Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Siamo estremamente grati al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) e al suo laboratorio, in particolare Valérie Briolat, ed Emma Colucci-Guyon per averci fornito le linee zebrafish e lo stampo in plastica per le piastre di microiniezione, e per la loro preziosa esperienza sulle procedure sperimentali del pesce zebra. Riconosciamo con gratitudine UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, supportato dall'Agenzia nazionale francese per la ricerca France BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimenti per il futuro). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), il Centre National de la Recherche Scientifique, e l'Institut Pasteur e dalle generose donazioni della Sig.ra Marguerite MICHEL e del Sig. Porquet.

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida dell'Unione europea per la manipolazione di animali da laboratorio. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut Pasteur - CEEA 89 e dal Ministero della Ricerca e dell'Istruzione francese (permesso #01265.03). Durante le iniezioni o le sessioni di imaging dal vivo, gli animali sono stati anestetizzati con Tricaine.At la fine delle procedure sperimentali, sono stati eutanizzati da overdose di...

È probabile che l'imaging di xenotrapianti tumorali a risoluzione singola cellulare diventi uno strumento indispensabile per migliorare la nostra comprensione della biologia GBM. L'imaging dal vivo nei modelli PDX murini ha portato a preziose scoperte su come GBM invade collettivamente il tessuto cerebrale18. Tuttavia, ad oggi, la risoluzione spaziotemporale non è abbastanza alta da rivelare la dinamica delle proteine che controllano l'invasione GBM. Abbiamo ragionato che accoppiando l'attecchim...

La motilità cellulare è un processo stereotipato che richiede la creazione dell'asse di polarità e riarrangiamenti citoscheletrici generatori di forza. La polimerizzazione dell'actina e la sua associazione con la miosina sono riconosciute come i principali contributori alle forze protrusive e contrattili richieste per il movimento cellulare1. I microtubuli sono considerati i principali attori della polarizzazione cellulare e della persistenza direzionale durante la migrazione2. Negli ultimi anni, le MT hanno anche dimostrato di creare e stabilizzare protrusioni per supportare le forze di meccanocompressione durante l'invasione cellulare in 3D3. Più recentemente, le MT sono state direttamente coinvolte nella meccanotrasduzione alle aderenze focali e nella migrazione meccanosensibile4. L'instabilità dinamica che caratterizza la dinamica finale MT-plus è costituita da ripetute fasi di polimerizzazione (crescita) e depolimerizzazione (restringimento), che sono controllate da una pletora di proteine leganti i microtubuli e cascate di segnalazione intracellulare, come quelle governate dalle RHO-GTPasi 5,6,7. Il ruolo della rete MT nella migrazione e nell'invasione cellulare ha reso lo studio delle dinamiche MT un elemento chiave per comprendere meglio i meccanismi di homing delle cellule immunitarie, guarigione delle ferite e invasione del cancro.
La capacità delle cellule tumorali di sfuggire al nucleo tumorale primario, diffondersi nei tessuti e generare tumori secondari è un passo fondamentale per prevenire il successo globale nella guerra contro il cancro dichiarata 50 anni fa 8,9. Uno dei maggiori ostacoli è stato capire come le cellule tumorali invadono attivamente il tessuto. I meccanismi chiave di invasione si basano sugli stessi principi di quelli che governano la migrazione cellulare non tumorale10. Tuttavia, le specificità di migrazione delle cellule tumorali sono emerse11, innescando la necessità di una migliore caratterizzazione di questo tipo di migrazione. In particolare, poiché il microambiente tumorale appare come un attore chiave nella progressione del cancro12, osservare e analizzare l'invasione delle cellule tumorali in un contesto fisiologico rilevante è essenziale per svelare i meccanismi di disseminazione delle cellule tumorali.
Le MT sono fondamentali per la progressione del cancro, per sostenere sia la proliferazione che l'invasione. Un'analisi precisa della dinamica della MT in situ può aiutare a identificare gli agenti che alterano la MT (MTA) in entrambi i processi. Le dinamiche MT variano drasticamente in base a un cambiamento di ambiente. In vitro, il trattamento con agenti destabilizzanti MT come il nocodazolo previene la formazione di protrusione cellulare quando le cellule sono incorporate in gel in 3D, mentre ha scarso effetto sulla migrazione cellulare 2D13,14. Sebbene tecnicamente impegnativi, i progressi nell'imaging intravitale consentono l'analisi in vivo della dinamica MT durante l'invasione delle cellule tumorali. Ad esempio, l'osservazione di MT in cellule di fibrosarcoma xenotrapiantate per via sottocutanea nei topi ha rivelato che i macrofagi associati al tumore influenzano la dinamica della MT nelle cellule tumorali15. Tuttavia, questi modelli murini comportano ampie procedure chirurgiche e rimangono insoddisfacenti per i tumori meno accessibili, come il tumore cerebrale altamente invasivo, GBM.
Nonostante un triste tempo medio di sopravvivenza di 15 mesi16, poco si sa sulla modalità di diffusione del GBM all'interno del parenchima cerebrale o sugli elementi molecolari chiave che sostengono l'invasione delle cellule GBM nel tessuto cerebrale. Il miglioramento del modello di xenotrapianto ortotopico murino (PDX) e la creazione di finestre craniche hanno offerto nuove prospettive per gli studi sull'invasione delle cellule GBM17,18. Tuttavia, a causa della qualità di imaging non ottimale, questo modello ha permesso principalmente l'imaging longitudinale di xenotrapianti superficiali e finora non è stato utilizzato con successo per studiare l'imaging subcellulare delle proteine del citoscheletro. Inoltre, sulla scia dell'ingiunzione "3R" di ridurre l'uso di roditori e sostituirli con vertebrati inferiori, sono stati stabiliti modelli alternativi.
Sfruttando l'immunità primitiva osservata nelle larve di zebrafish (Danio rerio), l'iniezione ortotopica di cellule GBM nel cervello del pesce è stata sviluppata 19,20,21. L'iniezione in prossimità dei ventricoli nel mesencefalo in via di sviluppo ricapitola la maggior parte della fisiopatologia umana del GBM21, e lo stesso modello preferito di invasione GBM come nella cooptazione uomo-vaso - è osservato22. Grazie alla trasparenza delle larve di pesce, questo modello consente la visualizzazione delle cellule GBM che invadono il cervello dalle aree peri-ventricolari dove si pensa che la maggior parte dei GBM si verifichino23.
Poiché le MT sono essenziali per l'invasione delle cellule GBM in vitro24,25, è necessaria una migliore caratterizzazione della dinamica della MT e l'identificazione dei regolatori chiave durante l'invasione cellulare. Tuttavia, ad oggi, i dati generati con il modello ortotopico zebrafish non hanno incluso l'analisi subcellulare delle dinamiche MT durante il processo di invasione. Questo articolo fornisce un protocollo per studiare le dinamiche della MT in vivo e determinare il suo ruolo durante l'invasione del cancro al cervello. A seguito di una marcatura stabile dei microtubuli, le cellule GBM vengono microiniettate a 3 dpf nel cervello delle larve di zebrafish e visualizzate in tempo reale ad alta risoluzione spazio-temporale durante la loro progressione nel tessuto cerebrale. L'imaging live di MT fluorescenti consente l'analisi qualitativa e quantitativa delle dinamiche plus-end di MT. Inoltre, questo modello consente di valutare in tempo reale l'effetto degli MTA sulla dinamica della MT e sulle proprietà invasive delle cellule GBM. Questo protocollo relativamente non invasivo combinato con un gran numero di larve gestite alla volta e la facilità di applicazione del farmaco (nell'acqua del pesce) rende il modello una risorsa per i test preclinici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Con un triste tempo di sopravvivenza mediano nelle popolazioni reali - tra 6 e 15 mesi - il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno più devastante. Il fallimento del trattamento è dovuto principalmente all'invasività delle cellule GBM, che parla della necessità di una migliore comprensione delle proprietà mobili GBM. Per studiare il meccanismo molecolare che supporta l'invasione del GBM, sono necessari nuovi modelli fisiologici che consentano una caratterizzazione approfondita della dinamica delle proteine durante l'invasione. Queste osservazioni aprirebbero la strada alla scoperta di nuovi bersagli per bloccare l'infiltrazione tumorale e migliorare i risultati dei pazienti. Questo articolo riporta come uno xenotrapianto ortotopico di cellule GBM nel cervello del pesce zebra consenta l'imaging dal vivo intravitale subcellulare. Concentrandoci sui microtubuli (MT), descriviamo una procedura per l'etichettatura MT nelle cellule GBM, la microiniezione di cellule GBM nel cervello trasparente delle larve di zebrafish 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), l'imaging intravitale delle MT negli xenotrapianti disseminanti, l'alterazione della dinamica della MT per valutare il loro ruolo durante l'invasione GBM e l'analisi dei dati acquisiti.

Per analizzare il ruolo svolto dalle MT durante l'invasione GBM in vivo, descriviamo qui i principali passi per eseguire la marcatura MT stabile nelle cellule GBM mediante infezione lentivirale, xenotrapianti ortotopici di cellule GBM in larve di zebrafish 3 dpf, imaging intravitale ad alta risoluzione della dinamica MT, trattamento MTA e suoi effetti sull'invasione GBM e analisi delle immagini della dinamica MT e invasione in vivo (Figura 1). La dinamica ...

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Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Questo metodo è dedicato allo studio del ruolo dei microtubuli durante l'invasione del cancro al cervello accoppiando l'iniezione atopica di cellule tumorali cerebrali nel pesce zebra all'imaging intravitale subcellulare. Il principale vantaggio della tecnica risiede nell'elevata risoluzione temporale spaziale alla quale viene acquisito il citoscheletro dei microtubuli. È unico per i modelli di invasione del cancro cerebrale in vivo e consente un'analisi approfondita della dinamica dei microtubuli.L'imaging subcellulare dell'invasione delle cellule tumorali cerebrali in situ può essere utilizzato per l'analisi di qualsiasi proteina di interesse potenzialmente coinvolta nell'invasione del cancro. Per iniziare, lavare le cellule di glioblastoma coltivate a 37 gradi Celsius con PBS. Staccare le cellule aggiungendo un millilitro di 0,05% di tripsina EDTA e incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore cellulare fino a quando tutte le cellule sono completamente staccate.Risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo cellulare completo di glioblastoma in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 45 millilitri di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con un millilitro di PBS ghiacciato pipettando su e giù accuratamente.Aggiungere altri 49 millilitri di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS ghiacciato. Conservare su ghiaccio per tutta la durata della procedura di trapianto.Per microiniettare le cellule di glioblastoma nel mesencefalo delle larve di zebrafish, riempire una piastra di microiniezione con sei millilitri di terreno E3 integrato con 160 milligrammi per litro di tricaina. Trasferire una dozzina di larve di DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED nella piastra di microiniezione. Una volta che le larve sono anestetizzate, e completamente insensibili al tatto, allineatele nelle trincee su un fianco, testa in su e il sacco vitellino spinto contro il muro della trincea con un pennello di taglia 00.Quindi caricare cinque microlitri di cellule di glioblastoma nel micro capillare utilizzando punte di microcaricamento e inserire il capillare nel supporto capillare universale. Posizionare la piastra di microiniezione contenente le larve anestetizzate sul palco del microscopio stereo. Posizionare la punta del micro-capillare sul bordo della piastra di microiniezione utilizzando le manopole del micromanipolatore.Quindi romperlo con un bisturi per creare un punto di ingresso affilato delle dimensioni del diametro di una cella. Verificare che le cellule stiano fuoriuscendo dal capillare facendo scorrere delicatamente l'olio nel microiniettore e immergendo la punta dell'ago nel mezzo. Concentrare le cellule sulla punta del capillare per massimizzare il numero di cellule iniettate per volume iniettato ed evitare di riempire il tessuto cerebrale con PBS.Esaminare attentamente le cellule che escono dal micro capillare mentre l'olio viene introdotto manualmente nell'iniettore. Definire empiricamente il numero di giri necessari sulla manopola manuale per fornire da 20 a 50 celle. In genere, se le cellule sono abbastanza concentrate, è sufficiente un giro delicato per espellere circa 10 cellule.Avvicina la punta del capillare contro il tectum ottico sinistro appena sopra la vena cerebrale media. Premere delicatamente il capillare contro le larve fino a quando la membrana cutanea si rompe. Una volta raggiunta una posizione adatta nel tectum ottico, espellere le cellule.Osservare attentamente la punta del capillare per visualizzare il flusso di cellule che entrano all'interno dell'animale, garantendo così un'iniezione di successo. Ripetere la procedura per tutti gli animali necessari. A seconda della velocità con cui lo sperimentatore è in fase di iniezione, potrebbe essere necessario un cambio di ago ogni 10-20 larve a causa del rapido aggregazione delle cellule nel capillare.Una volta completato il trapianto di xeno, rimuovere la larva dalla piastra di microiniezione e individuarla in una piastra da 24 pozzetti riempita con acqua minerale PTU e terreno blu di metilene. Preparare una soluzione AH-KROH a basso punto di fusione all'1%. Trasferire 500 microlitri di soluzione bollita di AH-KROH all'1% a basso punto di fusione in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri e lasciarlo raffreddare a 37 gradi Celsius su un blocco termico.aggiungere 160 microgrammi per litro di tricaina all'AH-KROHS e mescolare bene. Trasferire da una a quattro larve xenotrapiantate in una capsula di Petri di 3,5 centimetri riempita con acqua minerale PTU e terreno di metilene integrata con 160 microgrammi per litro di tricaina. Una volta che le larve sono anestetizzate e completamente insensibili al tatto, trasferirle con cura nel tubo contenente AH-KROHS e tricaina usando una pipetta di trasferimento a punta fine.Mescolare delicatamente la larva con AH-KROHS. Utilizzando una grande pipetta di trasferimento del bulbo, posizionare le larve mescolate nell'AH-KROHS al centro di una parabola di imaging video con fondo di vetro da 3,5 centimetri Sotto un microscopio stereoscopico posizionare rapidamente le larve sul dorso. Utilizzando una punta di micro caricamento, rimuovere AH-KROHS extra per mantenere lo strato AH-KROHS più sottile possibile.Una volta che AH-KROHS si è solidificato, aggiungere 2,5 millilitri di supporto di imaging. Per l'imaging live in vivo, della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma invasori, posizionare la parabola di imaging video contenente le larve xenotrapiantate incorporate AH-KROHS nella camera ambientale di un microscopio confocale invertito con una temperatura impostata a 32 gradi Celsius. Trova le larve nella parabola di imaging video con un obiettivo 10x utilizzando uno stadio XY motorizzato.Premere Esc per abbassare la torretta degli obiettivi e aggiungere olio minerale su un obiettivo 60x dell'olio, quindi premere Esc per tornare alla posizione focale iniziale. Osservare le cellule di glioblastoma invasori nel canale rosso impostato su una sorgente laser a 561 nanometri, potenza laser del 20% e un'esposizione temporale di 200 millisecondi. Quindi selezionare una cella con una rete di microtubuli diffusa e filamenti di microtubuli facilmente distinguibili.Impostare le impostazioni della serie Z. Utilizzando uno stadio piezoelettrico di 200 micrometri, selezionare le posizioni superiore e inferiore della rete di microtubuli in cui è sufficiente uno stack Z profondo da 10 a 30 micrometri per visualizzare la rete microbica nella sporgenza della cellula migrante con un passo di fetta Z di 0,3 micrometri. Imposta le impostazioni di acquisizione time lapse per consentire un equilibrio ottimale tra velocità di acquisizione, profondità Z-stack e segnale fluorescente per evitare un rapido sbiancamento delle foto.Acquisisci immagini dei microtubuli ogni cinque-10 secondi per diversi minuti e salva l'hyper-stack 5D. La dinamica dei microtubuli è stata misurata costruendo un cimografo lungo i microtubuli in crescita e in contrazione e tracciando manualmente i singoli bordi dei microtubuli nel tempo. Il trattamento farmacologico somministrato nel terreno larvale e il suo effetto reversibile sull'organizzazione della rete di microtubuli è stato valutato trattando con una dose di 200 nanomolari di nocodazolo.Ciò ha portato al progressivo restringimento della rete di microtubuli e alla scomparsa della protrusione delle cellule di glioblastoma dopo quattro ore. Il lavaggio del farmaco ha ripristinato la capacità delle cellule di glioblastoma di formare sporgenze. Le cellule hanno ripreso a migrare lungo la vascolarizzazione 12 ore dopo il washout, indicando che un dosaggio di 200 nanomole di nocodazolo era sufficiente per interrompere la rete di microtubuli e bloccare rapidamente l'invasione delle cellule di glioblastoma in vivo.Un'analisi di tre giorni dello stesso trattamento sull'invasione globale delle cellule di glioblastoma ha rivelato che il nocodazolo ha fermato l'invasione delle cellule di glioblastoma a lungo termine in vivo senza influire sulla salute generale del pesce rispetto a un controllo. Ricorda di iniziare con larve sane tre giorni dopo la fecondazione per concentrare le cellule nel capillare, per ridurre al minimo il volume iniettato nel cervello e per formare una massa tumorale unica e cercare di evitare l'iniezione nei ventricoli cerebrali.

Research

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Biology

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