Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

We zijn Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrijk) en zijn laboratorium, in het bijzonder Valérie Briolat, en Emma Colucci-Guyon zeer dankbaar voor het leveren van de zebravislijnen en de plastic mal voor micro-injectieplaten, en voor hun waardevolle expertise over experimentele procedures voor zebravissen. We bedanken dankbaar de UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, ondersteund door het Franse nationale onderzoeksbureau France BioImaging, en ANR-10-INBS-04; Investeringen voor de toekomst). Dit werk werd ondersteund door de Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), het Centre National de la Recherche Scientifique, en Institut Pasteur en door de gulle giften van mevrouw Marguerite MICHEL en de heer Porquet.

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor het omgaan met proefdieren. Alle protocollen zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van het Institut Pasteur - CEEA 89 en het Franse Ministerie van Onderzoek en Onderwijs (vergunning #01265.03). Tijdens injecties of live beeldvormingssessies werden dieren verdoofd met Tricaine.At het einde van de experimentele procedures werden ze geëuthanaseerd door een overdosis anestheticum. Zie de tabel met materialen</strong...

Het in beeld brengen van tumor xenografts met eencellige resolutie zal waarschijnlijk een onmisbaar hulpmiddel worden om ons begrip van GBM-biologie te verbeteren. Live beeldvorming in PDX-modellen van muizen heeft geleid tot waardevolle ontdekkingen over hoe GBM collectief het hersenweefsel binnendringt18. Tot op heden is de spatiotemporale resolutie echter niet hoog genoeg om de dynamiek van eiwitten die de GBM-invasie beheersen te onthullen. We redeneerden dat door de orthotopische engrafting v...

Celmotiliteit is een stereotiep proces dat polariteitsasvorming en krachtgenererende cytoskeletale herschikkingen vereist. Actinepolymerisatie en de associatie met myosine worden erkend als de belangrijkste bijdragen aan uitsteek- en contractiele krachten die nodig zijn voor celbeweging1. Microtubuli worden beschouwd als de belangrijkste actoren in celpolarisatie en directionele persistentie tijdens migratie2. In de afgelopen jaren is ook aangetoond dat MT's uitsteeksels creëren en stabiliseren om mechanocompressieve krachten te ondersteunen tijdens celinvasie in 3D3. Meer recent zijn MT's direct betrokken geweest bij mechanotransductie bij focale verklevingen en mechanosensitive migration4. De dynamische instabiliteit die MT-plus einddynamica kenmerkt, bestaat uit herhaalde fasen van polymerisatie (groei) en depolymerisatie (krimp), die worden gecontroleerd door een overvloed aan microtubule-bindende eiwitten en intracellulaire signaleringscascades, zoals die worden geregeld door RHO-GTPases 5,6,7. De rol van het MT-netwerk in celmigratie en invasie heeft het onderzoek naar MT-dynamiek tot een belangrijk element gemaakt om de mechanismen van immuuncel homing, wondgenezing en kankerinvasie beter te begrijpen.
Het vermogen van kankercellen om te ontsnappen aan de primaire tumorkern, zich te verspreiden in de weefsels en secundaire tumoren te genereren, is een cruciale stap in het voorkomen van wereldwijd succes in de oorlog tegen kanker die 50 jaar geleden 8,9 werd verklaard. Een van de grootste obstakels is het begrijpen hoe kankercellen actief het weefsel binnendringen. Belangrijke invasiemechanismen vertrouwen op dezelfde principes als die voor niet-tumorachtige celmigratie10. Er zijn echter specifieke kenmerken van kankercelmigratie naar vorengekomen 11, waardoor de behoefte aan een betere karakterisering van dit type migratie is ontstaan. In het bijzonder, omdat de tumormicro-omgeving verschijnt als een belangrijke speler in kankerprogressie12, is het observeren en analyseren van kankercelinvasie in een relevante fysiologische context essentieel om de mechanismen van kankercelverspreiding te ontrafelen.
MT's staan centraal in de progressie van kanker, om zowel proliferatie als invasie in stand te houden. Nauwkeurige analyse van MT-dynamica in situ kan helpen bij het identificeren van MT-veranderende agentia (MTA) in beide processen. MT-dynamiek varieert drastisch bij een verandering in de omgeving. In vitro voorkomt behandeling met MT-destabiliserende middelen zoals nocodazol de vorming van celuitsteeksels wanneer cellen zijn ingebed in gels in 3D, terwijl het weinig effect heeft op 2D-celmigratie13,14. Hoewel technisch uitdagend, maakt vooruitgang in intravitale beeldvorming in vivo analyse van MT-dynamiek tijdens invasie van kankercellen mogelijk. De observatie van MT's in subcutaan xenogetransplanteerde fibrosarcoomcellen bij muizen onthulde bijvoorbeeld dat tumor-geassocieerde macrofagen de MT-dynamiek in tumorcellen beïnvloeden15. Deze muismodellen omvatten echter uitgebreide chirurgische procedures en blijven onbevredigend voor minder toegankelijke kankers, zoals de zeer invasieve hersentumor GBM.
Ondanks een sombere gemiddelde overlevingstijd van15 maanden 16, is er weinig bekend over de verspreidingswijze van GBM in het hersenparenchym of de belangrijkste moleculaire elementen die GBM-celinvasie in het hersenweefsel ondersteunen. Verbetering van het muis orthotopisch xenograft (PDX) model en de oprichting van schedelvensters boden nieuwe perspectieven voor GBM celinvasiestudies17,18. Vanwege de suboptimale beeldvormingskwaliteit heeft dit model echter meestal longitudinale beeldvorming van oppervlakkige xenografts mogelijk gemaakt en is het tot nu toe niet met succes gebruikt om subcellulaire beeldvorming van cytoskeleteiwitten te bestuderen. Bovendien zijn in de nasleep van het "3Rs" -bevel om het gebruik van knaagdieren te verminderen en te vervangen door lagere gewervelde dieren, alternatieve modellen opgesteld.
Gebruikmakend van de primitieve immuniteit waargenomen bij zebravis (Danio rerio) larven, werd orthotopische injectie van GBM-cellen in het visbrein ontwikkeld 19,20,21. Injectie in de buurt van de ventrikels in de zich ontwikkelende middenhersenenvatvatting het grootste deel van de menselijke GBM-pathofysiologie21, en hetzelfde voorkeurspatroon van GBM-invasie als bij menselijke co-optie wordt waargenomen22. Dankzij de transparantie van de vislarven maakt dit model de visualisatie mogelijk van GBM-cellen die de hersenen binnendringen vanuit de peri-ventriculaire gebieden waar de meeste GBM's worden verondersteld te ontstaan23.
Omdat MT's essentieel zijn voor GBM-celinvasie in vitro24,25, is een betere karakterisering van MT-dynamica en de identificatie van belangrijke regulatoren tijdens celinvasie nodig. Tot op heden hebben de gegevens die zijn gegenereerd met het orthotopische model van zebravissen echter geen subcellulaire analyse van MT-dynamiek tijdens het invasieproces opgenomen. Dit artikel biedt een protocol om MT-dynamiek in vivo te bestuderen en de rol ervan tijdens de invasie van hersenkanker te bepalen. Na stabiele microtubule-etikettering worden GBM-cellen micro geïnjecteerd met 3 dpf in de hersenen van zebravislarven en in realtime in beeld gebracht met een hoge spatio-temporele resolutie tijdens hun progressie in het hersenweefsel. Live beeldvorming van fluorescerende MT's maakt de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van MT plus-end dynamica mogelijk. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het effect van MTA's op MT-dynamica en op de invasieve eigenschappen van GBM-cellen in realtime te beoordelen. Dit relatief niet-invasieve protocol in combinatie met een groot aantal larven dat tegelijkertijd wordt behandeld en het gemak van medicijntoepassing (in het viswater) maakt het model een aanwinst voor preklinisch testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Met een sombere mediane overlevingstijd in echte populaties - tussen 6 en 15 maanden - is glioblastoom (GBM) de meest verwoestende kwaadaardige hersentumor. Falen van de behandeling is voornamelijk te wijten aan de invasiviteit van GBM-cellen, wat spreekt voor de behoefte aan een beter begrip van GBM-beweeglijke eigenschappen. Om het moleculaire mechanisme ter ondersteuning van GBM-invasie te onderzoeken, zijn nieuwe fysiologische modellen nodig die een diepgaande karakterisering van eiwitdynamiek tijdens de invasie mogelijk maken. Deze observaties zouden de weg vrijmaken voor de ontdekking van nieuwe doelen om tumorinfiltratie te blokkeren en de resultaten voor patiënten te verbeteren. Dit artikel meldt hoe een orthotopisch xenograft van GBM-cellen in de hersenen van zebravissen subcellulaire intravitale live beeldvorming mogelijk maakt. Gericht op microtubuli (MT's), beschrijven we een procedure voor MT-etikettering in GBM-cellen, micro-injectie van GBM-cellen in de transparante hersenen van 3 dagen na bevruchting (dpf) zebravislarven, intravitale beeldvorming van MT's in de verspreidende xenografts, het veranderen van MT-dynamiek om hun rol tijdens GBM-invasie te beoordelen en het analyseren van de verkregen gegevens.

Om de rol van MT's tijdens in vivo GBM-invasie te analyseren, beschrijven we hier de belangrijkste stappen om stabiele MT-etikettering in GBM-cellen uit te voeren door lentivirale infectie, orthotopische xenotransplantatie van GBM-cellen in 3 dpf zebravislarven, intravitale beeldvorming met hoge resolutie van MT-dynamiek, MTA-behandeling en de effecten ervan op GBM-invasie, en beeldanalyse van MT-dynamiek en in vivo invasie (figuur 1). MT-dynamiek wordt ge...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Deze methode is gewijd aan het onderzoek naar de rol van microtubuli tijdens de invasie van hersenkanker door de atopische injectie van hersenkankercellen in zebravissen te koppelen aan de subcellulaire intravitale beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van de techniek ligt in de hoge ruimtelijke temporele resolutie waarbij het microtubulicytoskelet wordt verkregen. Het is uniek voor in vivo invasiemodellen voor hersenkanker en het maakt diepgaande microtubule dynamica-analyse mogelijk.De subcellulaire beeldvorming van in situ hersenkankercelinvasie kan worden gebruikt voor de analyse van elk eiwit dat mogelijk betrokken is bij kankerinvasie. Om te beginnen, was de glioblastoomcellen gekweekt op 37 graden Celsius met PBS. Maak de cellen los door één milliliter van 0,05% Trypsine EDTA toe te voegen en gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius in de celincubator te broeden totdat alle cellen volledig zijn losgemaakt.Resuspendeer de cellen in vijf milliliter volledig glioblastoomcelmedium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg 45 milliliter ijskoude PBS toe en centrifugeer gedurende vijf minuten op 134 maal G. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen met één milliliter ijskoude PBS door grondig op en neer te pipetteren.Voeg nog eens 49 milliliter ijskoude PBS toe en centrifugeer gedurende vijf minuten op 134 maal G. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 200 microliter ijskoude PBS. Bewaar op ijs voor de duur van de transplantatieprocedure.Om de glioblastoomcellen micro-injecteren in de middenhersenen van de zebravislarven, vult u een micro-injectie gegoten plaat met zes milliliter E3-medium aangevuld met 160 milligram per liter tricaïne. Breng een dozijn DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED larven over in de micro-injectieplaat. Zodra de larve verdoofd is en volledig niet reageert om ze aan te raken, lijn ze uit in de loopgraven op hun zij, hoofd omhoog en de dooierzak tegen de muur van de geul geduwd met een verfkwast van maat 00.Laad vervolgens vijf microliter glioblastoomcellen in het microcapillair met behulp van microloadingtips en plaats het capillair in de universele capillaire houder. Plaats de micro-injectieplaat met de verdoofde larven op het stereomicroscoopstadium. Plaats de punt van het microcapillair op de rand van de micro-injectieplaat met behulp van de micromanipulatorknoppen.Breek het vervolgens met een scalpel om een scherp toegangspunt te creëren dat ongeveer zo groot is als de diameter van een cel. Controleer of cellen uit het capillair stromen door de olie voorzichtig in de micro-injector te laten lopen en de punt van de naald in het medium te steken. Concentreer de cellen aan de punt van het capillair om het aantal geïnjecteerde cellen per geïnjecteerd volume te maximaliseren en te voorkomen dat het hersenweefsel met PBS wordt gevuld.Onderzoek zorgvuldig de cellen die uit het microcapillair komen terwijl olie handmatig in de injector wordt ingebracht. Definieer empirisch het aantal omwentelingen dat nodig is op de handmatige knop om 20 tot 50 cellen te leveren. Typisch, als cellen voldoende geconcentreerd zijn, is één zachte draai voldoende om ongeveer 10 cellen uit te werpen.Benader de punt van het capillair tegen het linker optische tectum net boven de middelste hersenader. Druk het capillair voorzichtig tegen de larven totdat het huidmembraan breekt. Zodra een geschikte positie in het optische tectum is bereikt, werpt u de cellen uit.Observeer zorgvuldig de punt van het capillair om de stroom cellen in het dier te visualiseren, waardoor een succesvolle injectie wordt gegarandeerd. Herhaal de procedure voor zoveel dieren als nodig is. Afhankelijk van hoe snel de experimentator is bij het injecteren, kan een verandering van naald elke 10 tot 20 larven nodig zijn als gevolg van snelle celklontering in het capillair.Zodra de xenotransplantatie is voltooid, verwijdert u de larve van de micro-injectieplaat en selecteert u ze in een 24-putplaat gevuld met mineraalwater PTU en methyleenblauw medium. Bereid een 1% laag smeltende AH-KROH oplossing. Breng 500 microliter gekookte 1% laagsmeltende AH-KROH-oplossing over naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter en laat deze afkoelen bij 37 graden Celsius op een hitteblok.voeg 160 microgram per liter tricaïne toe aan de AH-KROHS en meng goed. Breng één tot vier xenogetransplanteerde larven over in een petrischaaltje van 3,5 centimeter gevuld met mineraalwater PTU en methyleenmedium aangevuld met 160 microgram per liter tricaïne. Zodra de larve verdoofd is en volledig niet reageert op aanraking, breng ze dan voorzichtig over in de buis met de AH-KROHS en tricaine met behulp van een fijne tip transfer pipet.Meng de larve voorzichtig met de AH-KROHS. Plaats met behulp van een grote lamptransferpipet de larven gemengd in de AH-KROHS op het midden van een videobeeldschotel met glazen bodem van 3,5 centimeter Onder een stereomicroscoop plaatst u de larven snel op zijn rug. Verwijder met behulp van een microlaadpunt extra AH-KROHS om de dunst mogelijke AH-KROHS-laag te behouden.Zodra AH-KROHS is gestold, voegt u 2,5 milliliter beeldvormend medium toe. Voor de in vivo live beeldvorming, van microtubule dynamiek in binnendringende glioblastoomcellen, plaatst u de videobeeldvormingsschaal met de AH-KROHS ingebedde xenogetransplanteerde larven in de omgevingskamer van een omgekeerde confocale microscoop met een temperatuur ingesteld op 32 graden Celsius. Vind de larven in de videobeeldvormingsschaal met een 10x-objectief met behulp van een gemotoriseerd XY-stadium.Druk op escape om de geschutskoepel te verlagen en voeg minerale olie toe aan een 60x olieobjectief, en druk op escape om terug te gaan naar de oorspronkelijke brandpuntspositie. Observeer de binnendringende glioblastoomcellen in het rode kanaal op 561 nanometer laserbron, 20% laservermogen en een tijdblootstelling van 200 milliseconden. Selecteer vervolgens een cel met een uitgespreid microtubule-netwerk en gemakkelijk te onderscheiden microtubule-filamenten.Stel de instellingen van de Z-serie in. Selecteer met behulp van een piëzo-fase met een bereik van 200 micrometer de bovenste en onderste posities van het microtubule-netwerk waar een 10 tot 30 micrometer diepe Z-stack voldoende is om het microbiële netwerk in het uitsteeksel van de migrerende cel te visualiseren met een Z-slicestap van 0,3 micrometer. Stel timelapse-acquisitie-instellingen in om een optimale balans mogelijk te maken tussen de snelheid van acquisitie, Z-stack-diepte en fluorescerend signaal om snel bleken van foto's te voorkomen.Verkrijg gedurende enkele minuten elke vijf tot 10 seconden afbeeldingen van de microtubuli en sla de 5D-hyperstack op. De microtubuledynamiek werd gemeten door kymograaf te bouwen langs groeiende en krimpende microtubuli en handmatig individuele microtubuliranden in de loop van de tijd te volgen. Medicamenteuze behandeling toegediend in het larvemedium en het omkeerbare effect ervan op de netwerkorganisatie van microtubuli werd beoordeeld door behandeling met een dosis nocodazol van 200 nanomolair.Dit leidde tot progressieve krimp van het microtubulinetwerk en het verdwijnen van glioblastoomceluitsteeksel na vier uur. Het uitwassen van het medicijn herstelde de capaciteit van glioblastoomcellen om uitsteeksels te vormen. De cellen hervatten de migratie langs de vasculatuur 12 uur na de uitspoeling, wat aangeeft dat een dosering van 200 nanomol nocodazol voldoende was om het microtubulinetwerk te verstoren en de in vivo glioblastoomcelinvasie snel te blokkeren.Een drie dagen durende analyse van dezelfde behandeling op wereldwijde glioblastoomcelinvasie onthulde dat het nocodazol de invasie van glioblastoomcellen op lange termijn in vivo stopte zonder de algemene gezondheid van de vissen te beïnvloeden in vergelijking met een controle. Vergeet niet om te beginnen met gezonde larven drie dagen na de bevruchting om de cellen in het capillair te concentreren, om het geïnjecteerde volume in de hersenen te minimaliseren en om een unieke tumormassa te vormen, en probeer te voorkomen dat het in de hersenventrikels wordt geïnjecteerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...