkender taknemmeligt UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, støttet af det franske nationale forskningsagentur France BioImaging og ANR-10-INBS-04; Investeringer for fremtiden). Dette arbejde blev støttet af Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Pasteur og ved generøse donationer fra fru Marguerite MICHEL og hr. Porquet.

Dyreforsøg blev udført i henhold til EU's retningslinjer for håndtering af forsøgsdyr. Alle protokoller blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved Institut Pasteur - CEEA 89 og det franske ministerium for forskning og uddannelse (tilladelse #01265.03). Under injektioner eller levende billeddannelsessessioner blev dyr bedøvet med Tricaine.At slutningen af de eksperimentelle procedurer, de blev aflivet ved bedøvelsesoverdosis. Se materialeoversigten for detaljer relateret til materialer,...

Imaging tumor xenografts ved enkeltcelleopløsning vil sandsynligvis blive et uundværligt værktøj til at forbedre vores forståelse af GBM-biologi. Live imaging i PDX-modeller til mus har ført til værdifulde opdagelser om, hvordan GBM kollektivt invaderer hjernevævet18. Til dato er den spatiotemporale opløsning imidlertid ikke høj nok til at afsløre dynamikken i proteiner, der styrer GBM-invasion. Vi ræsonnerede, at ved at koble den ortopiske indpodning af GBM-celler i gennemsigtige zebr...

Cellemotilitet er en stereotyp proces, der kræver polaritetsakse etablering og kraftgenererende cytoskeletale omlejringer. Actinpolymerisation og dets tilknytning til myosin anerkendes som de vigtigste bidragydere til påtrængende og kontraktile kræfter, der kræves til cellebevægelse1. Mikrotubuli anses for at være hovedaktørerne i cellepolarisering og retningsbestemt vedholdenhed under migration2. I de senere år har MT'er også vist sig at skabe og stabilisere fremspring for at understøtte mekanokompressive kræfter under celleinvasion i 3D3. For nylig har MT'er været direkte involveret i mekanotransduktion ved fokale adhæsioner og mekanosensitiv migration4. Den dynamiske ustabilitet, der karakteriserer MT-plus-slutdynamikken, er lavet af gentagne faser af polymerisation (vækst) og depolymerisering (krympning), som styres af en overflod af mikrotubulibindende proteiner og intracellulære signalkaskader, såsom dem, der styres af RHO-GTPases 5,6,7. MT-netværkets rolle i cellemigration og invasion har gjort undersøgelsen af MT-dynamik til et nøgleelement for bedre at forstå mekanismerne for immuncellehoming, sårheling og kræftinvasion.
Kræftcellernes evne til at undslippe den primære tumorkerne, sprede sig i vævene og generere sekundære tumorer er et kritisk skridt i at forhindre global succes i krigen mod kræft erklæret for 50 år siden 8,9. En af de største forhindringer har været at forstå, hvordan kræftceller aktivt invaderer vævet. Nøgleinvasionsmekanismer er afhængige af de samme principper som dem, der styrer ikke-tumorcellemigration10. Imidlertid er der opstået specificiteter ved kræftcellemigration11, hvilket udløser behovet for bedre karakterisering af denne type migration. Specifikt, fordi tumormikromiljøet fremstår som en nøglespiller i kræftprogression12, er observation og analyse af kræftcelleinvasion i en relevant fysiologisk sammenhæng afgørende for at optrævle mekanismerne for kræftcelleformidling.
MT'er er centrale for kræftprogression for at opretholde både spredning og invasion. Præcis analyse af MT-dynamikken in situ kan hjælpe med at identificere MTA-ændrende midler (MTA) i begge processer. MT-dynamikken varierer drastisk ved en ændring i miljøet. In vitro forhindrer behandling med MT-destabiliserende midler såsom nocodazol cellefremspringsdannelse, når celler er indlejret i geler i 3D, mens det har ringe effekt på 2D-cellemigration13,14. Selvom det er teknisk udfordrende, tillader fremskridt inden for intravital billeddannelse in vivo-analyse af MT-dynamik under kræftcelleinvasion. For eksempel afslørede observationen af MT'er i subkutant xenograferede fibrosarkomceller hos mus, at tumorassocierede makrofager påvirker MT-dynamikken i tumorceller15. Disse musemodeller involverer imidlertid omfattende kirurgiske procedurer og forbliver utilfredsstillende for mindre tilgængelige kræftformer, såsom den meget invasive hjernetumor, GBM.
På trods af en dyster 15 måneders gennemsnitlig overlevelsestid16, er der lidt kendt om GBM's formidlingsmåde inden for hjernens parenchyma eller de vigtigste molekylære elementer, der opretholder GBM-celleinvasion i hjernevævet. Forbedring af musens ortopiske xenograft (PDX) -model og etablering af kranialvinduer gav nye udsigter til GBM-celleinvasionsundersøgelser17,18. På grund af suboptimal billeddannelseskvalitet har denne model imidlertid for det meste tilladt langsgående billeddannelse af overfladiske xenotransplantater og er ikke blevet brugt med succes til at studere subcellulær billeddannelse af cytoskeletproteiner hidtil. I kølvandet på "3R"-påbuddet om at reducere brugen af gnavere og erstatte dem med lavere hvirveldyr er der desuden etableret alternative modeller.
Ved at udnytte den primitive immunitet, der blev observeret i zebrafisk (Danio rerio) larver, blev ortopisk injektion af GBM-celler i fiskehjernen udviklet 19,20,21. Injektion i nærheden af ventriklerne i den udviklende mellemhjerne rekapitulerer det meste af human GBM-patofysiologi21, og det samme foretrukne mønster af GBM-invasion som hos mennesker-kar-co-option-observeres22. Takket være gennemsigtigheden af fiskelarverne tillader denne model visualisering af GBM-celler, der invaderer hjernen fra de peri-ventrikulære områder, hvor de fleste GBM'er menes at opstå23.
Fordi MT'er er afgørende for GBM-celleinvasion in vitro24,25, er der behov for en bedre karakterisering af MT-dynamik og identifikation af nøgleregulatorer under celleinvasion. Til dato har de data, der genereres med zebrafiskens ortopiske model, imidlertid ikke inkluderet subcellulær analyse af MT-dynamik under invasionsprocessen. Dette papir giver en protokol til at studere MT-dynamik in vivo og bestemme dens rolle under hjernekræft invasion. Efter stabil mikrotubulimærkning mikroinjiceres GBM-celler ved 3 dpf i zebrafisklarvers hjerner og afbildes i realtid ved høj spatio-temporal opløsning under deres progression i hjernevævet. Live billeddannelse af fluorescerende MT'er muliggør kvalitativ og kvantitativ analyse af MT plus-end dynamik. Desuden gør denne model det muligt at vurdere effekten af MTA'er på MT-dynamik og på GBM-cellernes invasive egenskaber i realtid. Denne relativt ikke-invasive protokol kombineret med et stort antal larver, der håndteres ad gangen, og den lette anvendelse af lægemidler (i fiskevandet) gør modellen til et aktiv til præklinisk test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Med en dyster median overlevelsestid i reelle populationer - mellem 6 og 15 måneder - er glioblastom (GBM) den mest ødelæggende maligne hjernetumor. Behandlingssvigt skyldes hovedsageligt invasiviteten af GBM-celler, hvilket taler for behovet for en bedre forståelse af GBM-bevægelige egenskaber. For at undersøge den molekylære mekanisme, der understøtter GBM-invasion, kræves nye fysiologiske modeller, der muliggør dybdegående karakterisering af proteindynamikken under invasion. Disse observationer ville bane vejen for opdagelsen af nye mål for at blokere tumorinfiltration og forbedre patientresultaterne. Dette papir rapporterer, hvordan en ortotopisk xenograft af GBM-celler i zebrafiskhjernen tillader subcellulær intravital levende billeddannelse. Med fokus på mikrotubuli (MT'er) beskriver vi en procedure for MT-mærkning i GBM-celler, mikroinjektion af GBM-celler i den gennemsigtige hjerne 3 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisklarver, intravital billeddannelse af MT'er i de formidlende xenografts, ændring af MT-dynamik for at vurdere deres rolle under GBM-invasion og analyse af de erhvervede data.

For at analysere den rolle, som MT'er spiller under in vivo GBM-invasion, beskriver vi her de vigtigste trin til at udføre stabil MT-mærkning i GBM-celler ved lentiviral infektion, ortopisk xenotransplantation af GBM-celler i 3 dpf zebrafisklarver, højopløsnings intravital billeddannelse af MT-dynamik, MTA-behandling og dens virkninger på GBM-invasion og billedanalyse af MT-dynamik og in vivo-invasion (figur 1). MT-dynamikken måles enten ved at bygge...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Vi rapporterer en teknik, der tillader levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i glioblastom (GBM) celler, der invaderer et hvirveldyrs hjernevæv. Kobling af den ortopiske injektion af fluorescerende mærkede GBM-celler til en gennemsigtig zebrafiskhjerne med intravital billeddannelse med høj opløsning muliggør måling af cytoskeletdynamik under in situ kræftinvasion.

Levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i glioblastomceller, der invaderer zebrafiskhjernen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Denne metode er dedikeret til undersøgelsen af mikrotubuli rolle under hjernekræft invasion ved at koble den atopiske injektion af hjernekræftcelle i zebrafisk til den subcellulære intravitale billeddannelse. Den største fordel ved teknikken ligger i den høje rumlige tidsmæssige opløsning, hvor mikrotubuluscytoskelettet erhverves. Det er unikt for in vivo hjernekræft invasion modeller, og det tillader dybdegående mikrotubuli dynamik analyse.Den subcellulære billeddannelse af in situ hjernekræftcelleinvasion kan bruges til analyse af ethvert protein af interesse, der potentielt er involveret i kræftinvasion. Til at begynde med vaskes glioblastomcellerne dyrket ved 37 grader Celsius med PBS. Afmonter cellerne ved at tilsætte en milliliter 0,05% Trypsin EDTA og inkubere i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius i celleinkubatoren, indtil alle cellerne er helt løsrevet.Resuspender cellerne i fem milliliter komplet glioblastomcellemedium i et 50 ml centrifugerør. Der tilsættes 45 ml iskold PBS og centrifuge ved 134 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og suspender cellerne med en milliliter iskold PBS ved at pipettere grundigt op og ned.Der tilsættes yderligere 49 ml iskold PBS og centrifuge ved 134 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og suspender cellerne i 200 mikroliter iskold PBS. Opbevares på is i løbet af transplantationsproceduren.For at mikroinjicere glioblastomcellerne i zebrafisklarvernes midthjerne skal du fylde en mikroinjektionsstøbt plade med seks milliliter E3-medium suppleret med 160 milligram pr. Liter tricain. Overfør et dusin DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED larver til mikroinjektionspladen. Når larven er bedøvet og helt reagerer for at røre ved hinanden, justeres dem i skyttegravene på deres side, hovedet op og æggeblommesækken skubbet mod grøftens væg med en pensel i størrelse 00.Læg derefter fem mikroliter glioblastomceller i mikrokapillæren ved hjælp af mikrobelastningsspidser og indsæt kapillæren i den universelle kapillærholder. Placer mikroinjektionspladen indeholdende de bedøvede larver på stereomikroskopstadiet. Placer spidsen af mikrokapillæren på kanten af mikroinjektionspladen ved hjælp af mikromanipulatorknapperne.Bryd det derefter med en skalpel for at skabe et skarpt indgangspunkt omtrent på størrelse med diameteren af en celle. Kontroller, at celler strømmer ud af kapillæren ved forsigtigt at køre olie i mikroinjektoren og kaste spidsen af nålen ind i mediet. Koncentrer cellerne ved spidsen af kapillæren for at maksimere antallet af celler injiceret pr. Injiceret volumen og undgå at fylde hjernevævet med PBS.Undersøg omhyggeligt cellerne, der kommer ud af mikrokapillæren, da olie manuelt indføres i injektoren. Definer empirisk antallet af drejninger, der er nødvendige på den manuelle knap for at levere 20 til 50 celler. Typisk, hvis celler er koncentreret nok, er en blid drejning nok til at skubbe ca. 10 celler ud.Gå ind i spidsen af kapillæren mod venstre optiske tectum lige over den midterste hjernevene. Tryk forsigtigt kapillæren mod larverne, indtil hudmembranen går i stykker. Når en passende position i det optiske tectum er nået, skal du skubbe cellerne ud.Overhold omhyggeligt spidsen af kapillæren for at visualisere strømmen af celler, der går ind i dyret og derved sikrer en vellykket injektion. Gentag proceduren for så mange dyr som nødvendigt. Afhængigt af hvor hurtig eksperimentatoren er til at injicere, kan der være behov for et nåleskift hver 10. til 20. larve på grund af hurtig celleklumpning i kapillæren.Når xenotransplantationen er afsluttet, skal larven fjernes fra mikroinjektionspladen og udpeges i en 24 brøndplade fyldt med mineralkildevand PTU og methylenblåt medium. Forbered en 1% lavsmeltende AH-KROH-opløsning. Overfør 500 mikroliter kogt 1% lavsmeltende AH-KROH-opløsning til et 1,5 ml centrifugerør, og lad det køle af ved 37 grader Celsius på en varmeblok.Tilsæt 160 mikrogram pr. liter tricain til AH-KROHS og bland godt. Overfør en til fire xenografted larver til en 3,5 centimeter petriskål fyldt med mineralsk kildevand PTU og methylenmedium suppleret med 160 mikrogram pr. Liter tricain. Når larven er bedøvet og helt reagerer på berøring, overføres de forsigtigt til røret, der indeholder AH-KROHS og tricaine ved hjælp af en fin spidsoverførselspipette.Bland forsigtigt larven med AH-KROHS. Ved hjælp af en stor pæreoverførselspipette placeres larverne blandet i AH-KROHS på midten af en glasbundet 3,5 centimeter videobilleddannelsesskål Under et stereomikroskop placeres larverne hurtigt på ryggen. Brug en mikrobelastningsspids til at fjerne ekstra AH-KROHS for at opretholde det tyndest mulige AH-KROHS-lag.Når AH-KROHS er størknet, tilsættes 2,5 ml billeddannende medium. Til in vivo live imaging, af mikrotubulusdynamik i invaderende glioblastomceller, skal du placere videobilleddannelsesskålen indeholdende AH-KROHS indlejrede xenograferede larver i miljøkammeret i et omvendt konfokalt mikroskop med en temperatur indstillet til 32 grader Celsius. Find larverne i videobilledskålen med et 10x mål ved hjælp af et motoriseret XY-trin.Tryk på escape for at sænke måltårnet og tilføje mineralolie på et 60x oliemål, og tryk på escape for at gå tilbage til den oprindelige fokusposition. Overhold de invaderende glioblastomceller i den røde kanal indstillet til 561 nanometer laserkilde, 20% lasereffekt og en tidseksponering på 200 millisekunder. Vælg derefter en celle med et spredt mikrotubulusnetværk og let skelnelige mikrotubulusfilamenter.Indstil Z-seriens indstillinger. Ved hjælp af et piezo-trin på 200 mikrometer skal du vælge de øverste og nederste positioner af mikrotubulinetværket, hvor en 10 til 30 mikrometer dyb Z-stak er nok til at visualisere det mikrobielle netværk i fremspringet af den migrerende celle med et Z-skivetrin på 0,3 mikrometer. Indstil indstillinger for timelapse-optagelse for at muliggøre en optimal balance mellem anskaffelseshastighed, Z-stackdybde og fluorescerende signal for at undgå hurtig fotoblegning.Få billeder af mikrotubuli hvert femte til 10. sekund i flere minutter, og gem 5D-hyperstakken. Mikrotubulusdynamikken blev målt ved at bygge kymograf langs voksende og krympende mikrotubuli og manuelt spore individuelle mikrotubuluskanter over tid. Lægemiddelbehandling administreret i larvemediet og dets reversible virkning på mikrotubuli netværksorganisation blev vurderet ved behandling med en 200 nanomolær dosis nocodazol.Dette førte til progressiv krympning af mikrotubulusnetværket og forsvinden af glioblastomcellefremspring efter fire timer. Udvaskning af lægemidlet genoprettede glioblastomcellernes kapacitet til at danne fremspring. Cellerne genoptog migrering langs vaskulaturen 12 timer efter udvaskningen, hvilket indikerer, at en 200 nanomol dosis nocodazol var tilstrækkelig til at forstyrre mikrotubulusnetværket og hurtigt blokere in vivo glioblastom celleinvasion.En tre dage lang analyse af den samme behandling på global glioblastomcelleinvasion afslørede, at nocodazol stoppede langvarig glioblastomcelleinvasion in vivo uden at påvirke fiskens generelle sundhed sammenlignet med en kontrol. Husk at starte med sunde tre dage efter befrugtning larver for at koncentrere cellerne i kapillæren, for at minimere volumenet injiceret i hjernen og for at danne en unik tumormasse og forsøge at undgå injektion i hjernens ventrikler.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging af proteinaggregering i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering af G3BP Stress Granulat Dynamics i Live primære celler

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...