Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Estamos extremamente gratos ao Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, França) e seu laboratório, especialmente Valérie Briolat e Emma Colucci-Guyon por nos fornecerem as linhas de peixe-zebra e o molde plástico para placas de microinjeção, e por sua valiosa experiência em procedimentos experimentais de peixe-zebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa da França BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimentos para o Futuro). Este trabalho foi apoiado pela Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), o Centre National de la Recherche Scientifique, e o Institut Pasteur e pelas generosas doações da Sra. Marguerite MICHEL e do Sr. Porquet.

As experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Institut Pasteur - CEEA 89 e pelo Ministério da Pesquisa e Educação da França (alvará nº 01265.03). Durante as injeções ou sessões de imagem ao vivo, os animais foram anestesiados com Tricaine.At final dos procedimentos experimentais, foram eutanasiados por overdose anestésica. Cons...

A imagem de xenoenxertos tumorais em resolução unicelular provavelmente se tornará uma ferramenta indispensável para melhorar nossa compreensão da biologia do GBM. Imagens ao vivo em modelos PDX de camundongos levaram a descobertas valiosas sobre como o GBM invade coletivamente o tecido cerebral18. No entanto, até o momento, a resolução espaço-temporal não é alta o suficiente para revelar a dinâmica das proteínas que controlam a invasão de GBM. Raciocinamos que, ao acoplar o enxerto ...

A motilidade celular é um processo estereotipado que requer o estabelecimento do eixo polaridade e rearranjos citoesqueléticos geradores de força. A polimerização da actina e sua associação com a miosina são reconhecidas como os principais contribuintes para as forças protrusivas e contráteis necessárias para o movimento celular1. Os microtúbulos são considerados os principais atores na polarização celular e na persistência direcional durante a migração2. Nos últimos anos, os MTs também demonstraram criar e estabilizar saliências para suportar forças mecanocompressivas durante a invasão celular em 3D3. Mais recentemente, os MTs têm estado diretamente envolvidos na mecanotransdução em aderências focais e migração mecanossensível4. A instabilidade dinâmica que caracteriza a dinâmica final MT-plus é composta por repetidas fases de polimerização (crescimento) e despolimerização (encolhimento), que são controladas por uma infinidade de proteínas ligadoras de microtúbulos e cascatas de sinalização intracelular, como as regidas por RHO-GTPases 5,6,7. O papel da rede de MT na migração e invasão celular tornou a investigação da dinâmica da MT um elemento-chave para entender melhor os mecanismos de homing de células imunes, cicatrização de feridas e invasão de câncer.
A capacidade das células cancerígenas de escapar do núcleo primário do tumor, se espalhar nos tecidos e gerar tumores secundários é um passo crítico na prevenção do sucesso global na guerra contra o câncer declarada há 50 anos 8,9. Um dos maiores obstáculos tem sido entender como as células cancerosas invadem ativamente o tecido. Os principais mecanismos de invasão baseiam-se nos mesmos princípios que regem a migração de células não tumorais10. No entanto, surgiram especificidades da migração de células cancerígenas11, desencadeando a necessidade de melhor caracterização desse tipo de migração. Especificamente, como o microambiente tumoral aparece como peça-chave na progressão do câncer12, observar e analisar a invasão de células cancerígenas em um contexto fisiológico relevante é essencial para desvendar os mecanismos de disseminação de células cancerígenas.
As MTs são fundamentais para a progressão do câncer, para sustentar tanto a proliferação quanto a invasão. A análise precisa da dinâmica da MT in situ pode ajudar a identificar os agentes de alteração da MT (MTA) em ambos os processos. A dinâmica da MT varia drasticamente após uma mudança no ambiente. In vitro, o tratamento com agentes desestabilizadores de MT, como o nocodazol, previne a formação de protrusão celular quando as células são incorporadas em géis em 3D, ao passo que tem pouco efeito sobre a migração celular 2D13,14. Embora tecnicamente desafiadores, os avanços na imagem intravital permitem a análise in vivo da dinâmica da MT durante a invasão de células cancerígenas. Por exemplo, a observação de MTs em células de fibrossarcoma xenoenxertado por via subcutânea em camundongos revelou que macrófagos associados a tumores afetam a dinâmica da MT em células tumorais15. No entanto, esses modelos de camundongos envolvem extensos procedimentos cirúrgicos e permanecem insatisfatórios para cânceres menos acessíveis, como o tumor cerebral altamente invasivo, GBM.
Apesar de um tempo médio de sobrevivência sombrio de15 meses 16, pouco se sabe sobre o modo de disseminação do GBM dentro do parênquima cerebral ou os principais elementos moleculares que sustentam a invasão celular do GBM no tecido cerebral. A melhora no modelo de xenoenxerto ortotópico (PDX) de camundongos e o estabelecimento de janelas cranianas ofereceram novas perspectivas para estudos de invasão celular de GBM17,18. No entanto, devido à qualidade de imagem abaixo do ideal, este modelo tem permitido principalmente imagens longitudinais de xenoenxertos superficiais e não tem sido usado com sucesso para estudar imagens subcelulares de proteínas do citoesqueleto até o momento. Além disso, na sequência da injunção "3Rs" para reduzir a utilização de roedores e substituí-los por vertebrados inferiores, foram estabelecidos modelos alternativos.
Aproveitando a imunidade primitiva observada em larvas de peixe-zebra (Danio rerio), desenvolveu-se a injeção ortotópica de células GBM no cérebro do peixe 19,20,21. A injeção nas proximidades dos ventrículos do mesencéfalo em desenvolvimento recapitula a maior parte da fisiopatologia do GBM humano21, e o mesmo padrão preferido de invasão do GBM que nos humanos - cooptação de vasos - é observado22. Graças à transparência das larvas de peixes, este modelo permite a visualização de células GBM que invadem o cérebro a partir das áreas peri-ventriculares onde se pensa que a maioria dos GBMs surge23.
Como as MTs são essenciais para a invasão celular de GBM in vitro24,25, é necessária uma melhor caracterização da dinâmica da MT e a identificação dos principais reguladores durante a invasão celular. No entanto, até o momento, os dados gerados com o modelo ortotópico do peixe-zebra não incluíram a análise subcelular da dinâmica da MT durante o processo de invasão. Este artigo fornece um protocolo para estudar a dinâmica da MT in vivo e determinar seu papel durante a invasão do câncer cerebral. Após a marcação estável dos microtúbulos, as células GBM são microinjetadas a 3 dpf no cérebro das larvas de peixe-zebra e fotografadas em tempo real em alta resolução espaço-temporal durante sua progressão no tecido cerebral. A imagem ao vivo de MTs fluorescentes permite a análise qualitativa e quantitativa da dinâmica MT plus-end. Além disso, este modelo permite avaliar o efeito dos MTAs na dinâmica da MT e nas propriedades invasivas das células GBM em tempo real. Este protocolo relativamente não invasivo combinado com um grande número de larvas manuseadas de cada vez e a facilidade de aplicação de drogas (na água de peixe) torna o modelo um trunfo para testes pré-clínicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Com um tempo de sobrevida mediano sombrio em populações reais - entre 6 a 15 meses - o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais devastador. A falha do tratamento deve-se principalmente à invasividade das células GBM, o que fala da necessidade de uma melhor compreensão das propriedades móveis do GBM. Para investigar o mecanismo molecular que suporta a invasão de GBM, são necessários novos modelos fisiológicos que permitam uma caracterização aprofundada da dinâmica das proteínas durante a invasão. Essas observações abririam o caminho para a descoberta de novos alvos para bloquear a infiltração tumoral e melhorar os resultados dos pacientes. Este artigo relata como um xenoenxerto ortotópico de células GBM no cérebro do peixe-zebra permite imagens intravitais subcelulares vivas. Com foco em microtúbulos (MTs), descrevemos um procedimento para marcação de MT em células GBM, microinjeção de células GBM no cérebro transparente de larvas de peixe-zebra 3 dias após a fertilização (dpf), imagem intravital de MTs nos xenoenxertos disseminadores, alteração da dinâmica de MT para avaliar seu papel durante a invasão de GBM e análise dos dados adquiridos.

Para analisar o papel desempenhado pelos MTs durante a invasão in vivo do GBM, descrevemos aqui os principais passos para realizar a marcação estável do MT em células GBM por infecção lentiviral, xenotransplante ortotópico de células GBM em larvas de peixe-zebra 3 dpf, imagens intravitais de alta resolução da dinâmica MT, tratamento MTA e seus efeitos na invasão GBM e análise de imagens da dinâmica MT e invasão in vivo (Figura 1). A dinâm...

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Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Este método é dedicado à investigação do papel dos microtúbulos durante a invasão do câncer cerebral, acoplando a injeção atópica de células cancerígenas cerebrais em peixes-zebra à imagem intravital subcelular. A principal vantagem da técnica reside na alta resolução temporal espacial em que o citoesqueleto dos microtúbulos é adquirido. É único para modelos de invasão de câncer cerebral in vivo e permite uma análise dinâmica de microtúbulos em profundidade.A imagem subcelular da invasão de células cancerígenas cerebrais in situ pode ser usada para a análise de qualquer proteína de interesse potencialmente envolvida na invasão do câncer. Para começar, lave as células de glioblastoma cultivadas a 37 graus Celsius com PBS. Desprenda as células adicionando um mililitro de 0,05% de tripsina EDTA e incubando por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius na incubadora de células até que todas as células estejam totalmente separadas.Ressuscite as células em cinco mililitros de meio celular de glioblastoma completo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Adicione 45 mililitros de PBS gelado e centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com um mililitro de PBS gelado, pipetando para cima e para baixo completamente.Adicione mais 49 mililitros de PBS gelado e centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de PBS gelado. Armazenar no gelo durante o procedimento de transplante.Para micro injetar as células de glioblastoma no mesencéfalo das larvas de peixe-zebra, preencha uma placa de microinjeção com seis mililitros de meio E3 suplementado com 160 miligramas por litro de tricaína. Transfira uma dúzia de larvas DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED para a placa de microinjeção. Uma vez que as larvas estejam anestesiadas e totalmente sem resposta ao toque, alinhe-as nas trincheiras de lado, a cabeça para cima e o saco vitelino empurrado contra a parede da trincheira com um pincel de tamanho 00.Em seguida, carregue cinco microlitros de células de glioblastoma no microcapilar usando pontas de microcarga e insira o capilar no suporte capilar universal. Coloque a placa de microinjeção contendo as larvas anestesiadas no estágio do microscópio estéreo. Coloque a ponta do microcapilar na borda da placa de microinjeção usando os botões do micromanipulador.Em seguida, quebre-o com um bisturi para criar um ponto de entrada afiado aproximadamente do tamanho do diâmetro de uma célula. Verifique se as células estão fluindo para fora do capilar passando suavemente o óleo no microinjetor e mergulhando a ponta da agulha no meio. Concentre as células na ponta do capilar para maximizar o número de células injetadas por volume injetado e evite encher o tecido cerebral com PBS.Examine cuidadosamente as células que saem do microcapilar à medida que o óleo é introduzido manualmente no injetor. Defina empiricamente o número de voltas necessárias no botão manual para entregar de 20 a 50 células. Normalmente, se as células estiverem concentradas o suficiente, uma volta suave é suficiente para ejetar aproximadamente 10 células.Aproxime-se da ponta do capilar contra o tecto óptico esquerdo, logo acima da veia cerebral média. Pressione suavemente o capilar contra as larvas até que a membrana da pele se rompa. Uma vez que uma posição adequada no tecto óptico é alcançada, ejete as células.Observe cuidadosamente a ponta do capilar para visualizar o fluxo de células que entram no interior do animal, garantindo assim uma injeção bem-sucedida. Repita o procedimento para quantos animais forem necessários. Dependendo da rapidez com que o experimentador está na injeção, uma mudança de agulha pode ser necessária a cada 10 a 20 larvas devido à rápida aglomeração celular no capilar.Uma vez que o transplante de xeno esteja completo, remova a larva da placa de microinjeção e isole-a em uma placa de 24 poços preenchida com PTU de água de fonte mineral e meio azul de metileno. Prepare uma solução AH-KROH de fusão de 1% de baixa. Transfira 500 microlitros de solução de AH-KROH fervida a 1% de baixa fusão para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e deixe-a esfriar a 37 graus Celsius em um bloco de calor.adicione 160 microgramas por litro de tricapina ao AH-KROHS e misture bem. Transfira de uma a quatro larvas xenoenxertadas para uma placa de Petri de 3,5 centímetros preenchida com água mineral PTU e meio de metileno complementado com 160 microgramas por litro de tricaína. Uma vez que as larvas estejam anestesiadas e totalmente sem resposta ao toque, transfira-as cuidadosamente para o tubo que contém o AH-KROHS e a tricadina usando uma pipeta de transferência de ponta fina.Misture suavemente a larva com o AH-KROHS. Usando uma pipeta de transferência de bulbo grande, coloque as larvas misturadas no AH-KROHS no centro de um prato de imagem de vídeo de 3,5 centímetros com fundo de vidro Sob um microscópio estéreo, posicione rapidamente as larvas em suas costas. Usando uma micro ponta de carga, remova AH-KROHS extra para manter a camada AH-KROHS mais fina possível.Uma vez que o AH-KROHS tenha se solidificado, adicione 2,5 mililitros de meio de imagem. Para a imagem in vivo in vivo, da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invasoras, coloque a placa de imagem de vídeo contendo as larvas xenoenxertadas embutidas AH-KROHS na câmara ambiental de um microscópio confocal invertido com uma temperatura definida em 32 graus Celsius. Encontre as larvas no prato de imagem de vídeo com uma objetiva de 10x usando um estágio XY motorizado.Pressione o escape para abaixar a torre de objetivos e adicione óleo mineral a um objetivo de óleo de 60x, e pressione o escape para voltar à posição focal inicial. Observe as células invasoras de glioblastoma no canal vermelho ajustado em fonte de laser de 561 nanômetros, 20% de potência do laser e uma exposição de tempo de 200 milissegundos. Em seguida, selecione uma célula com uma rede de microtúbulos espalhada e filamentos de microtúbulos facilmente distinguíveis.Defina as configurações da série Z. Usando um estágio piezo de alcance de 200 micrômetros, selecione as posições superior e inferior da rede de microtúbulos, onde uma pilha Z de 10 a 30 micrômetros de profundidade é suficiente para visualizar a rede microbiana na protrusão da célula migratória com um passo de fatia Z de 0,3 micrômetros. Defina as configurações de aquisição de lapso de tempo para permitir um equilíbrio ideal entre a velocidade de aquisição, a profundidade da pilha Z e o sinal fluorescente para evitar o rápido branqueamento de fotos.Adquira imagens dos microtúbulos a cada cinco a 10 segundos por vários minutos e salve a hiperpilha 5D. A dinâmica dos microtúbulos foi medida através da construção de quimógrafos ao longo de microtúbulos em crescimento e encolhimento e rastreando manualmente as bordas individuais dos microtúbulos ao longo do tempo. O tratamento medicamentoso administrado no meio larva e seu efeito reversível na organização da rede de microtúbulos foi avaliado pelo tratamento com uma dose nanomolar de 200 nocodazol.Isso levou ao encolhimento progressivo da rede de microtúbulos e ao desaparecimento da protrusão celular do glioblastoma após quatro horas. A lavagem da droga restaurou a capacidade das células do glioblastoma de formar saliências. As células voltaram a migrar ao longo da vasculatura 12 horas após o washout, indicando que uma dosagem de 200 nanomoles de nocodazol foi suficiente para interromper a rede de microtúbulos e bloquear rapidamente a invasão celular de glioblastoma in vivo.Uma análise de três dias do mesmo tratamento na invasão celular global do glioblastoma revelou que o nocodazol interrompeu a invasão celular de glioblastoma a longo prazo in vivo sem afetar a saúde geral dos peixes em comparação com um controle. Lembre-se de começar com larvas saudáveis três dias após a fertilização para concentrar as células no capilar, minimizar o volume injetado no cérebro e formar uma massa tumoral única e tentar evitar a injeção nos ventrículos cerebrais.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

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De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

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Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

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