Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Vi är oerhört tacksamma mot Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrike) och hans laboratorium, särskilt Valérie Briolat, och Emma Colucci-Guyon för att ha försett oss med zebrafisklinjerna och plastformen för mikroinjektionsplattor och för deras värdefulla expertis om zebrafiskexperimentella procedurer. Vi erkänner tacksamt UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, med stöd av den franska nationella forskningsbyrån France BioImaging, och ANR-10-INBS-04; Investeringar för framtiden). Detta arbete stöddes av Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique och Institut Pasteur och genom generösa donationer från fru Marguerite MICHEL och herr Porquet.

Djurförsök utfördes enligt Europeiska unionens riktlinjer för hantering av försöksdjur. Alla protokoll godkändes av den etiska kommittén för djurförsök vid Institut Pasteur - CEEA 89 och det franska ministeriet för forskning och utbildning (tillstånd #01265.03). Under injektioner eller levande avbildningssessioner bedövades djur med Tricaine.At slutet av experimentprocedurerna, de avlivades genom överdosering av bedövningsmedel. Se materialförteckningen för detaljer relaterade till mate...

Avbildning av tumörxenografter vid encellsupplösning kommer sannolikt att bli ett oumbärligt verktyg för att förbättra vår förståelse av GBM-biologi. Live imaging i mus PDX-modeller har lett till värdefulla upptäckter om hur GBM kollektivt invaderar hjärnvävnaden18. Men hittills är den spatiotemporala upplösningen inte tillräckligt hög för att avslöja dynamiken hos proteiner som kontrollerar GBM-invasion. Vi resonerade att genom att koppla den ortotopiska engraferingen av GBM-ce...

Cellmotilitet är en stereotyp process som kräver etablering av polaritetsaxeln och kraftgenererande cytoskelettomläggningar. Aktinpolymerisation och dess koppling till myosin erkänns som de viktigaste bidragsgivarna till utskjutande och kontraktila krafter som krävs för cellrörelse1. Mikrotubuli anses vara huvudaktörerna i cellpolarisering och riktningsbeständighet under migration2. Under de senaste åren har MTs också visat sig skapa och stabilisera utsprång för att stödja mekanokompressiva krafter under cellinvasion i 3D3. På senare tid har maskinöversättningar varit direkt involverade i mekanotransduktion vid fokala vidhäftningar och mekanosensitiv migration4. Den dynamiska instabiliteten som kännetecknar MT-plus-slutdynamiken är gjord av upprepade faser av polymerisation (tillväxt) och depolymerisation (krympning), som styrs av en uppsjö av mikrotubulibindande proteiner och intracellulära signalkaskader, såsom de som styrs av RHO-GTPaser 5,6,7. MT-nätverkets roll i cellmigration och invasion har gjort undersökningen av MT-dynamik till ett nyckelelement för att bättre förstå mekanismerna för immuncellhoming, sårläkning och cancerinvasion.
Cancercellernas förmåga att undkomma den primära tumörkärnan, sprida sig i vävnaderna och generera sekundära tumörer är ett kritiskt steg för att förhindra global framgång i kriget mot cancer som förklarades för 50 år sedan 8,9. Ett av de största hindren har varit att förstå hur cancerceller aktivt invaderar vävnaden. Viktiga invasionsmekanismer förlitar sig på samma principer som de som styr icke-tumörcellmigration10. Emellertid har cancercellsmigrationsspecificiteter uppstått11, vilket utlöser behovet av bättre karakterisering av denna typ av migration. Specifikt, eftersom tumörmikromiljön framträder som en nyckelspelare i cancerprogression12, är det viktigt att observera och analysera cancercellsinvasion i ett relevant fysiologiskt sammanhang för att avslöja mekanismerna för spridning av cancerceller.
MTs är centrala för cancerprogression, för att upprätthålla både spridning och invasion. Exakt analys av MT-dynamik på plats kan hjälpa till att identifiera MT-förändrande medel (MTA) i båda processerna. MT-dynamiken varierar drastiskt vid en förändring i miljön. In vitro förhindrar behandling med MT-destabiliserande medel såsom nocodazol cellutsprångsbildning när celler är inbäddade i geler i 3D, medan det har liten effekt på 2D-cellmigration13,14. Även om det är tekniskt utmanande, tillåter framsteg inom intravital avbildning in vivo-analys av MT-dynamik under cancercellsinvasion. Till exempel avslöjade observationen av MT i subkutant xenograferade fibrosarkomceller hos möss att tumörassocierade makrofager påverkar MT-dynamiken i tumörceller15. Dessa musmodeller involverar dock omfattande kirurgiska ingrepp och förblir otillfredsställande för mindre tillgängliga cancerformer, såsom den mycket invasiva hjärntumören GBM.
Trots en dyster 15 månaders genomsnittlig överlevnadstid16 är lite känt om GBM: s spridningssätt inom hjärnparenkymen eller de viktigaste molekylära elementen som upprätthåller GBM-cellinvasion i hjärnvävnaden. Förbättring av musens ortotopiska xenograft (PDX) -modell och etablering av kranialfönster erbjöd nya utsikter för GBM-cellinvasionsstudier17,18. På grund av suboptimal bildkvalitet har denna modell dock mestadels tillåtit longitudinell avbildning av ytliga xenografter och har hittills inte framgångsrikt använts för att studera subcellulär avbildning av cytoskelettproteiner. I kölvattnet av "3R"-föreläggandet att minska användningen av gnagare och ersätta dem med lägre ryggradsdjur har dessutom alternativa modeller etablerats.
Genom att utnyttja den primitiva immuniteten som observerats hos zebrafisklarver (Danio rerio) utvecklades ortotopisk injektion av GBM-celler i fiskhjärnan 19,20,21. Injektion i närheten av ventriklarna i den utvecklande mellanhjärnan rekapitulerar det mesta av mänsklig GBM-patofysiologi21, och samma föredragna mönster av GBM-invasion som hos människor och kärl co-option-observeras22. Tack vare fisklarvernas transparens möjliggör denna modell visualisering av GBM-celler som invaderar hjärnan från de peri-ventrikulära områdena där de flesta GBM tros uppstå23.
Eftersom MTs är avgörande för GBM-cellinvasion in vitro24,25, behövs en bättre karakterisering av MT-dynamiken och identifiering av viktiga regulatorer under cellinvasion. Hittills har dock de data som genererats med zebrafiskens ortotopiska modell inte inkluderat subcellulär analys av MT-dynamiken under invasionsprocessen. Detta dokument ger ett protokoll för att studera MT-dynamik in vivo och bestämma dess roll under hjärncancerinvasion. Efter stabil mikrotubulimärkning mikroinjiceras GBM-celler vid 3 dpf i zebrafisklarvernas hjärnor och avbildas i realtid med hög spatio-temporal upplösning under deras progression i hjärnvävnaden. Levande avbildning av fluorescerande MTs möjliggör kvalitativ och kvantitativ analys av MT plus-end-dynamik. Dessutom gör denna modell det möjligt att bedöma effekten av MTA på MT-dynamiken och på de invasiva egenskaperna hos GBM-celler i realtid. Detta relativt icke-invasiva protokoll i kombination med ett stort antal larver som hanteras åt gången och den enkla läkemedelsapplikationen (i fiskvattnet) gör modellen till en tillgång för preklinisk testning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Med en dyster medianöverlevnadstid i verkliga populationer - mellan 6 och 15 månader - är glioblastom (GBM) den mest förödande maligna hjärntumören. Behandlingssvikt beror främst på invasiviteten hos GBM-celler, vilket talar för behovet av en bättre förståelse för GBM-rörliga egenskaper. För att undersöka den molekylära mekanismen som stöder GBM-invasion krävs nya fysiologiska modeller som möjliggör fördjupad karakterisering av proteindynamik under invasion. Dessa observationer skulle bana väg för upptäckten av nya mål för att blockera tumörinfiltration och förbättra patientresultaten. Detta dokument rapporterar hur en ortotopisk xenograft av GBM-celler i zebrafiskhjärnan tillåter subcellulär intravital levande avbildning. Med fokus på mikrotubuli (MTs) beskriver vi ett förfarande för MT-märkning i GBM-celler, mikroinjicering av GBM-celler i den transparenta hjärnan på 3 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver, intravital avbildning av MTs i de spridande xenografterna, förändring av MT-dynamik för att bedöma deras roll under GBM-invasion och analys av förvärvade data.

För att analysera den roll som MTs spelar under in vivo GBM-invasion beskriver vi här de viktigaste stegen för att utföra stabil MT-märkning i GBM-celler genom lentiviral infektion, ortotopisk xenotransplantation av GBM-celler i 3 dpf zebrafisklarver, högupplöst intravital avbildning av MT-dynamik, MTA-behandling och dess effekter på GBM-invasion och bildanalys av MT-dynamik och in vivo-invasion (Figur 1). MT-dynamiken mäts antingen genom att bygg...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Vi rapporterar en teknik som möjliggör levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastom (GBM) celler som invaderar en ryggradsdjurs hjärnvävnad. Att koppla den ortotopiska injektionen av fluorescerande märkta GBM-celler till en transparent zebrafiskhjärna med högupplöst intravital avbildning möjliggör mätning av cytoskelettdynamik under in situ cancerinvasion.

Levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastomceller som invaderar zebrafiskhjärnan

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Denna metod är tillägnad undersökningen av mikrotubuliens roll under hjärncancerinvasion genom att koppla den atopiska injektionen av hjärncancerceller i zebrafisk till den subcellulära intravitala avbildningen. Den största fördelen med tekniken ligger i den höga rumsliga tidsupplösningen vid vilken mikrotubulicytoskeletten förvärvas. Det är unikt för in vivo hjärncancerinvasionsmodeller och det möjliggör djupgående mikrotubulidynamikanalys.Den subcellulära avbildningen av in situ hjärncancercellinvasion kan användas för analys av alla proteiner av intresse som potentiellt är involverade i cancerinvasion. För att börja, tvätta glioblastomcellerna odlade vid 37 grader Celsius med PBS. Lossa cellerna genom att tillsätta en milliliter 0,05% Trypsin EDTA och inkubera i fem till 10 minuter vid 37 grader Celsius i cellinkubatorn tills alla celler är helt lossnade.Återsuspendera cellerna i fem milliliter komplett glioblastomcellmedium i ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 45 ml iskall PBS och centrifugera vid 134 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med en milliliter iskall PBS genom att pipettera upp och ner ordentligt.Tillsätt ytterligare 49 ml iskall PBS och centrifugera vid 134 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 mikroliter iskall PBS. Förvara på is under transplantationsproceduren.För att mikroinjicera glioblastomcellerna i zebrafisklarverna i mellanhjärnan, fyll en mikroinjektionsgjuten platta med sex milliliter E3-medium kompletterat med 160 milligram per liter trikain. Överför ett dussin DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED-larver till mikroinjektionsplattan. När larven är bedövad och helt svarslös för att röra dem i skyttegravarna på deras sida, huvudet upp och äggula sac skjuts mot väggen i diket med en storlek 00 pensel.Ladda sedan fem mikroliter glioblastomceller i mikrokapillären med hjälp av mikroladdningsspetsar och sätt in kapillären i den universella kapillärhållaren. Placera mikroinjektionsplattan som innehåller de bedövade larverna på stereomikroskopstadiet. Placera spetsen på mikrokapillären på gränsen till mikroinjektionsplattan med hjälp av mikromanipulatorknapparna.Bryt sedan den med en skalpell för att skapa en skarp ingångspunkt ungefär lika stor som en cells diameter. Kontrollera att cellerna strömmar ut ur kapillären genom att försiktigt köra olja i mikroinjektorn och kasta nålspetsen i mediet. Koncentrera cellerna vid kapillärspetsen för att maximera antalet celler som injiceras per volym injicerad och undvik att fylla hjärnvävnaden med PBS.Undersök noggrant cellerna som kommer ut ur mikrokapillären när olja manuellt införs i injektorn. Definiera empiriskt antalet varv som behövs på den manuella ratten för att leverera 20 till 50 celler. Vanligtvis, om cellerna är koncentrerade nog, räcker det med en mild sväng för att mata ut cirka 10 celler.Närma dig kapillärens spets mot vänster optisk tectum strax ovanför den mellersta cerebrala venen. Tryck försiktigt kapillären mot larverna tills hudmembranet går sönder. När en lämplig position i optikektumet har uppnåtts, mata ut cellerna.Observera noggrant kapillärens spets för att visualisera strömmen av celler som går in i djuret och därigenom säkerställa framgångsrik injektion. Upprepa proceduren för så många djur som krävs. Beroende på hur snabb experimenten är på att injicera kan ett nålbyte behövas var 10: e till 20: e larver på grund av snabb cellklumpning i kapillären.När xenotransplantationen är klar, ta bort larven från mikroinjektionsplattan och peka ut dem i en 24-brunnsplatta fylld med mineralkällvatten PTU och metylenblått medium. Förbered en 1% lågsmältande AH-KROH-lösning. Överför 500 mikroliter kokt 1% lågsmältande AH-KROH-lösning till ett 1,5 ml centrifugrör och låt det svalna vid 37 grader Celsius på ett värmeblock.tillsätt 160 mikrogram per liter tricaine till AH-KROHS och blanda väl. Överför en till fyra xenograferade larver till en 3,5 centimeter petriskål fylld med mineralvatten PTU och metylenmedium kompletterat med 160 mikrogram per liter trikain. När larven är bedövad och helt svarslös vid beröring, överför dem försiktigt till röret som innehåller AH-KROHS och tricaine med en fin spetsöverföringspipett.Blanda försiktigt larven med AH-KROHS. Använd en stor glödlampaöverföringspipett och placera larverna blandade i AH-KROHS på mitten av en glasbottnad 3,5 centimeter videobildskål Under ett stereomikroskop placerar du snabbt larverna på ryggen. Använd en mikroladdningsspets för att ta bort extra AH-KROHS för att bibehålla det tunnaste möjliga AH-KROHS-lagret.När AH-KROHS har stelnat, tillsätt 2,5 ml bildmedium. För in vivo levande avbildning, av mikrotubulidynamik i invaderande glioblastomceller, placera videoavbildningsskålen som innehåller AH-KROHS inbäddade xenograferade larver i miljökammaren i ett inverterat konfokalmikroskop med en temperatur inställd på 32 grader Celsius. Hitta larverna i videoavbildningsskålen med ett 10x mål med ett motoriserat XY-steg.Tryck på escape för att sänka måltornet och tillsätt mineralolja på ett 60x oljemål och tryck på escape för att gå tillbaka till den ursprungliga fokuspositionen. Observera de invaderande glioblastomcellerna i den röda kanalen inställd på 561 nanometer laserkälla, 20% lasereffekt och en tidsexponering på 200 millisekunder. Välj sedan en cell med ett utspritt mikrotubulinätverk och lätt urskiljbara mikrotubulifilament.Ställ in Z-seriens inställningar. Med hjälp av ett piezosteg på 200 mikrometer väljer du de övre och nedre positionerna i mikrotubulinätverket där en 10 till 30 mikrometer djup Z-stack räcker för att visualisera det mikrobiella nätverket i utsprånget av den migrerande cellen med ett Z-skivsteg på 0,3 mikrometer. Ställ in inställningar för tidsfördröjningsförvärv för att möjliggöra en optimal balans mellan förvärvshastighet, Z-stackdjup och fluorescerande signal för att undvika snabb fotoblekning.Skaffa bilder av mikrotubuli var femte till 10 sekunder i flera minuter och spara 5D-hyperstacken. Mikrotubulidynamiken mättes genom att bygga kymograf längs växande och krympande mikrotubuli och manuellt spåra enskilda mikrotubulikanter över tiden. Läkemedelsbehandling administrerad i larvmediet och dess reversibla effekt på mikrotubuli nätverksorganisation bedömdes genom behandling med en 200 nanomolär dos nocodazol.Detta ledde till progressiv krympning av mikrotubulinätverket och försvinnande av glioblastomcellutsprång efter fyra timmar. Tvättning av läkemedlet återställde glioblastomcellernas kapacitet att bilda utsprång. Cellerna återupptog migreringen längs kärlen 12 timmar efter tvättningen vilket indikerar att en 200 nanomoldos av nocodazol var tillräcklig för att störa mikrotubulinätverket och snabbt blockera in vivo glioblastomcellinvasion.En tre dagar lång analys av samma behandling vid global invasion av glioblastomceller avslöjade att nocodazol stoppade långvarig glioblastomcellsinvasion in vivo utan att påverka fiskens allmänna hälsa jämfört med en kontroll. Kom ihåg att börja med friska tre dagar efter befruktning larver för att koncentrera cellerna i kapillären, för att minimera volymen som injiceras i hjärnan och för att bilda en unik tumörmassa och försök att undvika att injicera i hjärnventriklarna.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Live Primärceller

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...