Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Nous sommes extrêmement reconnaissants au Dr P. Herbomel (Institut Pasteur, France) et à son laboratoire, en particulier Valérie Briolat et Emma Colucci-Guyon de nous avoir fourni les lignes de poisson zèbre et le moule en plastique pour les plaques de micro-injection, et pour leur précieuse expertise sur les procédures expérimentales du poisson zèbre. Nous remercions l’UtechS Photonic BioImaging (C2RT), Institut Pasteur, soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche France BioImaging Français, et ANR-10-INBS-04 ; investissements pour l’avenir). Ce travail a été soutenu par la Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), le Centre National de la Recherche Scientifique, et l’Institut Pasteur et par les généreux dons de Mme Marguerite MICHEL et M. Porquet.

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives de l’Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale de l’Institut Pasteur - CEEA 89 et le ministère Français de la Recherche et de l’Éducation (permis #01265.03). Lors d’injections ou de séances d’imagerie en direct, les animaux ont été anesthésiés Tricaine.At la fin des procédures expérimentales, ils ...

L’imagerie des xénogreffes tumorales à une résolution unicellulaire est susceptible de devenir un outil indispensable pour améliorer notre compréhension de la biologie du GBM. L’imagerie en direct dans des modèles PDX murins a conduit à des découvertes précieuses sur la façon dont le GBM envahit collectivement le tissu cérébral18. Cependant, à ce jour, la résolution spatio-temporelle n’est pas assez élevée pour révéler la dynamique des protéines contrôlant l’invasion du...

La motilité cellulaire est un processus stéréotypé nécessitant l’établissement d’un axe de polarité et des réarrangements cytosquelettiques générateurs de force. La polymérisation de l’actine et son association avec la myosine sont reconnues comme les principaux contributeurs aux forces protrusives et contractiles nécessaires au mouvement cellulaire1. Les microtubules sont considérés comme les principaux acteurs de la polarisation cellulaire et de la persistance directionnelle pendant la migration2. Ces dernières années, il a également été démontré que les MT créent et stabilisent des protubérances pour soutenir les forces mécanocompressives lors de l’invasion cellulaire en 3D3. Plus récemment, les MT ont été directement impliquées dans la mécanotransduction aux adhérences focales et la migration mécanosensible4. L’instabilité dynamique qui caractérise la dynamique terminale MT-plus est constituée de phases répétées de polymérisation (croissance) et de dépolymérisation (retrait), qui sont contrôlées par une pléthore de protéines de liaison aux microtubules et de cascades de signalisation intracellulaires, telles que celles régies par les RHO-GTPases 5,6,7. Le rôle du réseau MT dans la migration et l’invasion cellulaire a fait de l’étude de la dynamique de la MT un élément clé pour mieux comprendre les mécanismes de la localisation des cellules immunitaires, de la cicatrisation des plaies et de l’invasion du cancer.
La capacité des cellules cancéreuses à s’échapper du noyau tumoral primaire, à se propager dans les tissus et à générer des tumeurs secondaires est une étape cruciale pour empêcher le succès mondial dans la guerre contre le cancer déclarée il y a 50 ans 8,9. L’un des plus grands obstacles a été de comprendre comment les cellules cancéreuses envahissent activement le tissu. Les principaux mécanismes d’invasion reposent sur les mêmes principes que ceux régissant la migration des cellules non tumorales10. Cependant, des spécificités de migration des cellules cancéreuses ontémergé11, déclenchant la nécessité d’une meilleure caractérisation de ce type de migration. Plus précisément, parce que le microenvironnement tumoral apparaît comme un acteur clé de la progression du cancer12, l’observation et l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses dans un contexte physiologique pertinent sont essentielles pour démêler les mécanismes de dissémination des cellules cancéreuses.
Les MT sont essentielles à la progression du cancer, pour soutenir à la fois la prolifération et l’invasion. Une analyse précise de la dynamique de la MT in situ peut aider à identifier les agents altérant la MT (MTA) dans les deux processus. La dynamique de la traduction automatique varie considérablement en fonction d’un changement d’environnement. In vitro, le traitement avec des agents déstabilisants MT tels que le nocodazole empêche la formation de saillies cellulaires lorsque les cellules sont intégrées dans des gels en 3D, alors qu’il a peu d’effet sur la migration cellulaire 2D13,14. Bien que techniquement difficiles, les progrès de l’imagerie intravitale permettent une analyse in vivo de la dynamique de la MT pendant l’invasion des cellules cancéreuses. Par exemple, l’observation des MT dans les cellules de fibrosarcome xénogreffées par voie sous-cutanée chez la souris a révélé que les macrophages associés aux tumeurs affectent la dynamique de la MT dans les cellules tumorales15. Cependant, ces modèles murins impliquent des procédures chirurgicales étendues et restent insatisfaisants pour les cancers moins accessibles, tels que la tumeur cérébrale hautement invasive, GBM.
Malgré un temps de survie moyen lamentable de 15 mois16, on sait peu de choses sur le mode de dissémination du GBM dans le parenchyme cérébral ou sur les éléments moléculaires clés soutenant l’invasion des cellules GBM dans le tissu cérébral. L’amélioration du modèle de xénogreffe orthotopique de souris (PDX) et l’établissement de fenêtres crâniennes ont offert de nouvelles perspectives pour les études d’invasion cellulaire GBM17,18. Cependant, en raison de la qualité d’imagerie sous-optimale, ce modèle a principalement permis l’imagerie longitudinale de xénogreffes superficielles et n’a pas été utilisé avec succès pour étudier l’imagerie subcellulaire des protéines du cytosquelette jusqu’à présent. De plus, à la suite de l’injonction des « 3R » visant à réduire l’utilisation des rongeurs et à les remplacer par des vertébrés inférieurs, des modèles alternatifs ont été établis.
Profitant de l’immunité primitive observée chez les larves de poisson zèbre (Danio rerio), l’injection orthotopique de cellules GBM dans le cerveau des poissons a été développée 19,20,21. L’injection au voisinage des ventricules dans le mésencéphale en développement récapitule la majeure partie de la physiopathologie du GBM humain21, et le même schéma préféré d’invasion du GBM que chez les humains - cooptation des vaisseaux - est observé22. Grâce à la transparence des larves de poissons, ce modèle permet de visualiser les cellules GBM envahissant le cerveau à partir des zones péri-ventriculaires où la plupart des GBM apparaîtraient23.
Étant donné que les MT sont essentielles pour l’invasion cellulaire du GBM in vitro24,25, une meilleure caractérisation de la dynamique de la magnétothérapie et l’identification des régulateurs clés pendant l’invasion cellulaire sont nécessaires. Cependant, à ce jour, les données générées avec le modèle orthotopique du poisson zèbre n’ont pas inclus l’analyse subcellulaire de la dynamique de la magnétoscopie pendant le processus d’invasion. Cet article fournit un protocole pour étudier la dynamique de la MT in vivo et déterminer son rôle lors de l’invasion du cancer du cerveau. Après un marquage stable des microtubules, les cellules GBM sont microinjectées à 3 dpf dans le cerveau des larves de poisson zèbre et imagées en temps réel à haute résolution spatio-temporelle au cours de leur progression dans le tissu cérébral. L’imagerie en direct des MT fluorescentes permet l’analyse qualitative et quantitative de la dynamique de la MT plus-end. De plus, ce modèle permet d’évaluer en temps réel l’effet des MTA sur la dynamique de la MT et sur les propriétés invasives des cellules GBM. Ce protocole relativement non invasif combiné à un grand nombre de larves manipulées à la fois et à la facilité d’application du médicament (dans l’eau des poissons) fait du modèle un atout pour les essais précliniques.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Avec un temps de survie médian lamentable dans les populations réelles - entre 6 et 15 mois - le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale maligne la plus dévastatrice. L’échec du traitement est principalement dû au caractère invasif des cellules GBM, ce qui témoigne de la nécessité d’une meilleure compréhension des propriétés mobiles du GBM. Pour étudier le mécanisme moléculaire soutenant l’invasion du GBM, de nouveaux modèles physiologiques permettant une caractérisation approfondie de la dynamique des protéines pendant l’invasion sont nécessaires. Ces observations ouvriraient la voie à la découverte de nouvelles cibles pour bloquer l’infiltration tumorale et améliorer les résultats pour les patients. Cet article rapporte comment une xénogreffe orthotopique de cellules GBM dans le cerveau du poisson zèbre permet l’imagerie vivante intravitale subcellulaire. En nous concentrant sur les microtubules (MT), nous décrivons une procédure de marquage MT dans les cellules GBM, la microinjection de cellules GBM dans le cerveau transparent de larves de poisson zèbre 3 jours après la fécondation (dpf), l’imagerie intravitale des MT dans les xénogreffes disséminées, la modification de la dynamique MT pour évaluer leur rôle lors de l’invasion GBM et l’analyse des données acquises.

Pour analyser le rôle joué par les MT lors de l’invasion in vivo du GBM, nous décrivons ici les principales étapes pour effectuer un marquage MT stable dans les cellules GBM par infection lentivirale, la xénotransplantation orthotopique de cellules GBM chez 3 larves de poisson-zèbre dpf, l’imagerie intravitale à haute résolution de la dynamique MT, le traitement MTA et ses effets sur l’invasion GBM, et l’analyse d’images de la dynamique MT et de l’invasion in vivo (<strong c...

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Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Nous rapportons une technique permettant l’imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome (GBM) envahissant un tissu cérébral de vertébrés. Le couplage de l’injection orthotopique de cellules GBM marquées par fluorescence dans un cerveau de poisson-zèbre transparent avec une imagerie intravitale à haute résolution permet de mesurer la dynamique du cytosquelette lors de l’invasion in situ du cancer.

Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Cette méthode est dédiée à l’étude du rôle des microtubules lors de l’invasion du cancer du cerveau en couplant l’injection atopique de cellules cancéreuses du cerveau chez le poisson zèbre à l’imagerie intravitale sous-cellulaire. Le principal avantage de la technique réside dans la haute résolution temporelle spatiale à laquelle le cytosquelette des microtubules est acquis. Il est unique pour les modèles in vivo d’invasion du cancer du cerveau et permet une analyse approfondie de la dynamique des microtubules.L’imagerie subcellulaire de l’invasion in situ des cellules cancéreuses du cerveau peut être utilisée pour l’analyse de toute protéine d’intérêt potentiellement impliquée dans l’invasion du cancer. Pour commencer, lavez les cellules de glioblastome cultivées à 37 degrés Celsius avec du PBS. Détachez les cellules en ajoutant un millilitre de 0,05% de trypsine EDTA et en incubant pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur cellulaire jusqu’à ce que toutes les cellules soient complètement détachées.Resuspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu cellulaire de glioblastome complet dans un tube centrifuge de 50 millilitres. Ajouter 45 millilitres de PBS glacé et centrifuger à 134 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec un millilitre de PBS glacé en pipitant de haut en bas soigneusement.Ajouter 49 millilitres de PBS glacé et centrifuger à 134 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de PBS glacé. Conserver sur de la glace pendant toute la durée de la procédure de transplantation.Pour micro-injecter les cellules du glioblastome dans le mésencéphale des larves de poisson zèbre, remplissez une plaque moulée de micro-injection avec six millilitres de milieu E3 supplémentés en 160 milligrammes par litre de tricaïne. Transférer une douzaine de larves DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED dans la plaque de micro-injection. Une fois que les larves sont anesthésiées et totalement insensibles au toucher, alignez-les dans les tranchées de leur côté, la tête haute et le sac vitellin poussé contre le mur de la tranchée avec un pinceau de taille 00.Ensuite, chargez cinq microlitres de cellules de glioblastome dans le micro-capillaire à l’aide d’embouts de microchargement et insérez le capillaire dans le support capillaire universel. Placez la plaque de microinjection contenant les larves anesthésiées sur la platine du stéréomicroscope. Placez la pointe du micro-capillaire sur le bord de la plaque de micro-injection à l’aide des boutons du micro-manipulateur.Ensuite, cassez avec un scalpel pour créer un point d’entrée pointu à peu près de la taille du diamètre d’une cellule. Vérifiez que les cellules s’écoulent du capillaire en faisant couler doucement de l’huile dans le micro-injecteur et en plongeant l’extrémité de l’aiguille dans le milieu. Concentrez les cellules à l’extrémité du capillaire pour maximiser le nombre de cellules injectées par volume injecté et éviter de remplir le tissu cérébral avec du PBS.Examinez attentivement les cellules qui sortent du micro-capillaire lorsque de l’huile est introduite manuellement dans l’injecteur. Définissez empiriquement le nombre de tours nécessaires sur le bouton manuel pour fournir 20 à 50 cellules. En règle générale, si les cellules sont suffisamment concentrées, un léger tour suffit pour éjecter environ 10 cellules.Approchez la pointe du capillaire contre le tectum optique gauche juste au-dessus de la veine cérébrale moyenne. Appuyez doucement le capillaire contre les larves jusqu’à ce que la membrane cutanée se brise. Une fois qu’une position appropriée dans le tectum optique est atteinte, éjectez les cellules.Observez attentivement l’extrémité du capillaire pour visualiser le flux de cellules entrant à l’intérieur de l’animal, assurant ainsi une injection réussie. Répétez la procédure pour autant d’animaux que nécessaire. Selon la vitesse d’injection de l’expérimentateur, un changement d’aiguille pourrait être nécessaire toutes les 10 à 20 larves en raison de l’agglutination rapide des cellules dans le capillaire.Une fois la transplantation au xéno terminée, retirez les larves de la plaque de micro-injection et sélectionnez-les dans une plaque de 24 puits remplie de PTU d’eau de source minérale et de milieu bleu de méthylène. Préparez une solution AH-KROH à bas point de fusion à 1%. Transférez 500 microlitres de solution bouillie d’AH-KROH à bas point de fusion à 1% dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et laissez-le refroidir à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique.ajouter 160 microgrammes par litre de tricaine à l’AH-KROHS et bien mélanger. Transférer une à quatre larves xénogreffées dans une boîte de Petri de 3,5 centimètres remplie de PTU d’eau de source minérale et de milieu de méthylène, complétée par 160 microgrammes par litre de tricaïne. Une fois que les larves sont anesthésiées et ne répondent pas du tout au toucher, transférez-les soigneusement dans le tube contenant l’AH-KROHS et la tricaïne à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine.Mélangez délicatement la larve avec l’AH-KROHS. À l’aide d’une grande pipette de transfert à bulbe, placer les larves mélangées dans l’AH-KROHS au centre d’une antenne d’imagerie vidéo de 3,5 centimètres à fond de verre Sous un stéréomicroscope, positionnez rapidement les larves sur son dos. À l’aide d’une pointe de micro-chargement, retirez les AH-KROHS supplémentaires pour maintenir la couche AH-KROHS la plus fine possible.Une fois que AH-KROHS s’est solidifié, ajoutez 2,5 millilitres de milieu d’imagerie. Pour l’imagerie in vivo de la dynamique des microtubules dans les cellules envahissantes de glioblastome, placez la parabole d’imagerie vidéo contenant les larves xénogreffées intégrées AH-KROHS dans la chambre environnementale d’un microscope confocale inversé avec une température réglée à 32 degrés Celsius. Trouvez les larves dans la parabole d’imagerie vidéo avec un objectif 10x à l’aide d’une scène XY motorisée.Appuyez sur l’échappement pour abaisser la tourelle des objectifs et ajoutez de l’huile minérale sur un objectif d’huile 60x, puis appuyez sur l’échappement pour revenir à la position focale initiale. Observez les cellules envahissantes du glioblastome dans le canal rouge réglé sur une source laser de 561 nanomètres, une puissance laser de 20% et une exposition temporelle de 200 millisecondes. Sélectionnez ensuite une cellule avec un réseau de microtubules étalé et des filaments de microtubules facilement reconnaissables.Définissez les paramètres de la série Z. À l’aide d’un piézo-étage de 200 micromètres, sélectionnez les positions supérieure et inférieure du réseau de microtubules où une pile Z de 10 à 30 micromètres de profondeur est suffisante pour visualiser le réseau microbien dans la saillie de la cellule migrante avec un pas de tranche Z de 0,3 micromètre. Définissez les paramètres d’acquisition en accéléré pour permettre un équilibre optimal entre la vitesse d’acquisition, la profondeur de la pile Z et le signal fluorescent afin d’éviter un blanchiment rapide des photos.Acquérir des images des microtubules toutes les cinq à 10 secondes pendant plusieurs minutes et enregistrer l’hyper-pile 5D. La dynamique des microtubules a été mesurée en construisant un kymographe le long des microtubules en croissance et en rétrécissement et en suivant manuellement les bords individuels des microtubules au fil du temps. Le traitement médicamenteux administré dans le milieu larvaire et son effet réversible sur l’organisation du réseau de microtubules ont été évalués en traitant avec une dose nanomolaire de 200 nanomolaires de nocodazole.Cela a entraîné un rétrécissement progressif du réseau de microtubules et la disparition de la saillie cellulaire du glioblastome après quatre heures. Le lavage du médicament a restauré la capacité des cellules de glioblastome à former des protubérances. Les cellules ont repris leur migration le long du système vasculaire 12 heures après le lavage, ce qui indique qu’une dose de 200 nanomoles de nocodazole était suffisante pour perturber le réseau de microtubules et bloquer rapidement l’invasion in vivo des cellules de glioblastome.Une analyse de trois jours du même traitement sur l’invasion cellulaire globale du glioblastome a révélé que le nocodazole arrêtait l’invasion à long terme des cellules de glioblastome in vivo sans affecter la santé générale du poisson par rapport à un témoin. N’oubliez pas de commencer avec des larves en bonne santé trois jours après la fécondation pour concentrer les cellules dans le capillaire, minimiser le volume injecté dans le cerveau et former une masse tumorale unique, et essayez d’éviter d’injecter dans les ventricules cérébraux.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

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Recherche

Biologie

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Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

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La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

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Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

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Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

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The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

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