Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Vi er svært takknemlige til Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrike) og hans laboratorium, spesielt Valérie Briolat, og Emma Colucci-Guyon for å gi oss sebrafisklinjene og plastformen for mikroinjeksjonsplater, og for deres verdifulle ekspertise på sebrafiskeksperimentelle prosedyrer. Vi anerkjenner takknemlig UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået France BioImaging, og ANR-10-INBS-04; investeringer for fremtiden). Dette arbeidet ble støttet av Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique, og Institut Pasteur og ved generøse donasjoner fra fru Marguerite MICHEL og Mr. Porquet.

Dyreforsøk ble utført i henhold til EUs retningslinjer for håndtering av forsøksdyr. Alle protokoller ble godkjent av Etisk komité for dyreforsøk ved Institut Pasteur - CEEA 89 og det franske forsknings- og utdanningsdepartementet (tillatelse #01265.03). Under injeksjoner eller levende bildebehandlingsøkter ble dyrene bedøvet med Tricaine.At slutten av eksperimentelle prosedyrer, ble de avlivet ved bedøvelsesoverdosering. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til materialer, utstyr og pr...

Avbildning av tumorxenotransplantater ved encellet oppløsning vil sannsynligvis bli et uunnværlig verktøy for å forbedre vår forståelse av GBM-biologi. Live imaging i mus PDX-modeller har ført til verdifulle funn om hvordan GBM kollektivt invaderer hjernevevet18. Til dags dato er imidlertid den spatiotemporale oppløsningen ikke høy nok til å avsløre dynamikken til proteiner som kontrollerer GBM-invasjon. Vi resonnerte at ved å koble den ortotopiske engraftingen av GBM-celler i gjennoms...

Cellemotilitet er en stereotyp prosess som krever etablering av polaritetsakser og kraftgenererende cytoskeletale omorganiseringer. Actinpolymerisasjon og dets tilknytning til myosin er anerkjent som de viktigste bidragsyterne til fremspringende og kontraktile krefter som kreves for cellebevegelse1. Mikrotubuli anses å være hovedaktørene i cellepolarisering og retningsbestemt utholdenhet under migrasjon2. I de senere år har MT-er også vist seg å skape og stabilisere fremspring for å støtte mekanokomprimerende krefter under celleinvasjon i 3D3. Mer nylig har MTs vært direkte involvert i mekanotransduksjon ved fokale adhesjoner og mekanosensitiv migrasjon4. Den dynamiske ustabiliteten som karakteriserer MT-pluss endedynamikk er laget av gjentatte faser av polymerisasjon (vekst) og depolymerisering (krymping), som styres av en mengde mikrotubulibindende proteiner og intracellulære signalkaskader, som de som styres av RHO-GTPases 5,6,7. MT-nettverkets rolle i cellemigrasjon og invasjon har gjort undersøkelsen av MT-dynamikk til et nøkkelelement for bedre å forstå mekanismene for immuncelle homing, sårheling og kreftinvasjon.
Kreftcellenes evne til å unnslippe den primære tumorkjernen, spre seg i vevet og generere sekundære svulster er et kritisk skritt for å forhindre global suksess i krigen mot kreft som ble erklært for 50 år siden 8,9. En av de største hindringene har vært å forstå hvordan kreftceller aktivt invaderer vevet. Viktige invasjonsmekanismer er avhengige av de samme prinsippene som de som styrer ikke-tumorcellemigrasjon10. Imidlertid har kreftcellemigrasjonsspesifikasjoner dukket opp11, noe som utløser behovet for bedre karakterisering av denne typen migrasjon. Spesielt fordi tumormikromiljøet fremstår som en nøkkelspiller i kreftprogresjon12, er det viktig å observere og analysere kreftcelleinvasjon i en relevant fysiologisk sammenheng for å avdekke mekanismene for kreftcellespredning.
MTs er sentrale for kreftprogresjon, for å opprettholde både spredning og invasjon. Presis analyse av MT-dynamikk in situ kan bidra til å identifisere MT-altering agents (MTA) i begge prosesser. MT-dynamikken varierer drastisk på en endring i miljøet. In vitro forhindrer behandling med MT-destabiliserende midler som nocodazol dannelse av cellefremspring når celler er innebygd i geler i 3D, mens det har liten effekt på 2D-cellemigrasjon13,14. Selv om det er teknisk utfordrende, tillater fremskritt innen intravital bildebehandling in vivo-analyse av MT-dynamikk under kreftcelleinvasjon. For eksempel viste observasjonen av MTs i subkutant xenograferte fibrosarkomceller hos mus at tumorassosierte makrofager påvirker MT-dynamikken i tumorceller15. Imidlertid involverer disse musemodellene omfattende kirurgiske prosedyrer og forblir utilfredsstillende for mindre tilgjengelige kreftformer, for eksempel den svært invasive hjernesvulsten, GBM.
Til tross for en dyster 15 måneders gjennomsnittlig overlevelsestid16, er lite kjent om GBMs spredningsmåte i hjernens parenchyma eller de viktigste molekylære elementene som opprettholder GBM-celleinvasjon i hjernevevet. Forbedring i mus ortotopisk xenograft (PDX) modell og etablering av kraniale vinduer ga nye muligheter for GBM celle invasjonsstudier17,18. På grunn av suboptimal bildekvalitet har denne modellen imidlertid stort sett tillatt langsgående avbildning av overfladiske xenotransplantater og har ikke blitt brukt til å studere subcellulær avbildning av cytoskelettproteiner så langt. Videre, i kjølvannet av "3Rs" -påbudet for å redusere bruken av gnagere og erstatte dem med lavere vertebrater, er det etablert alternative modeller.
Ved å dra nytte av den primitive immuniteten observert i sebrafisk (Danio rerio) larver, ble ortotopisk injeksjon av GBM-celler i fiskehjernen utviklet 19,20,21. Injeksjon i nærheten av ventriklene i den utviklende midthjernen rekapitulerer det meste av human GBM-patofysiologi21, og det samme foretrukne mønsteret av GBM-invasjon som hos mennesker - fartøy co-option - observeres22. Takket være gjennomsiktigheten til fiskelarvene, tillater denne modellen visualisering av GBM-celler som invaderer hjernen fra de peri-ventrikulære områdene der de fleste GBM antas å oppstå23.
Fordi MT-er er avgjørende for GBM-celleinvasjon in vitro24,25, er det nødvendig med en bedre karakterisering av MT-dynamikk og identifisering av nøkkelregulatorer under celleinvasjon. Dataene som genereres med sebrafiskens ortotopiske modell har imidlertid til dags dato ikke inkludert subcellulær analyse av MT-dynamikk under invasjonsprosessen. Dette papiret gir en protokoll for å studere MT-dynamikk in vivo og bestemme dens rolle under hjernekreft invasjon. Etter stabil mikrotubulimerking blir GBM-celler mikroinjisert ved 3 dpf i sebrafisklarvens hjerner og avbildet i sanntid ved høy spatio-temporal oppløsning under deres progresjon i hjernevevet. Live imaging av fluorescerende MT-er tillater kvalitativ og kvantitativ analyse av MT plus-end-dynamikk. Videre gjør denne modellen det mulig å vurdere effekten av MTA-er på MT-dynamikk og på de invasive egenskapene til GBM-celler i sanntid. Denne relativt ikke-invasive protokollen kombinert med et stort antall larver som håndteres om gangen og den enkle legemiddelapplikasjonen (i fiskevannet) gjør modellen til en ressurs for preklinisk testing.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Med en dyster median overlevelsestid i virkelige populasjoner - mellom 6 og 15 måneder - er glioblastom (GBM) den mest ødeleggende ondartede hjernesvulsten. Behandlingssvikt skyldes hovedsakelig invasiviteten til GBM-celler, noe som taler for behovet for en bedre forståelse av GBM motile egenskaper. For å undersøke den molekylære mekanismen som støtter GBM-invasjon, er det nødvendig med nye fysiologiske modeller som muliggjør grundig karakterisering av proteindynamikk under invasjon. Disse observasjonene vil bane vei for oppdagelsen av nye mål for å blokkere tumorinfiltrasjon og forbedre pasientresultatene. Denne artikkelen rapporterer hvordan en ortotopisk xenograft av GBM-celler i sebrafiskhjernen tillater subcellulær intravital levende avbildning. Med fokus på mikrotubuli (MT), beskriver vi en prosedyre for MT-merking i GBM-celler, mikroinjisering av GBM-celler i den gjennomsiktige hjernen 3 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver, intravital avbildning av MT i de formidlende xenograftene, endring av MT-dynamikk for å vurdere deres rolle under GBM-invasjon, og analyse av de oppkjøpte dataene.

For å analysere rollen som MT-er spiller under in vivo GBM-invasjon, beskriver vi her de viktigste trinnene for å utføre stabil MT-merking i GBM-celler ved lentiviral infeksjon, ortotopisk xenotransplantasjon av GBM-celler i 3 dpf sebrafisklarver, høyoppløselig intravital avbildning av MT-dynamikk, MTA-behandling og dens effekter på GBM-invasjon, og bildeanalyse av MT-dynamikk og in vivo-invasjon (figur 1). MT-dynamikk måles enten ved å bygge kymog...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Vi rapporterer en teknikk som tillater levende avbildning av mikrotubulidynamikk i glioblastom (GBM) celler som invaderer et vertebrat hjernevev. Kobling av ortotopisk injeksjon av fluorescerende merkede GBM-celler til en gjennomsiktig sebrafiskhjerne med høyoppløselig intravital avbildning gjør det mulig å måle cytoskelettdynamikk under in situ kreftinvasjon.

Levende avbildning av mikrotubulidynamikk i glioblastomceller som invaderer sebrafiskhjernen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Denne metoden er dedikert til undersøkelsen av mikrotubuliens rolle under hjernekreftinvasjon ved å koble atopisk injeksjon av hjernekreftcelle i sebrafisk til den subcellulære intravitale avbildningen. Den største fordelen med teknikken ligger i den høye romlige tidsoppløsningen der mikrotubulicytoskelettet er anskaffet. Det er unikt for in vivo hjernekreft invasjonsmodeller, og det tillater grundig analyse av mikrotubulidynamikk.Den subcellulære avbildningen av in situ hjernekreftcelleinvasjon kan brukes til analyse av ethvert protein av interesse som potensielt er involvert i kreftinvasjon. Til å begynne med, vask glioblastomcellene dyrket ved 37 grader Celsius med PBS. Løsne cellene ved å legge til en milliliter 0, 05% Trypsin EDTA og inkubere i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius i celleinkubatoren til alle cellene er helt løsrevet.Resuspend cellene i fem milliliter komplett glioblastomcellemedium i et 50 milliliter sentrifugerør. Tilsett 45 ml iskald PBS og sentrifuge ved 134 ganger G i fem minutter. Kast supernatanten og resuspender cellene med en milliliter iskald PBS ved pipettering opp og ned grundig.Tilsett ytterligere 49 milliliter iskald PBS og sentrifuge ved 134 ganger G i fem minutter. Kast supernatanten og resuspender cellene i 200 mikroliter iskald PBS. Oppbevares på is i løpet av transplantasjonsprosedyren.For å mikroinjisere glioblastomcellene i sebrafisklarvene midthjernen, fyll en mikroinjeksjonsstøpt plate med seks milliliter E3 medium supplert med 160 milligram per liter tricaine. Overfør et dusin DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED larver inn i mikroinjeksjonsplaten. Når larven er bedøvet og helt uresponsiv for berøring, juster dem i grøftene på siden, hodet opp og eggeplommesekken presset mot veggen av grøften med en størrelse 00 pensel.Last deretter fem mikroliter glioblastomceller inn i mikrokapillæren ved hjelp av mikrobelastningsspisser og sett kapillæren inn i den universelle kapillærholderen. Plasser mikroinjeksjonsplaten som inneholder de bedøvede larvene på stereomikroskoptrinnet. Plasser spissen av mikrokapillæren på grensen til mikroinjeksjonsplaten ved hjelp av mikromanipulatorknappene.Bryt den deretter med en skalpell for å skape et skarpt inngangspunkt omtrent på størrelse med diameteren på en celle. Kontroller at celler strømmer ut av kapillæren ved forsiktig å kjøre olje i mikroinjektoren og kaste spissen av nålen inn i mediet. Konsentrer cellene på spissen av kapillæren for å maksimere antall celler injisert per injisert volum, og unngå å fylle hjernevævet med PBS.Undersøk nøye cellene som kommer ut av mikrokapillæren når olje manuelt føres inn i injektoren. Definer empirisk antall svinger som trengs på den manuelle knappen for å levere 20 til 50 celler. Vanligvis, hvis cellene er konsentrert nok, er en mild sving nok til å kaste ut omtrent 10 celler.Tilnærming spissen av kapillæren mot venstre optiske tectum like over den midterste cerebrale venen. Press kapillæren forsiktig mot larvene til hudmembranen går i stykker. Når en passende posisjon i det optiske tektumet er nådd, må du kaste ut cellene.Nøye observere spissen av kapillæren for å visualisere strømmen av celler som går inn i dyret og dermed sikre vellykket injeksjon. Gjenta prosedyren for så mange dyr som nødvendig. Avhengig av hvor raskt eksperimentøren er ved injeksjon, kan det være nødvendig med en nålskifte hver 10 til 20 larver på grunn av rask celleklumping i kapillæren.Når xenotransplantasjonen er fullført, fjern larven fra mikroinjeksjonsplaten og enkelt dem ut i en 24-brønnplate fylt med PTU med mineralkildevann og metylenblått medium. Forbered en 1% lavsmeltende AH-KROH-løsning. Overfør 500 mikroliter kokt 1% lavsmeltende AH-KROH-løsning til et 1,5 milliliter sentrifugerør, og la det avkjøles ved 37 grader Celsius på en varmeblokk.tilsett 160 mikrogram per liter tricaine til AH-KROHS og bland godt. Overfør en til fire xenograferte larver til en 3,5 centimeter petriskål fylt med mineralkildevann PTU og metylenmedium komplementert med 160 mikrogram per liter trikaine. Når larven er bedøvet og helt uresponsiv for berøring, overfør dem forsiktig inn i røret som inneholder AH-KROHS og tricaine ved hjelp av en fin spissoverføringspipette.Bland larven forsiktig med AH-KROHS. Bruk en stor pæreoverføringspipette til å plassere larvene blandet i AH-KROHS på midten av en glassbunnet 3,5 centimeter videoavbildningsfat Under et stereomikroskop plasserer du larvene raskt på ryggen. Bruk en mikrobelastningsspiss til å fjerne ekstra AH-KROHS for å opprettholde det tynneste mulige AH-KROHS-laget.Når AH-KROHS har størknet, tilsett 2,5 milliliter bildemedium. For in vivo levende avbildning, av mikrotubulidynamikk i invaderende glioblastomceller, plasser videobildeparabolen som inneholder AH-KROHS innebygde xenograferte larver i miljøkammeret til et omvendt konfokalt mikroskop med en temperatur satt til 32 grader Celsius. Finn larvene i videobildeparabolen med et 10x mål ved hjelp av et motorisert XY-trinn.Trykk på escape for å senke måltårnet og tilsett mineralolje på et 60x oljemål, og trykk på escape for å gå tilbake til den opprinnelige fokusposisjonen. Vær oppmerksom på de invaderende glioblastomcellene i den røde kanalen satt til 561 nanometer laserkilde, 20% lasereffekt og en tidseksponering på 200 millisekunder. Velg deretter en celle med et spredt mikrotubulinettverk og lett gjenkjennelige mikrotubulifilamenter.Angi innstillingene for Z-serien. Ved å bruke et piezo-trinn på 200 mikrometer, velg topp- og bunnposisjonene til mikrotubulinettverket der en 10 til 30 mikrometer dyp Z-stabel er nok til å visualisere det mikrobielle nettverket i fremspringet av den migrerende cellen med et Z-skivetrinn på 0,3 mikrometer. Still inn innstillinger for tidsforløp for å gi en optimal balanse mellom anskaffelseshastighet, Z-stackdybde og fluorescerende signal for å unngå rask fotobleking.Skaff deg bilder av mikrotubuli hvert femte til 10. sekund i flere minutter og lagre 5D-hyperstakken. Mikrotubulidynamikken ble målt ved å bygge kymograf langs voksende og krympende mikrotubuli og manuelt spore individuelle mikrotubulikanter over tid. Medikamentell behandling gitt i larvemediet og dets reversible effekt på mikrotubulinettverkets organisering ble vurdert ved behandling med en 200 nanomolær dose nokodazol.Dette førte til progressiv krymping av mikrotubulinettverket og forsvinning av glioblastomcellefremspring etter fire timer. Vasking av stoffet gjenopprettet kapasiteten til glioblastomceller for å danne fremspring. Cellene fortsatte å migrere langs vaskulaturen 12 timer etter utvaskingen, noe som indikerte at en 200 nanomoldose nocodazol var tilstrekkelig til å forstyrre mikrotubulinettverket og raskt blokkere in vivo glioblastomcelleinvasjon.En tre dager lang analyse av samme behandling på global glioblastomcelleinvasjon viste at nocodazolen stoppet langvarig glioblastomcelleinvasjon in vivo uten å påvirke fiskens generelle helse sammenlignet med en kontroll. Husk å starte med sunne tre dager etter befruktning larver for å konsentrere cellene inn i kapillæren, for å minimere volumet injisert i hjernen, og for å danne en unik tumormasse, og prøv å unngå injeksjon i hjernens ventrikler.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Levende primære celler

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...