Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Estamos muy agradecidos al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) y su laboratorio, especialmente Valérie Briolat, y Emma Colucci-Guyon por proporcionarnos las líneas de pez cebra y el molde de plástico para placas de microinyección, y por su valiosa experiencia en procedimientos experimentales de pez cebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoyado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia BioImaging, y ANR-10-INBS-04; Inversiones para el futuro). Este trabajo fue apoyado por la Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), el Centre National de la Recherche Scientifique y el Institut Pasteur y por las generosas donaciones de la Sra. Marguerite MICHEL y el Sr. Porquet.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación Animal del Instituto Pasteur - CEEA 89 y el Ministerio de Investigación y Educación de Francia (permiso #01265.03). Durante las inyecciones o sesiones de imágenes en vivo, los animales fueron anestesiados con Tricaine.At al final de los procedimientos experimentales, fueron sacrificados por...

Es probable que la obtención de imágenes de xenoinjertos tumorales a resolución unicelular se convierta en una herramienta indispensable para mejorar nuestra comprensión de la biología del GBM. Las imágenes en vivo en modelos PDX de ratón han llevado a valiosos descubrimientos sobre cómo GBM invade colectivamente el tejido cerebral18. Sin embargo, hasta la fecha, la resolución espaciotemporal no es lo suficientemente alta como para revelar la dinámica de las proteínas que controlan la i...

La motilidad celular es un proceso estereotipado que requiere el establecimiento del eje de polaridad y reordenamientos citoesqueléticos generadores de fuerza. La polimerización de actina y su asociación con la miosina son reconocidas como los principales contribuyentes a las fuerzas protrusivas y contráctiles requeridas para el movimiento celular1. Los microtúbulos son considerados los principales actores de la polarización celular y la persistencia direccional durante la migración2. En los últimos años, también se ha demostrado que los MT crean y estabilizan protuberancias para soportar fuerzas mecanocompresivas durante la invasión celular en 3D3. Más recientemente, las MT han estado directamente involucradas en la mecanotransducción en adherencias focales y migración mecanosensible4. La inestabilidad dinámica que caracteriza la dinámica final de MT-plus está hecha de fases repetidas de polimerización (crecimiento) y despolimerización (contracción), que están controladas por una plétora de proteínas de unión a microtúbulos y cascadas de señalización intracelular, como las gobernadas por RHO-GTPasas 5,6,7. El papel de la red MT en la migración e invasión celular ha hecho que la investigación de la dinámica MT sea un elemento clave para comprender mejor los mecanismos de localización de células inmunes, cicatrización de heridas e invasión de cáncer.
La capacidad de las células cancerosas para escapar del núcleo tumoral primario, diseminarse en los tejidos y generar tumores secundarios es un paso crítico para prevenir el éxito global en la guerra contra el cáncer declarada hace 50 años 8,9. Uno de los mayores obstáculos ha sido comprender cómo las células cancerosas invaden activamente el tejido. Los mecanismos clave de invasión se basan en los mismos principios que los que rigen la migración celular no tumoral10. Sin embargo, han surgido especificidades de migración de células cancerosas11, lo que desencadena la necesidad de una mejor caracterización de este tipo de migración. Específicamente, debido a que el microambiente tumoral aparece como un jugador clave en la progresión del cáncer12, observar y analizar la invasión de células cancerosas en un contexto fisiológico relevante es esencial para desentrañar los mecanismos de diseminación de las células cancerosas.
Las MT son fundamentales para la progresión del cáncer, para sostener tanto la proliferación como la invasión. El análisis preciso de la dinámica de MT in situ puede ayudar a identificar agentes modificadores de MT (MTA) en ambos procesos. La dinámica de MT varía drásticamente según un cambio en el entorno. In vitro, el tratamiento con agentes desestabilizadores MT como el nocodazol previene la formación de protrusión celular cuando las células están incrustadas en geles en 3D, mientras que tiene poco efecto sobre la migración celular 2D13,14. Aunque técnicamente desafiantes, los avances en imágenes intravitales permiten el análisis in vivo de la dinámica de MT durante la invasión de células cancerosas. Por ejemplo, la observación de MTs en células de fibrosarcoma xenoinjertadas por vía subcutánea en ratones reveló que los macrófagos asociados a tumores afectan la dinámica de MT en células tumorales15. Sin embargo, estos modelos de ratón implican procedimientos quirúrgicos extensos y siguen siendo insatisfactorios para los cánceres menos accesibles, como el tumor cerebral altamente invasivo, GBM.
A pesar de un sombrío tiempo de supervivencia promedio de 15 meses16, se sabe poco sobre el modo de diseminación del GBM dentro del parénquima cerebral o los elementos moleculares clave que sostienen la invasión de células GBM en el tejido cerebral. La mejoría en el modelo de xenoinjerto ortotópico (PDX) de ratón y el establecimiento de ventanas craneales ofrecieron nuevas perspectivas para los estudios de invasión de células GBM17,18. Sin embargo, debido a la calidad de imagen subóptima, este modelo ha permitido principalmente imágenes longitudinales de xenoinjertos superficiales y no se ha utilizado con éxito para estudiar imágenes subcelulares de proteínas del citoesqueleto hasta ahora. Además, a raíz de la orden judicial de las "3R" para reducir el uso de roedores y reemplazarlos con vertebrados inferiores, se han establecido modelos alternativos.
Aprovechando la inmunidad primitiva observada en larvas de pez cebra (Danio rerio), se desarrolló la inyección ortotópica de células GBM en el cerebro del pez 19,20,21. La inyección en las proximidades de los ventrículos en el mesencéfalo en desarrollo recapitula la mayor parte de la fisiopatología humana del GBM21, yse observa el mismo patrón preferido de invasión del GBM que en los seres humanos, la cooptación de los vasos22. Gracias a la transparencia de las larvas de peces, este modelo permite la visualización de las células GBM que invaden el cerebro desde las áreas periventriculares donde se cree que surgen la mayoría de los GBM23.
Debido a que las MT son esenciales para la invasión celular de GBM in vitro24,25, se necesita una mejor caracterización de la dinámica de MT y la identificación de reguladores clave durante la invasión celular. Sin embargo, hasta la fecha, los datos generados con el modelo ortotópico de pez cebra no han incluido el análisis subcelular de la dinámica de MT durante el proceso de invasión. Este documento proporciona un protocolo para estudiar la dinámica de MT in vivo y determinar su papel durante la invasión del cáncer cerebral. Después del etiquetado estable de microtúbulos, las células GBM se microinyectan a 3 dpf en los cerebros de las larvas de pez cebra y se obtienen imágenes en tiempo real a alta resolución espacio-temporal durante su progresión en el tejido cerebral. Las imágenes en vivo de MT fluorescentes permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la dinámica de MT plus-end. Además, este modelo permite evaluar el efecto de los MTA en la dinámica de MT y en las propiedades invasivas de las células GBM en tiempo real. Este protocolo relativamente no invasivo combinado con un gran número de larvas manejadas a la vez y la facilidad de aplicación de fármacos (en el agua de los peces) hace que el modelo sea un activo para las pruebas preclínicas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Con un tiempo medio de supervivencia sombrío en poblaciones reales, entre 6 y 15 meses, el glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno más devastador. El fracaso del tratamiento se debe principalmente a la invasividad de las células GBM, lo que habla de la necesidad de una mejor comprensión de las propiedades móviles de GBM. Para investigar el mecanismo molecular que apoya la invasión de GBM, se requieren nuevos modelos fisiológicos que permitan la caracterización en profundidad de la dinámica de las proteínas durante la invasión. Estas observaciones allanarían el camino para el descubrimiento de nuevos objetivos para bloquear la infiltración tumoral y mejorar los resultados de los pacientes. Este documento informa cómo un xenoinjerto ortotópico de células GBM en el cerebro del pez cebra permite imágenes vivas intravitales subcelulares. Centrándonos en los microtúbulos (MT), describimos un procedimiento para el marcado de MT en células GBM, microinyección de células GBM en el cerebro transparente de larvas de pez cebra 3 días después de la fertilización (dpf), imágenes intravitales de MT en los xenoinjertos diseminadores, alteración de la dinámica de MT para evaluar su papel durante la invasión de GBM y análisis de los datos adquiridos.

Para analizar el papel desempeñado por las MT durante la invasión in vivo de GBM, describimos aquí los principales pasos para realizar el marcado estable de MT en células GBM por infección lentiviral, xenotrasplante ortotópico de células GBM en larvas de pez cebra de 3 dpf, imágenes intravitales de alta resolución de la dinámica de MT, tratamiento con MTA y sus efectos sobre la invasión de GBM, y análisis de imágenes de la dinámica de MT e invasión in vivo (Figura 1<s...

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Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .

Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Este método está dedicado a la investigación del papel de los microtúbulos durante la invasión del cáncer cerebral mediante el acoplamiento de la inyección atópica de células de cáncer cerebral en el pez cebra a la imagen intravital subcelular. La principal ventaja de la técnica radica en la alta resolución temporal espacial a la que se adquiere el citoesqueleto de microtúbulos. Es único para modelos de invasión de cáncer cerebral in vivo y permite un análisis profundo de la dinámica de los microtúbulos.Las imágenes subcelulares de la invasión de células cancerosas cerebrales in situ se pueden utilizar para el análisis de cualquier proteína de interés potencialmente involucrada en la invasión del cáncer. Para comenzar, lave las células de glioblastoma cultivadas a 37 grados centígrados con PBS. Separe las células agregando un mililitro de 0.05% de tripsina EDTA e incubando durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora de células hasta que todas las células estén completamente separadas.Resuspender las células en cinco mililitros de medio celular de glioblastoma completo en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Agregue 45 mililitros de PBS helado y centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un mililitro de PBS helado pipeteando hacia arriba y hacia abajo a fondo.Agregue otros 49 mililitros de PBS helado y centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 200 microlitros de PBS helado. Almacenar en hielo durante el procedimiento de trasplante.Para microinyectar las células de glioblastoma en el mesencéfalo de las larvas de pez cebra, llene una placa de fundición de microinyección con seis mililitros de medio E3 suplementado con 160 miligramos por litro de tricaína. Transfiera una docena de larvas DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED a la placa de microinyección. Una vez que las larvas están anestesiadas y totalmente insensibles al tacto, alinearlas en las zanjas de lado, con la cabeza hacia arriba y el saco vitelino empujado contra la pared de la zanja con un pincel de tamaño 00.Luego cargue cinco microlitros de células de glioblastoma en el microcapilar usando puntas de microcarga e inserte el capilar en el soporte capilar universal. Coloque la placa de microinyección que contiene las larvas anestesiadas en la etapa de microscopio estéreo. Coloque la punta del microcapilar en el borde de la placa de microinyección utilizando las perillas del micromanipulador.Luego divídalo con un bisturí para crear un punto de entrada afilado aproximadamente del tamaño del diámetro de una célula. Verifique que las células fluyan fuera del capilar haciendo correr suavemente el aceite en el microinyector y hundiendo la punta de la aguja en el medio. Concentre las células en la punta del capilar para maximizar el número de células inyectadas por volumen inyectado y evite llenar el tejido cerebral con PBS.Examine cuidadosamente las células que salen del microcapilar a medida que el aceite se introduce manualmente en el inyector. Defina empíricamente el número de vueltas necesarias en la perilla manual para entregar de 20 a 50 celdas. Por lo general, si las células están lo suficientemente concentradas, un giro suave es suficiente para expulsar aproximadamente 10 células.Acérquese la punta del capilar contra el tectum óptico izquierdo justo por encima de la vena cerebral media. Presione suavemente el capilar contra las larvas hasta que la membrana de la piel se rompa. Una vez alcanzada una posición adecuada en el tectum óptico, expulsar las células.Observe cuidadosamente la punta del capilar para visualizar la corriente de células que van dentro del animal, asegurando así una inyección exitosa. Repita el procedimiento para tantos animales como sea necesario. Dependiendo de qué tan rápido esté el experimentador en la inyección, podría ser necesario un cambio de aguja cada 10 a 20 larvas debido a la rápida aglutinación celular en el capilar.Una vez que se complete el trasplante de xeno, retire la larva de la placa de microinyección y selecciónela en una placa de 24 pocillos llena de PTU de agua de fuente mineral y medio azul de metileno. Prepare una solución AH-KROH de bajo punto de fusión al 1%. Transfiera 500 microlitros de solución hervida de AH-KROH de bajo punto de fusión al 1% a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, y deje que se enfríe a 37 grados centígrados en un bloque de calor.agregue 160 microgramos por litro de tricaína al AH-KROHS y mezcle bien. Transfiera de una a cuatro larvas xenoinjertadas a una placa de Petri de 3,5 centímetros llena de PTU de agua mineral y medio de metileno complementado con 160 microgramos por litro de tricaína. Una vez que la larva esté anestesiada y no responda completamente al tacto, transfiéralas cuidadosamente al tubo que contiene AH-KROHS y tricaína usando una pipeta de transferencia de punta fina.Mezclar suavemente la larva con el AH-KROHS. Usando una pipeta de transferencia de bulbo grande, coloque las larvas mezcladas en el AH-KROHS en el centro de una antena de imágenes de video de 3,5 centímetros con fondo de vidrio Bajo un microscopio estereoscópico, coloque rápidamente las larvas sobre su espalda. Usando una punta de microcarga, elimine AH-KROHS adicional para mantener la capa AH-KROHS más delgada posible.Una vez que AH-KROHS se haya solidificado, agregue 2.5 mililitros de medio de imagen. Para la obtención de imágenes en vivo in vivo de la dinámica de los microtúbulos en células invasoras de glioblastoma, coloque la antena de imágenes de video que contiene las larvas xenoinjertadas incrustadas en AH-KROHS en la cámara ambiental de un microscopio confocal invertido con una temperatura establecida en 32 grados centígrados. Encuentra las larvas en el plato de imágenes de video con un objetivo 10x usando una etapa XY motorizada.Presione escape para bajar la torreta de objetivos y agregue aceite mineral a un objetivo de aceite 60x, y presione escape para volver a la posición focal inicial. Observe las células invasoras de glioblastoma en el canal rojo establecido en una fuente láser de 561 nanómetros, 20% de potencia láser y una exposición temporal de 200 milisegundos. Luego seleccione una celda con una red de microtúbulos extendida y filamentos de microtúbulos fácilmente distinguibles.Establezca la configuración de la serie Z. Usando una etapa piezoeléctrica de rango de 200 micrómetros, seleccione las posiciones superior e inferior de la red de microtúbulos donde una pila Z de 10 a 30 micrómetros de profundidad es suficiente para visualizar la red microbiana en la protuberancia de la célula migratoria con un paso de corte Z de 0.3 micrómetros. Establezca la configuración de adquisición de lapso de tiempo para permitir un equilibrio óptimo entre la velocidad de adquisición, la profundidad de la pila Z y la señal fluorescente para evitar el blanqueo rápido de las fotos.Adquiera imágenes de los microtúbulos cada cinco a 10 segundos durante varios minutos y guarde la hiperpila 5D. La dinámica de los microtúbulos se midió mediante la construcción de un timógrafo a lo largo del crecimiento y la contracción de los microtúbulos y el seguimiento manual de los bordes individuales de los microtúbulos a lo largo del tiempo. El tratamiento farmacológico administrado en el medio larvario y su efecto reversible sobre la organización de la red de microtúbulos se evaluó mediante el tratamiento con una dosis de 200 nanomolares de nocodazol.Esto condujo a la contracción progresiva de la red de microtúbulos y la desaparición de la protrusión de las células de glioblastoma después de cuatro horas. El lavado del fármaco restauró la capacidad de las células de glioblastoma para formar protuberancias. Las células reanudaron la migración a lo largo de la vasculatura 12 horas después del lavado, lo que indica que una dosis de 200 nanomoles de nocodazol fue suficiente para interrumpir la red de microtúbulos y bloquear rápidamente la invasión de células de glioblastoma in vivo.Un análisis de tres días del mismo tratamiento en la invasión global de células de glioblastoma reveló que el nocodazol detuvo la invasión de células de glioblastoma a largo plazo in vivo sin afectar la salud general de los peces en comparación con un control. Recuerde comenzar con larvas sanas tres días después de la fertilización para concentrar las células en el capilar, minimizar el volumen inyectado en el cerebro y formar una masa tumoral única, y trate de evitar la inyección en los ventrículos cerebrales.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Investigación

Biología

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

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