Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Мы чрезвычайно благодарны доктору. Хербомелю (Институт Пастера, Франция) и его лаборатории, особенно Валери Бриола и Эмме Колуччи-Гийон за предоставление нам линий для рыбок данио и пластиковой формы для микроинъекционных пластин, а также за их ценный опыт в экспериментальных процедурах рыбок данио. Мы с благодарностью выражаем признательность UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, при поддержке Французского национального исследовательского агентства France BioImaging, и ANR-10-INBS-04; Инвестиции в будущее). Эта работа была поддержана Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Национальный центр научных исследований и Институт Пастера, а также благодаря щедрым пожертвованиям г-жи Маргариты МИШЕЛЬ и г-на Порке.

Эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Европейского Союза по обращению с лабораторными животными. Все протоколы были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных Института Пастера - CEEA 89 и Министерством исследований и образования ...

Визуализация опухолевых ксенотрансплантатов с одноклеточным разрешением, вероятно, станет незаменимым инструментом для улучшения нашего понимания биологии GBM. Живая визуализация в мышиных моделях PDX привела к ценным открытиям о том, как GBM коллективно вторгается в ткань мозга<sup class="xre...

Подвижность клеток является стереотипным процессом, требующим установления оси полярности и силообразующих цитоскелетных перестроек. Полимеризация актина и его связь с миозином признаны основными факторами, способствующими протрузивным и сократительным силам, необходимым для движения клеток1. Микротрубочки считаются основными действующими лицами в поляризации клеток и направленной персистенции во время миграции2. В последние годы было также показано, что МТ создают и стабилизируют протрузии для поддержки механокомпрессивных сил во время инвазии клеток в 3D3. В последнее время МТ принимают непосредственное участие в механотрансдукции при фокальных спайках и механочувствительной миграции4. Динамическая нестабильность, характеризующая конечную динамику МТ-плюс, состоит из повторяющихся фаз полимеризации (роста) и деполимеризации (усадки), которые контролируются множеством микротрубочек-связывающих белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, таких как управляемые RHO-GTPases 5,6,7. Роль сети МТ в миграции и инвазии клеток сделала исследование динамики МТ ключевым элементом для лучшего понимания механизмов самонаведения иммунных клеток, заживления ран и инвазии рака.
Способность раковых клеток покидать первичное ядро опухоли, распространяться в тканях и генерировать вторичные опухоли является критическим шагом в предотвращении глобального успеха в войне против рака, объявленной 50 лет назад 8,9. Одним из самых больших препятствий было понимание того, как раковые клетки активно вторгаются в ткани. Ключевые механизмы инвазии основаны на тех же принципах, что и те, которые управляют миграцией неопухолевых клеток10. Тем не менее, особенности миграции раковых клеток выявили11, что вызвало необходимость лучшей характеристики этого типа миграции. В частности, поскольку микроокружение опухоли выступает в качестве ключевого игрока в прогрессировании рака12, наблюдение и анализ инвазии раковых клеток в соответствующем физиологическом контексте имеет важное значение для разгадки механизмов распространения раковых клеток.
МТ играют центральную роль в прогрессировании рака, чтобы поддерживать как пролиферацию, так и инвазию. Точный анализ динамики МТ in situ может помочь идентифицировать МТ-изменяющие агенты (МТА) в обоих процессах. Динамика MT резко меняется в зависимости от изменения окружающей среды. In vitro лечение МТ-дестабилизирующими агентами, такими как нокодазол, предотвращает образование протрузии клеток, когда клетки встроены в гели в 3D, тогда как оно мало влияет на миграцию 2D клеток13,14. Несмотря на технические сложности, достижения в области прижизненной визуализации позволяют in vivo анализировать динамику МТ во время инвазии раковых клеток. Например, наблюдение МТ в подкожно ксенотрансплантированных клетках фибросаркомы у мышей показало, что опухолеассоциированные макрофаги влияют на динамику МТ в опухолевых клетках15. Тем не менее, эти мышиные модели включают обширные хирургические процедуры и остаются неудовлетворительными для менее доступных видов рака, таких как высокоинвазивная опухоль головного мозга, GBM.
Несмотря на мрачное 15-месячное среднее время выживания16, мало что известно о способе распространения GBM в паренхиме мозга или ключевых молекулярных элементах, поддерживающих инвазию клеток GBM в ткани мозга. Улучшение модели ортотопического ксенотрансплантата мышей (PDX) и создание черепных окон открыли новые перспективы для исследований инвазии клеток GBM17,18. Однако из-за неоптимального качества визуализации эта модель в основном позволяла продольную визуализацию поверхностных ксенотрансплантатов и до сих пор не была успешно использована для изучения субклеточной визуализации белков цитоскелетов. Кроме того, после введения запрета "3R" на сокращение использования грызунов и замену их низшими позвоночными были созданы альтернативные модели.
Используя преимущества примитивного иммунитета, наблюдаемого у личинок рыбок данио (Danio rerio), ортотопическая инъекция клеток GBM в мозг рыбы была разработана 19,20,21. Инъекция в непосредственной близости от желудочков в развивающемся среднем мозге рекапитулирует большую часть патофизиологии GBM человека21, и наблюдается та же предпочтительная картина инвазии GBM, что и у человека - ко-вариант сосудов -22. Благодаря прозрачности личинок рыб эта модель позволяет визуализировать клетки GBM, вторгающиеся в мозг из перижелудочковых областей, где, как полагают, возникает большинство GBM23.
Поскольку МТ необходимы для инвазии клеток GBM in vitro 24,25, необходима лучшая характеристика динамики МТ и идентификация ключевых регуляторов во время клеточной инвазии. Однако на сегодняшний день данные, полученные с помощью ортотопической модели рыбок данио, не включали субклеточный анализ динамики МТ в процессе инвазии. В данной работе представлен протокол для изучения динамики МТ in vivo и определения ее роли при инвазии рака мозга. После стабильной маркировки микротрубочек клетки GBM микроинъецируются с 3 dpf в мозг личинок рыбок данио и визуализируются в режиме реального времени с высоким пространственно-временным разрешением во время их прогрессирования в ткани мозга. Живая визуализация флуоресцентных МТ позволяет проводить качественный и количественный анализ динамики МТ плюс-энд. Кроме того, эта модель позволяет оценить влияние MTA на динамику MT и на инвазивные свойства клеток GBM в режиме реального времени. Этот относительно неинвазивный протокол в сочетании с большим количеством личинок, обрабатываемых одновременно, и простотой применения препарата (в рыбьей воде) делает модель активом для доклинических испытаний.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

С мрачным средним временем выживания в реальных популяциях - от 6 до 15 месяцев - глиобластома (GBM) является наиболее разрушительной злокачественной опухолью головного мозга. Неудача лечения в основном обусловлена инвазивностью клеток GBM, что говорит о необходимости лучшего понимания подвижных свойств GBM. Для исследования молекулярного механизма, поддерживающего инвазию GBM, требуются новые физиологические модели, позволяющие углубленно характеризовать динамику белка во время инвазии. Эти наблюдения проложат путь к открытию новых целей для блокирования инфильтрации опухоли и улучшения результатов лечения пациентов. В этой статье сообщается, как ортотопический ксенотрансплантат клеток GBM в мозге рыбок данио позволяет субклеточную прижизненную живую визуализацию. Сосредоточив внимание на микротрубочках (МТ), мы описываем процедуру маркировки МТ в клетках GBM, микроинъекции клеток GBM в прозрачный мозг через 3 дня после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио, прижизненной визуализации МТ в диссеминирующих ксенотрансплантатах, изменения динамики МТ для оценки их роли во время инвазии GBM и анализа полученных данных.

Чтобы проанализировать роль, которую играют MTs во время инвазии IN VIVO GBM, мы опишем здесь основные шаги по выполнению стабильной маркировки MT в клетках GBM лентивирусной инфекцией, ортотопической ксенотрансплантации клеток GBM в личинках рыбок данио 3 dpf, прижизненной визуализации дина...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Мы сообщаем о методе, позволяющем в реальном времени визуализировать динамику микротрубочек в клетках глиобластомы (GBM), вторгающихся в ткань мозга позвоночных. Соединение ортотопической инъекции флуоресцентно помеченных клеток GBM в прозрачный мозг рыбок данио с прижизненной визуализацией высокого разрешения позволяет измерять динамику цитоскелета во время инвазии рака in situ .

Живая визуализация динамики микротрубочек в клетках глиобластомы, вторгающихся в мозг рыбок данио

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Этот метод посвящен исследованию роли микротрубочек во время инвазии рака мозга путем связи атопической инъекции раковой клетки мозга у рыбок данио с субклеточной прижизненной визуализацией. Основное преимущество методики заключается в высоком пространственно-временном разрешении, при котором приобретается микротрубочка цитоскелет. Он уникален для моделей инвазии рака мозга in vivo и позволяет проводить углубленный анализ динамики микротрубочек.Субклеточная визуализация инвазии раковых клеток головного мозга in situ может быть использована для анализа любого белка, представляющего интерес, потенциально участвующего в инвазии рака. Для начала промыть клетки глиобластомы, культивируемые при 37 градусах Цельсия, PBS. Отделите клетки, добавив один миллилитр 0,05% трипсина ЭДТА и инкубируя в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия в клеточном инкубаторе, пока все клетки не будут полностью отделены.Повторное суспендирование клеток в пяти миллилитрах полной клеточной среды глиобластомы в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Добавьте 45 миллилитров ледяного холода PBS и центрифугу в 134 раза G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки одним миллилитром ледяного PBS путем тщательной пипетки вверх и вниз.Добавьте еще 49 миллилитров ледяного холода PBS и центрифугу в 134 раза G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах ледяного PBS. Хранить на льду на время процедуры трансплантации.Чтобы микроинъецировать клетки глиобластомы в личинки рыбок данио в среднем мозге, заполните микроинъекционную литую пластину шестью миллилитрами среды E3, дополненной 160 миллиграммами на литр трицина. Перенесите дюжину личинок DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED в микроинъекционную пластину. Как только личинки обезболиваются и полностью не реагируют на прикосновения, выравнивайте их в траншеях на боку, головой вверх и желточным мешочком прижимают к стене траншеи с помощью кисти размера 00.Затем загрузите пять микролитров клеток глиобластомы в микрокапилляр с помощью микрозагружающих наконечников и вставьте капилляр в универсальный капиллярный держатель. Поместите микроинъекционную пластину, содержащую обезболенных личинок, на ступень стереомикроскопа. Поместите кончик микрокапилляра на границу микроинъекционной пластины с помощью ручек микроманипулятора.Затем разбейте его скальпелем, чтобы создать резкую точку входа размером примерно с диаметр ячейки. Убедитесь, что клетки вытекают из капилляра, осторожно запуская масло в микроинжектор и погружая кончик иглы в среду. Сконцентрируйте клетки на кончике капилляра, чтобы максимизировать количество клеток, вводимых на каждый введенный объем, и избежать заполнения ткани мозга PBS.Внимательно изучите клетки, выходящие из микрокапилляра, так как масло вручную вводится в инжектор. Определите эмпирически количество оборотов, необходимое на ручной ручке для подачи от 20 до 50 ячеек. Как правило, если клетки достаточно сконцентрированы, достаточно одного мягкого поворота, чтобы извлечь примерно 10 клеток.Подойдите к кончику капилляра против левого зрительного тектума чуть выше средней мозговой вены. Осторожно прижмите капилляр к личинкам до тех пор, пока оболочка кожи не сломается. Как только будет достигнуто подходящее положение в зрительном тектуме, выбросьте клетки.Внимательно наблюдайте за кончиком капилляра, чтобы визуализировать поток клеток, идущих внутрь животного, тем самым обеспечивая успешную инъекцию. Повторите процедуру для такого количества животных, сколько потребуется. В зависимости от того, насколько быстро экспериментатор вводит инъекцию, может потребоваться смена иглы каждые 10-20 личинок из-за быстрого скопления клеток в капилляре.Как только трансплантация ксено будет завершена, удалите личинки из пластины микроинъекции и выделите их в 24-луночной пластине, заполненной минеральной исходной водой PTU и метиленовой синей средой. Приготовьте 1% раствор AH-KROH с низким содержанием плавления. Переложите 500 микролитров кипяченого 1% низкоплавкого раствора AH-KROH в 1,5-миллилитрную центрифужную трубку и дайте ему остыть при 37 градусах Цельсия на тепловом блоке.добавьте 160 мкг на литр трицина в AH-KROHS и хорошо перемешайте. Переложите от одной до четырех ксенотрансплантированных личинок в 3,5-сантиметровую чашку Петри, наполненную минеральной исходной водой PTU и метиленовой средой, дополненной 160 микрограммами на литр трицина. Как только личинки будут обезболены и полностью не будут реагировать на прикосновения, осторожно перенесите их в трубку, содержащую AH-KROHS и трикаин, используя тонкую передаточную пипетку.Аккуратно смешайте личинку с AH-KROHS. Используя большую перекладочную пипетку, поместите личинки, смешанные в AH-KROHS, на центр стеклянной нижней 3,5-сантиметровой видеокартины Под стереомикроскопом быстро расположите личинок на спине. С помощью микрозагрузочного наконечника удалите лишние AH-KROHS для поддержания максимально тонкого слоя AH-KROHS.Как только AH-KROHS затвердеет, добавьте 2,5 миллилитра среды визуализации. Для визуализации in vivo в реальном времени динамики микротрубочек в вторгшихся клетках глиобластомы поместите видеоизображающую тарелку, содержащую встроенные ксенотрансплантированные личинки AH-KROHS, в камеру окружающей среды перевернутого конфокального микроскопа с температурой, установленной на уровне 32 градусов цельсия. Найдите личинок в видеовыпускной тарелке с 10-кратным объективом, используя моторизованную ступень XY.Нажмите escape, чтобы опустить башню цели и добавить минеральное масло на 60-кратный масляный объектив, и нажмите escape, чтобы вернуться в исходное фокусное положение. Наблюдайте за вторгающимися клетками глиобластомы в красном канале, установленном на 561 нанометровом лазерном источнике, 20% мощности лазера и временном воздействии 200 миллисекунд. Затем выбирают ячейку с распростертой сетью микротрубочек и легко различимыми нитями микротрубочек.Установите параметры серии Z. Используя пьезоступенчатый диапазон 200 микрометров, выберите верхнюю и нижнюю позиции сети микротрубочек, где Z-стека глубиной от 10 до 30 микрометров достаточно для визуализации микробной сети в выступе мигрирующей клетки с шагом Z-среза 0,3 микрометра. Установите параметры замедленной съемки, чтобы обеспечить оптимальный баланс между скоростью захвата, глубиной Z-стека и флуоресцентным сигналом, чтобы избежать быстрого отбеливания фотографий.Получайте изображения микротрубочек каждые пять-10 секунд в течение нескольких минут и сохраняйте гиперстек 5D. Динамика микротрубочек измерялась путем построения кимографа вдоль растущих и уменьшающихся микротрубочек и ручного отслеживания отдельных краев микротрубочек с течением времени. Лекарственное лечение, вводимое в личиночную среду, и его обратимое влияние на организацию сети микротрубочек оценивали путем лечения 200 наномолярной дозой нокодазола.Это привело к прогрессирующему усадке сети микротрубочек и исчезновению протрузии клеток глиобластомы через четыре часа. Вымывание препарата восстановило способность клеток глиобластомы образовывать протрузии. Клетки возобновили миграцию вдоль сосудистой системы через 12 часов после вымывания, что указывает на то, что дозировка нокодазола в 200 наномолей была достаточной, чтобы нарушить сеть микротрубочек и быстро блокировать инвазию клеток глиобластомы in vivo.Трехдневный анализ того же лечения глобальной инвазии клеток глиобластомы показал, что нокодазол остановил долгосрочную инвазию клеток глиобластомы in vivo, не влияя на общее состояние здоровья рыб по сравнению с контрольной группой. Не забудьте начать со здоровых трехдневных личинок после оплодотворения, чтобы сконцентрировать клетки в капилляре, минимизировать объем, вводимый в мозг, и сформировать уникальную опухолевую массу, и старайтесь избегать инъекций в желудочки мозга.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Живая съемка подвижность клеток и актинового цитоскелета отдельных нейронов и нервных клеток Крест в данио рерио Эмбрионы

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Живая изображения клеточных Экструзия из эпидермиса развивающихся данио рерио

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Визуализация G3BP стресс Гранулы Dynamics в живых первичных клеток

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...