Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

אנו מודים מאוד לד"ר פ. הרבומל (מכון פסטר, צרפת) ולמעבדתו, במיוחד ולרי בריולט, ואמה קולוצ'י-גויון על שסיפקו לנו את קווי דגי הזברה ואת תבנית הפלסטיק לצלחות מיקרו-הזרקה, ועל מומחיותם רבת הערך בהליכי ניסוי בדגי זברה. אנו מודים על ההדמיה הביולוגית הפוטונית של UtechS (C2RT, מכון פסטר, הנתמך על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית France BioImaging, ו- ANR-10-INBS-04; השקעות לעתיד). עבודה זו נתמכה על ידי הליגה נגד סרטן (EL2017). LNCC), המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק, ומכון פסטר ועל ידי תרומות נדיבות של גברת מרגריט מישל ומר פורקט.

ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי לטיפול בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של מכון פסטר - CEEA 89 ומשרד המחקר והחינוך הצרפתי (היתר #01265.03). במהלך זריקות או מפגשי הדמיה חיים, בעלי חיים הורדו עם Tricaine.At סיום ההליכים הניסיוניים, הם הומתו על...

הדמיית קסנוגרפטים של גידולים ברזולוציה של תא בודד עשויה להפוך לכלי חיוני לשיפור הבנתנו את הביולוגיה של GBM. הדמיה חיה במודלים של PDX של עכברים הובילה לתגליות חשובות על האופן שבו GBM פולש באופן קולקטיבי לרקמת המוח18. עם זאת, עד כה, הרזולוציה המרחבית-טמפורלית אינה גבוהה מספיק כדי לחש?...

תנועתיות תאים היא תהליך סטריאוטיפי הדורש התבססות ציר קוטביות וסידור מחדש של ציטוסקטליים המייצרים כוח. פילמור אקטין והקשר שלו למיוזין מוכרים כתורמים העיקריים לכוחות בולטים ומתכווצים הנדרשים לתנועת תאים1. מיקרוטובולים נחשבים לשחקנים העיקריים בקיטוב התאים ובהתמדה כיוונית במהלך נדידה2. בשנים האחרונות הוכח גם כי MTs יוצרים ומייצבים בליטות כדי לתמוך בכוחות מכני-דחיסה במהלך פלישת תאים בתלת-ממד3. לאחרונה, MTs היו מעורבים ישירות במכניוטרנסדוקציה בהידבקויות מוקדיות והגירה מכאנו-סנסיטיבית4. חוסר היציבות הדינמי המאפיין את דינמיקת הקצה של MT-plus מורכב משלבים חוזרים ונשנים של פילמור (גדילה) ודה-פולימריזציה (התכווצות), הנשלטים על ידי שפע של חלבונים קושרי מיקרוטובולים ומפלי איתות תוך-תאיים, כגון אלה הנשלטים על ידי RHO-GTPases 5,6,7. תפקידה של רשת MT בנדידה ובפלישה של תאים הפך את חקר הדינמיקה של MT למרכיב מפתח להבנה טובה יותר של המנגנונים של ביות תאי מערכת החיסון, ריפוי פצעים ופלישה לסרטן.
היכולת של תאים סרטניים להימלט מליבת הגידול הראשונית, להתפשט ברקמות ולייצר גידולים משניים היא צעד קריטי במניעת הצלחה עולמית במלחמה בסרטן שהוכרזה לפני 50 שנה לפני 8,9. אחד המכשולים הגדולים ביותר היה הבנת האופן שבו תאים סרטניים פולשים באופן פעיל לרקמה. מנגנוני פלישה מרכזיים מסתמכים על אותם עקרונות כמו אלה השולטים בנדידה של תאים שאינם סרטניים10. עם זאת, מאפיינים ספציפיים של נדידת תאים סרטניים הופיעו11, מה שמעורר את הצורך באפיון טוב יותר של סוג זה של הגירה. באופן ספציפי, מכיוון שהמיקרו-סביבה של הגידול מופיעה כשחקן מפתח בהתקדמות הסרטן12, התבוננות וניתוח של פלישת תאים סרטניים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי היא חיונית כדי לפענח את המנגנונים של הפצת תאים סרטניים.
MTs הם מרכזיים בהתקדמות הסרטן, כדי לקיים הן התפשטות והן פלישה. ניתוח מדויק של דינמיקת MT באתרו יכול לסייע בזיהוי חומרים משני MTA (MTA) בשני התהליכים. דינמיקת MT משתנה באופן דרסטי עם שינוי בסביבה. במבחנה, טיפול בחומרים מערערי יציבות MT כגון nocodazole מונע היווצרות בלט תאים כאשר תאים מוטבעים בג'לים בתלת-ממד, בעוד שיש לו השפעה מועטה על נדידת תאים דו-ממדית13,14. למרות שזה מאתגר מבחינה טכנית, ההתקדמות בהדמיה תוך-חיונית מאפשרת ניתוח in vivo של דינמיקת MT במהלך פלישה של תאים סרטניים. לדוגמה, תצפית של MTs בתאי פיברוסרקומה תת-עוריים בעכברים גילתה כי מקרופאגים הקשורים לגידול משפיעים על דינמיקת MT בתאי גידול15. עם זאת, מודלים אלה של עכברים כרוכים בהליכים כירורגיים נרחבים ונשארים לא מספקים עבור סוגי סרטן פחות נגישים, כגון גידול המוח הפולשני ביותר, GBM.
למרות זמן הישרדות עגום של15 חודשים ממוצע 16, מעט ידוע על אופן ההפצה של GBM בתוך הפרנכימה המוחית או על האלמנטים המולקולריים העיקריים המקיימים פלישה של תאי GBM לרקמת המוח. שיפור במודל xenograft אורתוטופי של עכבר (PDX) והקמת חלונות גולגולתיים הציעו סיכויים חדשים למחקרי פלישה לתאי GBM17,18. עם זאת, בשל איכות ההדמיה הלא אופטימלית, מודל זה התיר בעיקר הדמיה אורכית של קסנוגרפטים שטחיים ולא שימש בהצלחה לחקר הדמיה תת-תאית של חלבוני שלד ציטוסקטלי עד כה. יתר על כן, בעקבות צו המניעה "3Rs" להפחתת השימוש במכרסמים והחלפתם בבעלי חוליות נמוכים יותר, הוקמו מודלים חלופיים.
תוך ניצול החסינות הפרימיטיבית שנצפתה בזחלי דגי זברה (Danio rerio), פותחה הזרקה אורתוטופית של תאי GBM במוח הדג 19,20,21. הזרקה בקרבת החדרים במוח האמצעי המתפתח משחזרת את רוב הפתופיזיולוגיה האנושית של GBM21, ואותו דפוס מועדף של פלישת GBM כמו בבני אדם-כלי שיט משותף - נצפה22. הודות לשקיפות של זחלי הדגים, מודל זה מאפשר הדמיה של תאי GBM הפולשים למוח מהאזורים הפרי-חדריים שבהם רוב GBMs נחשבים להתעורר23.
מכיוון ש-MTs חיוניים לפלישה לתאי GBM במבחנה 24,25, יש צורך באפיון טוב יותר של דינמיקת MT וזיהוי של רגולטורים מרכזיים במהלך פלישה לתאים. עם זאת, עד כה, הנתונים שנוצרו עם המודל האורתוטופי של דג הזברה לא כללו ניתוח תת-תאי של דינמיקת MT במהלך תהליך הפלישה. מאמר זה מספק פרוטוקול לחקר הדינמיקה של MT in vivo ולקביעת תפקידו במהלך פלישה לסרטן המוח. בעקבות תיוג יציב של מיקרוטובולים, תאי GBM מוזרקים במיקרו-אינדסטריקט ב-3 dpf במוחם של זחלי דגי זברה ומצולמים בזמן אמת ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה במהלך התקדמותם ברקמת המוח. הדמיה חיה של MTs פלואורסצנטיים מאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של דינמיקת MT plus-end. יתר על כן, מודל זה מאפשר להעריך את ההשפעה של MTAs על הדינמיקה של MT ועל התכונות הפולשניות של תאי GBM בזמן אמת. פרוטוקול לא פולשני יחסית זה בשילוב עם מספר רב של זחלים המטופלים בו זמנית וקלות היישום של התרופה (במי הדגים) הופכים את המודל לנכס לבדיקות פרה-קליניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

עם זמן הישרדות חציוני עגום באוכלוסיות אמיתיות - בין 6 ל -15 חודשים - גליובלסטומה (GBM) היא גידול המוח הממאיר ההרסני ביותר. כישלון הטיפול נובע בעיקר מהפולשנות של תאי GBM, מה שמדבר על הצורך בהבנה טובה יותר של תכונות תנועתיות GBM. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי התומך בפלישת GBM, נדרשים מודלים פיזיולוגיים חדשים המאפשרים אפיון מעמיק של דינמיקה של חלבונים במהלך הפלישה. תצפיות אלה יסללו את הדרך לגילוי מטרות חדשות לחסימת חדירת גידולים ולשיפור תוצאות המטופלים. מאמר זה מדווח כיצד שתל אורתוטופי של תאי GBM במוח של דגי זברה מאפשר הדמיה חיה תוך-תאית תת-תאית. תוך התמקדות במיקרוטובולים (MTs), אנו מתארים הליך לתיוג MT בתאי GBM, מיקרו-הזרקה של תאי GBM במוח השקוף של 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי דגי זברה, הדמיה תוך-חיונית של MTs בהפצת קסנוגרפטים, שינוי הדינמיקה של MT כדי להעריך את תפקידם במהלך פלישת GBM, וניתוח הנתונים שנרכשו.

כדי לנתח את התפקיד שממלאים MTs במהלך פלישת in vivo GBM, אנו מתארים כאן את הצעדים העיקריים לביצוע תיוג MT יציב בתאי GBM על ידי זיהום לנטי-ויראלי, קסנוטרנספלנטציה אורתוטופית של תאי GBM בזחלי דגי זברה 3 dpf, הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של דינמיקת MT, טיפול ב-MTA והשפעותיו על פלישת GBM, וניתוח תמונה של דינמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

שיטה זו מוקדשת לחקר תפקידם של מיקרוטובולים במהלך פלישה לסרטן המוח על ידי צימוד הזרקה אטופית של תאי סרטן המוח בדגי זברה להדמיה התוך-תאית התת-תאית. היתרון העיקרי של הטכניקה טמון ברזולוציה הטמפורלית המרחבית הגבוהה שבה נרכש השלד המיקרוטובולי cytoskele. הוא ייחודי למודלים של פלישה לסרטן המוח in vivo והוא מאפשר ניתוח מעמיק של דינמיקה של מיקרוטובולים.ההדמיה התת-תאית של פלישת תאי סרטן המוח באתרה יכולה לשמש לניתוח של כל חלבון בעל עניין שעשוי להיות מעורב בפלישה לסרטן. כדי להתחיל, לשטוף את תאי גליובלסטומה בתרבית ב 37 מעלות צלזיוס עם PBS. נתק את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA ודגרה במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור התאים עד שכל התאים מנותקים לחלוטין.השהה את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום תאי גליובלסטומה שלם בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. מוסיפים 45 מיליליטר של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 פעמים G למשך חמש דקות. השליכו את ה-supernatant והחזירו את התאים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח על ידי צנרת מעלה ומטה ביסודיות.מוסיפים עוד 49 מיליליטר של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 פעמים G למשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נטנט והחזירו את התאים ל-200 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח. יש לאחסן על קרח למשך הליך ההשתלה.כדי להזריק במיקרו את תאי הגליובלסטומה לזחלי דגי הזברה באמצע המוח, מלאו צלחת יצוקה עם שישה מיליליטרים של מדיום E3 בתוספת 160 מיליגרם לליטר טריקאין. העבירו תריסר זחלי DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED לתוך צלחת המיקרו-הזרקה. ברגע שהזחלים מורדמים ולא מגיבים לחלוטין למגע יישרו אותם בתעלות שעל צדם, ראש למעלה ושק החלמון נדחף אל קיר התעלה עם מכחול בגודל 00.לאחר מכן טען חמישה מיקרוליטרים של תאי גליובלסטומה לתוך נימי המיקרו באמצעות קצוות מיקרו-טעינה והכנס את הנימים למחזיק הנימים האוניברסלי. הניחו את לוחית המיקרו-הזרקה המכילה את הזחלים המורדמים על במת המיקרוסקופ הסטריאופוני. מניחים את קצה המיקרו-נימי על גבול צלחת המיקרו-הזרקה באמצעות ידיות המיקרו-מניפולטור.לאחר מכן לשבור אותו עם אזמל כדי ליצור נקודת כניסה חדה בערך בגודל של קוטר התא. ודא שהתאים זורמים מתוך הנימים על ידי הזרמת שמן בעדינות במיקרו-מזרק וצניחה של קצה המחט לתוך המדיום. רכז את התאים בקצה הנימי כדי למקסם את מספר התאים המוזרקים לכל נפח מוזרק והימנע ממילוי רקמת המוח ב- PBS.בחן היטב את התאים היוצאים מהמיקרו נימי כאשר שמן מוכנס ידנית לתוך המזרק. הגדר באופן אמפירי את מספר הסיבובים הדרוש על הידית הידנית כדי לספק 20 עד 50 תאים. בדרך כלל, אם התאים מרוכזים מספיק, מספיק סיבוב עדין אחד כדי לפלוט כ-10 תאים.יש לגשת לקצה הנימי כנגד הרקטום האופטי השמאלי ממש מעל הווריד המוחי האמצעי. יש ללחוץ בעדינות על הנימים כנגד הזחלים עד שקרום העור נשבר. ברגע שמגיעים למיקום מתאים בטקטום האופטי, מוציאים את התאים.בזהירות להתבונן בקצה של נימי כדי לדמיין את זרם התאים הולך בתוך החיה ובכך להבטיח הזרקה מוצלחת. חזור על ההליך עבור בעלי חיים רבים ככל הנדרש. בהתאם למהירות ההזרקה של הנסיין, ייתכן שיהיה צורך בהחלפת מחט כל 10 עד 20 זחלים עקב התגבשות מהירה של תאים בנימי.לאחר השלמת השתלת הקסנו, הסר את הזחל מצלחת המיקרו-הזרקות ובודד אותם בצלחת באר 24 מלאה במים ממקור מינרלי PTU ומדיום כחול מתילן. הכינו תמיסת AH-KROH עם התכה נמוכה ב-1%. העבירו 500 מיקרוליטרים של תמיסת AH-KROH מותכת 1% נמוכה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ותנו לו להתקרר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על בלוק חום.מוסיפים 160 מיקרוגרם לליטר טריקיין ל-AH-KROHS ומערבבים היטב. העבירו זחל אחד עד ארבעה זחלי קסנוגרפט לצלחת פטרי באורך 3.5 ס"מ מלאה במים ממקור מינרלי PTU ומדיום מתילן בתוספת 160 מיקרוגרם לליטר טריקאין. לאחר שהזחל מורדם ואינו מגיב לחלוטין למגע, העבירו אותם בזהירות לתוך הצינור המכיל את ה- AH-KROHS והטריקיין באמצעות פיפטה עדינה להעברת חוד עדין.מערבבים בעדינות את הזחל עם AH-KROHS. באמצעות פיפטה גדולה להעברת נורה, הנח את הזחלים המעורבים ב- AH-KROHS על מרכז צלחת הדמיית וידאו עם תחתית זכוכית באורך 3.5 ס"מ תחת מיקרוסקופ סטריאו מקם במהירות את הזחלים על גבם. באמצעות קצה העמסה זעיר הסר AH-KROHS נוספים כדי לשמור על שכבת AH-KROHS הדקה ביותר האפשרית.לאחר AH-KROHS התמצק, להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום הדמיה. עבור הדמיה חיה in vivo, של דינמיקה microtubule בתאי גליובלסטומה פולשים, למקם את צלחת הדמיית וידאו המכילה את AH-KROHS מוטבע xenografted זחלים בתא הסביבתי של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם טמפרטורה שנקבעה על 32 מעלות צלזיוס. מצא את הזחלים בצלחת הדמיית הווידאו עם מטרה של פי 10 באמצעות שלב XY ממונע.לחץ על Escape כדי להנמיך את צריח המטרות ולהוסיף שמן מינרלי על מטרת שמן 60x, ולחץ על Escape כדי לחזור למצב המוקד הראשוני. שימו לב לתאי הגליובלסטומה הפולשים בתעלה האדומה המוגדרת במקור לייזר של 561 ננומטר, 20% עוצמת לייזר וחשיפה בזמן של 200 אלפיות השנייה. לאחר מכן בחר תא עם רשת מיקרוטובולים פרושה וחוטי מיקרוטובול הניתנים להבחנה בקלות.קבע את ההגדרות של סדרת Z. באמצעות שלב piezo בטווח של 200 מיקרומטר, בחר את המיקומים העליונים והתחתונים של רשת המיקרוטובול, כאשר ערימת Z בעומק 10 עד 30 מיקרומטר מספיקה כדי לדמיין את הרשת המיקרוביאלית בבליטה של התא הנודד עם שלב פרוסת Z של 0.3 מיקרומטר. הגדר הגדרות רכישה של קיטועי זמן כדי לאפשר איזון אופטימלי בין מהירות הרכישה, עומק מחסנית Z ואות פלואורסצנטי כדי למנוע הלבנת תמונות מהירה.קבל תמונות של המיקרוטובולים כל חמש עד 10 שניות למשך מספר דקות ושמור את ערימת ההיפר-ממד 5D. הדינמיקה של המיקרוטובולים נמדדה על ידי בניית קימוגרף לאורך מיקרוטובולים גדלים ומתכווצים ומעקב ידני אחר קצוות מיקרוטובולים בודדים לאורך זמן. טיפול תרופתי הניתן במדיום הזחל והשפעתו ההפיכה על ארגון רשת המיקרוטובולים הוערך על ידי טיפול במינון של 200 ננומולרים של נוקודאזול.זה הוביל להתכווצות הדרגתית של רשת המיקרוטובולים ולהיעלמות של בליטה של תאי גליובלסטומה לאחר ארבע שעות. שטיפת התרופה החזירה את יכולתם של תאי גליובלסטומה ליצור בליטות. התאים חזרו לנדוד לאורך כלי הדם 12 שעות לאחר ההדחה, מה שמצביע על כך שמינון של 200 ננומול של נוקודזול הספיק כדי לשבש את רשת המיקרוטובול ולחסום במהירות פלישה של תאי גליובלסטומה in vivo.ניתוח בן שלושה ימים של אותו טיפול על פלישת תאי גליובלסטומה גלובלית גילה כי הנוקודזול עצר פלישה ארוכת טווח של תאי גליובלסטומה in vivo מבלי להשפיע על הבריאות הכללית של הדגים בהשוואה לבקרה. זכרו להתחיל עם זחלים בריאים שלושה ימים לאחר ההפריה כדי לרכז את התאים לתוך הנימי, למזער את הנפח המוזרק במוח, וליצור מסת גידול ייחודית, ונסו להימנע מהזרקה לחדרי המוח.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...