Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Wir danken Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankreich) und seinem Labor, insbesondere Valérie Briolat, und Emma Colucci-Guyon für die Bereitstellung der Zebrafischlinien und der Kunststoffform für Mikroinjektionsplatten sowie für ihr wertvolles Know-how über experimentelle Verfahren von Zebrafischen. Wir danken dem UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, unterstützt von der französischen National Research Agency France BioImaging, und ANR-10-INBS-04; Investitionen in die Zukunft). Diese Arbeit wurde von der Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), dem Centre National de la Recherche Scientific und dem Institut Pasteur sowie durch die großzügigen Spenden von Frau Marguerite MICHEL und Herrn Porquet.

Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Europäischen Union für den Umgang mit Versuchstieren durchgeführt. Alle Protokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Institut Pasteur - CEEA 89 und dem französischen Ministerium für Forschung und Bildung (Genehmigung #01265.03) genehmigt. Während der Injektionen oder Live-Bildgebungssitzungen wurden die Tiere mit Tricaine.At am Ende der experimentellen Verfahren betäubt, sie wurden durch eine anästhetische Überdosierung eingeschläfert. Weitere Info...

Die Bildgebung von Tumor-Xenotransplantaten mit Einzelzellauflösung wird wahrscheinlich zu einem unverzichtbaren Werkzeug, um unser Verständnis der GBM-Biologie zu verbessern. Live-Bildgebung in Maus-PDX-Modellen hat zu wertvollen Entdeckungen darüber geführt, wie GBM kollektiv in das Hirngewebe eindringt18. Bisher ist die raumzeitliche Auflösung jedoch nicht hoch genug, um die Dynamik von Proteinen aufzudecken, die die GBM-Invasion steuern. Wir argumentierten, dass durch die Kopplung der ort...

Zellmotilität ist ein stereotyper Prozess, der die Etablierung der Polaritätsachse und krafterzeugende Umlagerungen des Zytoskeletts erfordert. Die Aktinpolymerisation und ihre Assoziation mit Myosin gelten als die Hauptursachen für protrusive und kontraktile Kräfte, die für die Zellbewegung erforderlich sind1. Mikrotubuli gelten als Hauptakteure der Zellpolarisation und der gerichteten Persistenz während der Migration2. In den letzten Jahren wurde auch gezeigt, dass MTs Vorsprünge erzeugen und stabilisieren, um mechanokompressive Kräfte während der Zellinvasion in 3D3 zu unterstützen. In jüngerer Zeit waren MTs direkt an der Mechanotransduktion an fokalen Adhäsionen und mechanosensitiver Migration beteiligt4. Die dynamische Instabilität, die die MT-plus-Enddynamik charakterisiert, besteht aus wiederholten Phasen der Polymerisation (Wachstum) und Depolymerisation (Schrumpfung), die durch eine Vielzahl von Mikrotubuli-bindenden Proteinen und intrazellulären Signalkaskaden gesteuert werden, wie sie von RHO-GTPasen 5,6,7 gesteuert werden. Die Rolle des MT-Netzwerks bei der Zellmigration und -invasion hat die Untersuchung der MT-Dynamik zu einem Schlüsselelement gemacht, um die Mechanismen des Immunzell-Homing, der Wundheilung und der Krebsinvasion besser zu verstehen.
Die Fähigkeit von Krebszellen, dem primären Tumorkern zu entkommen, sich im Gewebe auszubreiten und sekundäre Tumore zu erzeugen, ist ein entscheidender Schritt, um den globalen Erfolg im Krieg gegen den Krebs zu verhindern, der vor 50 Jahren erklärt wurde 8,9. Eine der größten Hürden war zu verstehen, wie Krebszellen aktiv in das Gewebe eindringen. Wichtige Invasionsmechanismen beruhen auf den gleichen Prinzipien wie diejenigen, die die Migration nicht-tumoröser Zellen steuern10. Es sind jedoch Besonderheiten der Krebszellmigration aufgetreten11, was die Notwendigkeit einer besseren Charakterisierung dieser Art der Migration auslöst. Insbesondere weil die Tumormikroumgebung als Schlüsselrolle bei der Krebsprogression12 erscheint, ist die Beobachtung und Analyse der Krebszellinvasion in einem relevanten physiologischen Kontext unerlässlich, um die Mechanismen der Krebszellverbreitung zu entschlüsseln.
MTs sind von zentraler Bedeutung für das Fortschreiten von Krebs, um sowohl die Proliferation als auch die Invasion aufrechtzuerhalten. Eine präzise Analyse der MT-Dynamik in situ kann helfen, MT-verändernde Substanzen (MTA) in beiden Prozessen zu identifizieren. Die MÜ-Dynamik variiert drastisch bei einer Änderung der Umgebung. In vitro verhindert die Behandlung mit MT-destabilisierenden Wirkstoffen wie Nocodazol die Bildung von Zellprotrusionen, wenn Zellen in Gele in 3D eingebettet sind, während sie wenig Einfluss auf die 2D-Zellmigration hat13,14. Obwohl technisch anspruchsvoll, ermöglichen Fortschritte in der intravitalen Bildgebung eine In-vivo-Analyse der MT-Dynamik während der Invasion von Krebszellen. Zum Beispiel zeigte die Beobachtung von MTs in subkutan xenotransplantierten Fibrosarkomzellen in Mäusen, dass tumorassoziierte Makrophagen die MT-Dynamik in Tumorzellen beeinflussen15. Diese Mausmodelle beinhalten jedoch umfangreiche chirurgische Eingriffe und bleiben für weniger zugängliche Krebsarten wie den hochinvasiven Hirntumor GBM unbefriedigend.
Trotz einer düsteren durchschnittlichen Überlebenszeit von 15 Monaten16 ist wenig über die Art der Verbreitung von GBM innerhalb des Hirnparenchyms oder die wichtigsten molekularen Elemente, die die GBM-Zellinvasion im Hirngewebe unterstützen, bekannt. Die Verbesserung des orthotopen Xenograft-Modells (PDX) der Maus und die Etablierung von Schädelfenstern boten neue Perspektiven für GBM-Zellinvasionsstudien17,18. Aufgrund der suboptimalen Bildgebungsqualität hat dieses Modell jedoch weitgehend longitudinale Bildgebung von oberflächlichen Xenotransplantaten erlaubt und wurde bisher nicht erfolgreich zur Untersuchung subzellulärer Bildgebung von Zytoskelettproteinen eingesetzt. Darüber hinaus wurden im Zuge der "3R"-Anordnung, den Einsatz von Nagetieren zu reduzieren und sie durch niedere Wirbeltiere zu ersetzen, alternative Modelle etabliert.
Unter Ausnutzung der primitiven Immunität, die bei Zebrafischlarven (Danio rerio) beobachtet wurde, wurde eine orthotope Injektion von GBM-Zellen in das Fischgehirn entwickelt 19,20,21. Die Injektion in die Nähe der Ventrikel im sich entwickelnden Mittelhirn rekapituliert den größten Teil der menschlichen GBM-Pathophysiologie21, und das gleiche bevorzugte Muster der GBM-Invasion wie bei der Kooption der menschlichen Gefäße wird beobachtet22. Dank der Transparenz der Fischlarven ermöglicht dieses Modell die Visualisierung von GBM-Zellen, die aus den periventrikulären Bereichen, in denen die meisten GBMs entstehen sollen, in das Gehirn eindringen23.
Da MTs für die GBM-Zellinvasion in vitro24,25 unerlässlich sind, ist eine bessere Charakterisierung der MT-Dynamik und die Identifizierung von Schlüsselregulatoren während der Zellinvasion erforderlich. Bisher haben die mit dem Zebrafisch-Orthotopenmodell generierten Daten jedoch keine subzelluläre Analyse der MT-Dynamik während des Invasionsprozesses berücksichtigt. Dieses Papier bietet ein Protokoll, um die MT-Dynamik in vivo zu untersuchen und ihre Rolle während der Invasion von Hirntumoren zu bestimmen. Nach stabiler Mikrotubuli-Markierung werden GBM-Zellen mit 3 dpf in die Gehirne von Zebrafischlarven mikroinjiziert und in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung während ihrer Progression im Hirngewebe abgebildet. Die Live-Bildgebung von fluoreszierenden MTs ermöglicht die qualitative und quantitative Analyse der MT-Plus-End-Dynamik. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell, den Einfluss von MTAs auf die MT-Dynamik und die invasiven Eigenschaften von GBM-Zellen in Echtzeit zu bewerten. Dieses relativ nicht-invasive Protokoll in Kombination mit einer großen Anzahl von Larven, die gleichzeitig gehandhabt werden, und der einfachen Anwendung von Medikamenten (im Fischwasser) macht das Modell zu einem Vorteil für präklinische Tests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Mit einer düsteren mittleren Überlebenszeit in realen Populationen - zwischen 6 und 15 Monaten - ist das Glioblastom (GBM) der verheerendste bösartige Hirntumor. Das Behandlungsversagen ist hauptsächlich auf die Invasivität der GBM-Zellen zurückzuführen, was für die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der beweglichen Eigenschaften von GBM spricht. Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die GBM-Invasion unterstützt, sind neue physiologische Modelle erforderlich, die eine eingehende Charakterisierung der Proteindynamik während der Invasion ermöglichen. Diese Beobachtungen würden den Weg zur Entdeckung neuer Ziele ebnen, um die Tumorinfiltration zu blockieren und die Patientenergebnisse zu verbessern. Dieser Artikel berichtet, wie ein orthotopes Xenotransplantat von GBM-Zellen im Zebrafischgehirn subzelluläre intravitale Live-Bildgebung ermöglicht. Wir konzentrieren uns auf Mikrotubuli (MTs) und beschreiben ein Verfahren zur MT-Markierung in GBM-Zellen, zur Mikroinjektion von GBM-Zellen in das transparente Gehirn von Zebrafischlarven 3 Tage nach der Befruchtung (dpf), zur intravitalen Bildgebung von MTs in den sich ausbreitenden Xenotransplantaten, zur Veränderung der MT-Dynamik, um ihre Rolle während der GBM-Invasion zu bewerten, und zur Analyse der erfassten Daten.

Um die Rolle von MTs während der in vivo GBM-Invasion zu analysieren, beschreiben wir hier die wichtigsten Schritte zur Durchführung einer stabilen MT-Markierung in GBM-Zellen durch lentivirale Infektion, orthotope Xenotransplantation von GBM-Zellen in 3 dpf Zebrafischlarven, hochauflösende intravitale Bildgebung der MT-Dynamik, MTA-Behandlung und ihre Auswirkungen auf die GBM-Invasion sowie Bildanalyse der MT-Dynamik und In-vivo-Invasion (Abbildung 1). </em...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Diese Methode widmet sich der Untersuchung der Rolle von Mikrotubuli bei der Invasion von Hirntumoren, indem die atopische Injektion von Hirntumorzellen im Zebrafisch an die subzelluläre intravitale Bildgebung gekoppelt wird. Der Hauptvorteil der Technik liegt in der hohen räumlichen zeitlichen Auflösung, mit der das Mikrotubuli-Zytoskelett erfasst wird. Es ist einzigartig für in vivo Hirntumor-Invasionsmodelle und ermöglicht eine eingehende Analyse der Mikrotubulidynamik.Die subzelluläre Bildgebung der In-situ-Hirntumorzellinvasion kann für die Analyse jedes Proteins von Interesse verwendet werden, das möglicherweise an der Krebsinvasion beteiligt ist. Um zu beginnen, waschen Sie die bei 37 Grad Celsius kultivierten Glioblastomzellen mit PBS. Lösen Sie die Zellen ab, indem Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin EDTA hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius im Zellinkubator inkubieren, bis alle Zellen vollständig abgelöst sind.Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter komplettem Glioblastom-Zellmedium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 45 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 134 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem PBS, indem Sie gründlich auf und ab pipettieren.Fügen Sie weitere 49 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 134 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern eiskaltem PBS. Für die Dauer des Transplantationsvorgangs auf Eis lagern.Um die Glioblastomzellen in das Mittelhirn der Zebrafischlarven zu injizieren, füllen Sie eine Mikroinjektionsgussplatte mit sechs Milliliter E3-Medium, ergänzt mit 160 Milligramm pro Liter Tricain. Ein Dutzend DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED-Larven in die Mikroinjektionsplatte geben. Sobald die Larven betäubt sind und nicht mehr auf Berührung reagieren, richten Sie sie in den Gräben auf ihrer Seite aus, Kopf hoch und der Dottersack mit einem Pinsel der Größe 00 gegen die Wand des Grabens gedrückt.Laden Sie dann fünf Mikroliter Glioblastomzellen mit Microloading-Spitzen in die Mikrokapillare und führen Sie die Kapillare in den universellen Kapillarhalter ein. Legen Sie die Mikroinjektionsplatte mit den betäubten Larven auf den Stereomikroskoptisch. Legen Sie die Spitze der Mikrokapillare mit den Mikromanipulatorknöpfen auf den Rand der Mikroinjektionsplatte.Dann brechen Sie es mit einem Skalpell, um einen scharfen Eintrittspunkt zu erzeugen, der ungefähr so groß ist wie der Durchmesser einer Zelle. Überprüfen Sie, ob die Zellen aus der Kapillare fließen, indem Sie vorsichtig Öl in den Mikroinjektor laufen lassen und die Spitze der Nadel in das Medium tauchen. Konzentrieren Sie die Zellen an der Spitze der Kapillare, um die Anzahl der injizierten Zellen pro injiziertem Volumen zu maximieren und das Füllen des Hirngewebes mit PBS zu vermeiden.Untersuchen Sie sorgfältig die Zellen, die aus der Mikrokapillare kommen, während Öl manuell in den Injektor eingeführt wird. Definieren Sie empirisch die Anzahl der Umdrehungen, die auf dem manuellen Drehknopf benötigt werden, um 20 bis 50 Zellen zu liefern. Wenn die Zellen konzentriert genug sind, reicht typischerweise eine sanfte Drehung aus, um etwa 10 Zellen auszustoßen.Nähern Sie sich der Spitze der Kapillare gegen das linke optische Tectum knapp über der mittleren Hirnvene. Drücken Sie die Kapillare vorsichtig gegen die Larven, bis die Hautmembran bricht. Sobald eine geeignete Position im optischen Tectum erreicht ist, werfen Sie die Zellen aus.Beobachten Sie sorgfältig die Spitze der Kapillare, um den Zellstrom im Inneren des Tieres zu visualisieren und so eine erfolgreiche Injektion sicherzustellen. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Tiere wie erforderlich. Je nachdem, wie schnell der Experimentator injiziert, kann aufgrund der schnellen Zellverklumpung in der Kapillare alle 10 bis 20 Larven ein Nadelwechsel erforderlich sein.Sobald die Xeno-Transplantation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Larve von der Mikroinjektionsplatte und wählen Sie sie in einer 24-Well-Platte aus, die mit Mineralwasser PTU und methylenblauem Medium gefüllt ist. Bereiten Sie eine 1% niedrigschmelzende AH-KROH-Lösung vor. 500 Mikroliter gekochte 1% niedrigschmelzende AH-KROH-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und auf einem Hitzeblock bei 37 Grad Celsius abkühlen lassen.160 Mikrogramm pro Liter Tricain in den AH-KROHS geben und gut mischen. Ein bis vier xenografierte Larven in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale geben, die mit Mineralwasser PTU und Methylenmedium gefüllt ist, ergänzt mit 160 Mikrogramm pro Liter Tricain. Sobald die Larven betäubt sind und nicht mehr auf Berührung reagieren, übertragen Sie sie vorsichtig in das Röhrchen mit AH-KROHS und Tricaine mit einer feinen Transferpipette.Mischen Sie die Larve vorsichtig mit dem AH-KROHS. Legen Sie die im AH-KROHS gemischten Larven mit einer großen Kolbentransferpipette auf die Mitte einer 3,5 Zentimeter großen Video-Bildschale mit Glasboden Unter einem Stereomikroskop positionieren Sie die Larven schnell auf dem Rücken. Entfernen Sie mit einer Mikroladespitze zusätzliche AH-KROHS, um die dünnstmögliche AH-KROHS-Schicht zu erhalten.Sobald AH-KROHS erstarrt ist, fügen Sie 2,5 Milliliter Bildmedium hinzu. Für die In-vivo-Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in eindringenden Glioblastomzellen wird die Videobildschale mit den in AH-KROHS eingebetteten xenografierten Larven in die Umweltkammer eines inversen konfokalen Mikroskops mit einer Temperatur von 32 Grad Celsius platziert. Finden Sie die Larven in der Videobildschale mit einem 10x-Objektiv mit einem motorisierten XY-Tisch.Drücken Sie Escape, um den Objektivturm abzusenken und Mineralöl auf ein 60-faches Ölobjektiv zu geben, und drücken Sie Escape, um zur ursprünglichen Fokusposition zurückzukehren. Beobachten Sie die eindringenden Glioblastomzellen im roten Kanal, der auf 561 Nanometer Laserquelle, 20% Laserleistung und eine Belichtungszeit von 200 Millisekunden eingestellt ist. Wählen Sie dann eine Zelle mit einem ausgebreiteten Mikrotubuli-Netzwerk und leicht unterscheidbaren Mikrotubuli-Filamenten aus.Legen Sie die Einstellungen der Z-Serie fest. Wählen Sie mit einer Piezostufe im Bereich von 200 Mikrometern die obere und untere Position des Mikrotubuli-Netzwerks aus, wobei ein 10 bis 30 Mikrometer tiefer Z-Stapel ausreicht, um das mikrobielle Netzwerk im Vorsprung der migrierenden Zelle mit einem Z-Schichtschritt von 0,3 Mikrometern sichtbar zu machen. Stellen Sie die Einstellungen für die Zeitrafferaufnahme ein, um ein optimales Gleichgewicht zwischen Aufnahmegeschwindigkeit, Z-Stack-Tiefe und Fluoreszenzsignal zu ermöglichen, um eine schnelle Fotobleiche zu vermeiden.Nehmen Sie alle fünf bis 10 Sekunden mehrere Minuten lang Bilder der Mikrotubuli auf und speichern Sie den 5D-Hyperstapel. Die Dynamik der Mikrotubuli wurde gemessen, indem ein Kymograph entlang wachsender und schrumpfender Mikrotubuli gebaut und einzelne Mikrotubulikanten im Laufe der Zeit manuell verfolgt wurden. Die im Larvenmedium verabreichte medikamentöse Behandlung und ihre reversible Wirkung auf die Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks wurde durch Behandlung mit einer 200-Nanomolaren Dosis Nocodazol bewertet.Dies führte zu einer fortschreitenden Schrumpfung des Mikrotubuli-Netzwerks und zum Verschwinden der Glioblastom-Zellprotrusion nach vier Stunden. Das Auswaschen des Medikaments stellte die Fähigkeit der Glioblastomzellen zur Bildung von Vorsprüngen wieder her. Die Zellen wanderten 12 Stunden nach dem Auswaschen wieder entlang des Gefäßsystems, was darauf hindeutet, dass eine Dosis von 200 Nanomol Nocodazol ausreichte, um das Mikrotubuli-Netzwerk zu stören und die In-vivo-Glioblastom-Zellinvasion schnell zu blockieren.Eine dreitägige Analyse der gleichen Behandlung zur globalen Glioblastom-Zellinvasion ergab, dass das Nocodazol die langfristige Glioblastom-Zellinvasion in vivo stoppte, ohne die allgemeine Gesundheit der Fische im Vergleich zu einer Kontrolle zu beeinträchtigen. Denken Sie daran, mit gesunden Larven drei Tage nach der Befruchtung zu beginnen, um die Zellen in der Kapillare zu konzentrieren, das in das Gehirn injizierte Volumen zu minimieren und eine einzigartige Tumormasse zu bilden, und versuchen Sie, die Injektion in die Hirnventrikel zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...