Name: live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Dr. P. Herbomel'e (Institut Pasteur, Fransa) ve laboratuvarına, özellikle Valérie Briolat ve Emma Colucci-Guyon'a, zebra balığı hatlarını ve mikroenjeksiyon plakaları için plastik kalıbı bize sağladıkları ve zebra balığı deney prosedürleri konusundaki değerli uzmanlıkları için son derece minnettarız. UtechS Fotonik BiyoGörüntüleme'ye (C2RT, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı France BioImaging tarafından desteklenen Pasteur Enstitüsü ve ANR-10-INBS-04; Geleceğe Yönelik Yatırımlar). Bu çalışma Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique ve Institut Pasteur ve Bayan Marguerite MICHEL ve Bay Porquet'in cömert bağışlarıyla.

Hayvan deneyleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımı için Avrupa Birliği kılavuzlarına göre yapılmıştır. Tüm protokoller Institut Pasteur - CEEA 89 Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Fransız Araştırma ve Eğitim Bakanlığı (izin #01265.03) tarafından onaylanmıştır. Enjeksiyonlar veya canlı görüntüleme seansları sırasında, hayvanlar deneysel prosedürlerin sonunda Tricaine.At ile uyuşturuldu, anestezik doz aşımı ile ötenazi yapıldı. Bu protokolde kullanılan malzemeler, ekipmanlar ve y...

Tümör ksenogreftlerinin tek hücre çözünürlüğünde görüntülenmesi, GBM biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için vazgeçilmez bir araç haline gelecektir. Fare PDX modellerinde canlı görüntüleme, GBM'nin toplu olarak beyin dokusunu nasıl istila ettiğine dair değerli keşiflere yol açmıştır18. Bununla birlikte, bugüne kadar, uzaysal zamansal çözünürlük, GBM istilasını kontrol eden proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkaracak kadar yüksek değildir. ...

Hücre hareketliliği, polarite ekseni oluşturulmasını ve kuvvet üreten sitoiskelet yeniden düzenlemelerini gerektiren kalıplaşmış bir süreçtir. Aktin polimerizasyonu ve miyozin ile ilişkisi, hücre hareketi için gerekli olan çıkıntılı ve kontraktil kuvvetlere ana katkıda bulunanlar olarak kabul edilmektedir1. Mikrotübüller, hücre polarizasyonunda ve göç sırasında yönlü kalıcılıkta ana aktörler olarak kabul edilir2. Son yıllarda, MT'lerin 3D3'te hücre invazyonu sırasında mekanokompresif kuvvetleri desteklemek için çıkıntılar oluşturduğu ve stabilize ettiği gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MT'ler fokal adezyonlar ve mekanosensitif migrasyonda mekanotransdüksiyona doğrudan dahil olmuştur4. MT-plus uç dinamiklerini karakterize eden dinamik kararsızlık, RHO-GTPazlar 5,6,7 tarafından yönetilenler gibi çok sayıda mikrotübül bağlayıcı protein ve hücre içi sinyal kaskadları tarafından kontrol edilen tekrarlanan polimerizasyon (büyüme) ve depolimerizasyon (büzülme) aşamalarından oluşur. MT ağının hücre göçü ve invazyonundaki rolü, MT dinamiklerinin araştırılmasını, bağışıklık hücresi homing, yara iyileşmesi ve kanser invazyonu mekanizmalarını daha iyi anlamak için kilit bir unsur haline getirmiştir.
Kanser hücrelerinin birincil tümör çekirdeğinden kaçma, dokulara yayılma ve ikincil tümörler üretme yeteneği, 50 yıl önceilan edilen kansere karşı savaşta küresel başarıyı önlemede kritik bir adımdır 8,9. En büyük engellerden biri, kanser hücrelerinin dokuyu aktif olarak nasıl istila ettiğini anlamaktır. Anahtar invazyon mekanizmaları, tümörlü olmayan hücre göçünü yönetenlerle aynı prensiplere dayanır10. Bununla birlikte, kanser hücresi göçü özgüllükleriortaya çıkmıştır 11, bu da bu göç türünün daha iyi karakterize edilmesine duyulan ihtiyacı tetiklemektedir. Spesifik olarak, tümör mikroçevresi kanser progresyonunda kilit bir oyuncu olarak göründüğü için12, kanser hücresi invazyonunu ilgili fizyolojik bağlamda gözlemlemek ve analiz etmek, kanser hücresi yayılma mekanizmalarını çözmek için gereklidir.
MT'ler, hem proliferasyon hem de istilayı sürdürmek için kanser progresyonunun merkezindedir. MT dinamiklerinin yerinde hassas analizi, her iki proseste de MT değiştirici ajanların (MTA) tanımlanmasına yardımcı olabilir. MT dinamikleri, ortamdaki bir değişikliğe bağlı olarak büyük ölçüde değişir. In vitro, nokodazol gibi MT-istikrarsızlaştırıcı ajanlarla tedavi, hücreler 3D jellere gömüldüğünde hücre çıkıntısı oluşumunu önlerken, 2D hücre göçü13,14 üzerinde çok az etkisi vardır. Teknik olarak zor olmasına rağmen, intravital görüntülemedeki ilerlemeler, kanser hücresi invazyonu sırasında MT dinamiklerinin in vivo analizine izin vermektedir. Örneğin, farelerde deri altından ksenograflanmış fibrosarkom hücrelerinde MTs'lerin gözlemlenmesi, tümörle ilişkili makrofajların tümör hücrelerinde MT dinamiklerini etkilediğini ortaya koymuştur15. Bununla birlikte, bu fare modelleri kapsamlı cerrahi prosedürler içerir ve yüksek derecede invaziv beyin tümörü GBM gibi daha az erişilebilir kanserler için tatmin edici değildir.
Kasvetli bir 15 aylık ortalama hayatta kalma süresi16'ya rağmen, GBM'nin beyin parankimi içindeki yayılma şekli veya beyin dokusunda GBM hücre invazyonunu sürdüren temel moleküler elementler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fare ortotopik ksenogreft (PDX) modelindeki gelişmeler ve kraniyal pencerelerin kurulması GBM hücre invazyonu çalışmaları için yeni umutlar sunmuştur17,18. Bununla birlikte, yetersiz görüntüleme kalitesi nedeniyle, bu model çoğunlukla yüzeysel ksenogreftlerin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermiş ve şimdiye kadar sitoiskelet proteinlerinin hücre altı görüntülemesini incelemek için başarılı bir şekilde kullanılmamıştır. Ayrıca, kemirgenlerin kullanımını azaltmak ve onları alt omurgalılarla değiştirmek için "3R" emrinin ardından, alternatif modeller oluşturulmuştur.
Zebra balığı (Danio rerio) larvalarında gözlenen ilkel bağışıklıktan yararlanarak, balık beynine GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu 19,20,21 geliştirilmiştir. Gelişmekte olan orta beyindeki ventriküllerin yakınına enjeksiyon, insan GBM patofizyolojisinin çoğunu özetler21 ve insan-damar ko-seçeneğinde olduğu gibi aynı tercih edilen GBM invazyonu paternigözlenir 22. Balık larvalarının şeffaflığı sayesinde, bu model, çoğu GBM'nin ortaya çıktığı düşünülen peri-ventriküler bölgelerden beyni istila eden GBM hücrelerinin görselleştirilmesine izin verir23.
MT'ler in vitro24,25 GBM hücre invazyonu için gerekli olduğundan, MT dinamiklerinin daha iyi bir karakterizasyonu ve hücre invazyonu sırasında anahtar düzenleyicilerin tanımlanması gereklidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, zebra balığı ortotopik modeli ile üretilen veriler, istila işlemi sırasında MT dinamiklerinin hücre altı analizini içermemiştir. Bu makale, MT dinamiklerini in vivo olarak incelemek ve beyin kanseri invazyonu sırasındaki rolünü belirlemek için bir protokol sunmaktadır. Kararlı mikrotübül etiketlemesini takiben, GBM hücrelerine zebra balığı larvalarının beyinlerinde 3 dpf'de mikroenjekte edilir ve beyin dokusundaki ilerlemeleri sırasında yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Floresan MT'lerin canlı görüntülenmesi, MT artı uç dinamiklerinin kalitatif ve kantitatif analizini sağlar. Ayrıca, bu model MTA'ların MT dinamikleri ve GBM hücrelerinin invaziv özellikleri üzerindeki etkisini gerçek zamanlı olarak değerlendirmeyi mümkün kılar. Bu nispeten invaziv olmayan protokol, bir seferde ele alınan çok sayıda larva ve ilaç uygulama kolaylığı (balık suyunda) ile birleştiğinde, modeli klinik öncesi testler için bir varlık haline getirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glioblastoma cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF00-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CM1MEM18-01</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>89081402-1VL</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenitivirus production</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293T</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12022001</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell passaging and staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63493</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish husbandry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4159</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes fine tips</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes Large Bulb3mL</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: A5040</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volvic Source Water</td>
			<td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td>
			<td>999556</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenotransplantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>(#30-0017 GC100-15</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram oil vario microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176000.025</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5242956003</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-100ml</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL 2500 LCD</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5176190002</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette puller</td>
			<td>KOPF (Roucaire)</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5cm glass-bottom videoimaging dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td>
			<td>P35G-1,5-14-C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Block</td>
			<td>Techne</td>
			<td>DRI-BLOCK DB-2D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope head Nikon Ti2E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Prime 95B</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Orca Flash 4</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td>
			<td>Hammatsu</td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.5.1 software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImarisFileConverter 9.5.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma cells invading the zebrafish brain

Gerçek popülasyonlarda kasvetli bir medyan sağkalım süresi ile - 6 ila 15 ay arasında - glioblastom (GBM) en yıkıcı malign beyin tümörüdür. Tedavi başarısızlığı esas olarak GBM hücrelerinin invazivliğinden kaynaklanmaktadır, bu da GBM hareketli özelliklerinin daha iyi anlaşılması ihtiyacını ifade etmektedir. GBM invazyonunu destekleyen moleküler mekanizmayı araştırmak için, invazyon sırasında protein dinamiklerinin derinlemesine karakterizasyonunu sağlayan yeni fizyolojik modellere ihtiyaç vardır. Bu gözlemler, tümör infiltrasyonunu bloke etmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için yeni hedeflerin keşfine yol açacaktır. Bu makale, zebra balığı beynindeki GBM hücrelerinin ortotopik ksenograftının hücre altı intravital canlı görüntülemeye nasıl izin verdiğini bildirmektedir. Mikrotübüllere (MT'ler) odaklanarak, GBM hücrelerinde MT etiketleme, döllenme sonrası 3 gün (dpf) zebra balığı larvalarının şeffaf beyninde GBM hücrelerinin mikroenjekte edilmesi, yayılan ksenogreftlerde MT'lerin intravital görüntülenmesi, GBM invazyonu sırasında rollerini değerlendirmek için MT dinamiklerini değiştirme ve elde edilen verileri analiz etme prosedürünü açıklıyoruz.

MT'lerin in vivo GBM invazyonu sırasında oynadığı rolü analiz etmek için, burada lentiviral enfeksiyon ile GBM hücrelerinde stabil MT etiketlemesi, 3 dpf zebra balığı larvalarında GBM hücrelerinin ortotopik ksenotransplantasyonu, MT dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemesi, MTA tedavisi ve GBM invazyonu üzerindeki etkileri ve MT dinamiklerinin ve in vivo invazyonun görüntü analizi için başlıca adımları açıklıyoruz (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain at JoVE.com

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Bu yöntem, zebra balığındaki beyin kanseri hücresinin atopik enjeksiyonunu hücre altı intravital görüntülemeye bağlayarak beyin kanseri invazyonu sırasında mikrotübüllerin rolünün araştırılmasına adanmıştır. Tekniğin temel avantajı, mikrotübül sitoiskeletinin elde edildiği yüksek uzamsal zamansal çözünürlükte yatmaktadır. İn vivo beyin kanseri invazyon modelleri için benzersizdir ve derinlemesine mikrotübül dinamiği analizine izin verir.İn situ beyin kanseri hücre invazyonunun hücre altı görüntülemesi, kanser invazyonunda potansiyel olarak yer alan herhangi bir proteinin analizi için kullanılabilir. Başlamak için, 37 santigrat derecede kültürlenmiş glioblastoma hücrelerini PBS ile yıkayın. Bir mililitre% 0.05 Tripsin EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve tüm hücreler tamamen ayrılana kadar hücre inkübatöründe 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin.Hücreleri, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde beş mililitre tam glioblastoma hücre ortamında yeniden askıya alın. 45 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 134 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile yukarı ve aşağı iyice pipetleyerek yeniden askıya alın.49 mililitre daha buz gibi soğuk PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 134 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Transplantasyon prosedürü boyunca buz üzerinde saklayın.Glioblastoma hücrelerini zebra balığı larvalarının orta beynine mikro olarak enjekte etmek için, bir mikroenjeksiyon döküm plakasını, litre trikain başına 160 miligram ile desteklenmiş altı mililitre E3 ortamı ile doldurun. Bir düzine DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED larvasını mikroenjeksiyon plakasına aktarın. Larva anestezi altına alındıktan ve dokunmak için tamamen tepkisiz kaldıktan sonra, onları yanlarındaki siperlere hizalayın, baş yukarı ve yumurta sarısı kesesi 00 büyüklüğünde bir boya fırçası ile açmanın duvarına doğru itilir.Daha sonra mikro yükleme uçlarını kullanarak beş mikrolitre glioblastoma hücresini mikro kılcal damara yükleyin ve kılcal damarı üniversal kılcal tutucuya yerleştirin. Anestezi uygulanan larvaları içeren mikroenjeksiyon plakasını stereo mikroskop aşamasına yerleştirin. Mikro manipülatör düğmelerini kullanarak mikro kılcal damarın ucunu mikroenjeksiyon plakasının sınırına yerleştirin.Ardından, kabaca bir hücrenin çapının büyüklüğünde keskin bir giriş noktası oluşturmak için bir neşterle kırın. Mikro enjektörde hafifçe yağ akarak ve iğnenin ucunu ortama daldırarak hücrelerin kılcal damardan aktığını doğrulayın. Enjekte edilen hacim başına enjekte edilen hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak ve beyin dokusunu PBS ile doldurmaktan kaçınmak için hücreleri kılcal damarın ucunda yoğunlaştırın.Mikro kılcal damardan çıkan hücreleri dikkatlice inceleyin, çünkü yağ enjektöre manuel olarak verilir. 20 ila 50 hücre iletmek için manuel düğmede gereken dönüş sayısını ampirik olarak tanımlayın. Tipik olarak, hücreler yeterince konsantre olursa, yaklaşık 10 hücreyi çıkarmak için yumuşak bir dönüş yeterlidir.Kılcal damarın ucuna orta serebral venin hemen üstündeki sol optik tektuma doğru yaklaşın. Cilt zarı kırılana kadar kılcal damarı larvalara karşı hafifçe bastırın. Optik tektumda uygun bir konuma ulaşıldığında, hücreleri dışarı atın.Hayvanın içine giren hücre akışını görselleştirmek için kılcal damarın ucunu dikkatlice gözlemleyin, böylece başarılı bir enjeksiyon sağlayın. Prosedürü gerektiği kadar hayvan için tekrarlayın. Deneycinin enjekte etmede ne kadar hızlı olduğuna bağlı olarak, kılcal damardaki hızlı hücre kümelenmesi nedeniyle her 10 ila 20 larvada bir iğne değişimine ihtiyaç duyulabilir.Xeno transplantasyonu tamamlandıktan sonra, larvaları mikroenjeksiyon plakasından çıkarın ve mineral kaynak suyu PTU ve metilen mavisi ortamı ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakada ayırın. % 1 düşük erime AH-KROH çözeltisi hazırlayın. 500 mikrolitre kaynamış% 1 düşük erime AH-KROH çözeltisini 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir ısı bloğu üzerinde 37 santigrat derecede soğumaya bırakın.AH-KROHS'a litre trikain başına 160 mikrogram ekleyin ve iyice karıştırın. Bir ila dört ksenograflanmış larvayı, mineral kaynak suyu PTU ve metilen ortamı ile doldurulmuş 3.5 santimetrelik bir Petri kabına aktarın ve litre trikain başına 160 mikrogram ile tamamlayın. Larva anestezi altına alındıktan ve dokunmaya tamamen tepkisiz kaldıktan sonra, ince uçlu bir transfer pipeti kullanarak AH-KROHS ve trikain içeren tüpe dikkatlice aktarın.Larvaları AH-KROHS ile yavaşça karıştırın. Büyük bir ampul transfer pipeti kullanarak, AH-KROHS'ta karıştırılmış larvaları, cam tabanlı 3,5 santimetrelik bir video görüntüleme kabının ortasına yerleştirin Stereo mikroskop altında larvaları hızlı bir şekilde sırtına yerleştirin. Bir mikro yükleme ucu kullanarak, mümkün olan en ince AH-KROHS tabakasını korumak için ekstra AH-KROHS'yi çıkarın.AH-KROHS katılaştıktan sonra, 2,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin. İnvaziv glioblastoma hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerinin in vivo canlı görüntülenmesi için, AH-KROHS gömülü ksenograflanmış larvaları içeren video görüntüleme kabını, 32 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcaklığa sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun çevre odasına yerleştirin. Video görüntüleme kabındaki larvaları, motorlu bir XY aşaması kullanarak 10x objektifle bulun.Hedef taretini alçaltmak ve 60x yağ hedefine mineral yağ eklemek için escape tuşuna basın ve ilk odak konumuna geri dönmek için escape tuşuna basın. 561 nanometre lazer kaynağında,% 20 lazer gücünde ve% 200 milisaniyelik bir zaman maruziyetinde ayarlanan kırmızı kanaldaki istilacı glioblastoma hücrelerini gözlemleyin. Ardından, yayılmış bir mikrotübül ağına ve kolayca ayırt edilebilir mikrotübül filamentlerine sahip bir hücre seçin.Z serisi ayarlarını yapın. 200 mikrometre aralığında piezo aşaması kullanarak, göç eden hücrenin çıkıntısındaki mikrobiyal ağı 0.3 mikrometrelik bir Z dilimi adımıyla görselleştirmek için 10 ila 30 mikrometre derinliğinde bir Z yığınının yeterli olduğu mikrotübül ağının üst ve alt konumlarını seçin. Hızlı fotoğraf ağartmasını önlemek için alım hızı, Z-yığını derinliği ve floresan sinyali arasında optimum bir denge sağlamak için hızlandırılmış alma ayarlarını yapın.Birkaç dakika boyunca her beş ila 10 saniyede bir mikrotübüllerin görüntülerini alın ve 5B hiper yığını kaydedin. Mikrotübül dinamikleri, büyüyen ve küçülen mikrotübüller boyunca kimograf inşa edilerek ve zaman içinde bireysel mikrotübül kenarlarını manuel olarak izleyerek ölçüldü. Larva ortamında uygulanan ilaç tedavisi ve mikrotübüller ağ organizasyonu üzerindeki geri dönüşümlü etkisi, 200 nanomolar nokodazol dozu ile tedavi edilerek değerlendirildi.Bu, mikrotübül ağının ilerleyici büzülmesine ve dört saat sonra glioblastoma hücre çıkıntısının kaybolmasına yol açtı. İlacın yıkanması, glioblastoma hücrelerinin çıkıntı oluşturma kapasitesini geri kazandırdı. Hücreler, yıkamadan 12 saat sonra vaskülatür boyunca göç etmeye devam ettiler, bu da 200 nanomol nokodozol dozajının mikrotübül ağını bozmak ve in vivo glioblastoma hücre invazyonunu hızla bloke etmek için yeterli olduğunu gösterdi.Global glioblastoma hücre invazyonu üzerine aynı tedavinin üç gün süren bir analizi, nokodazolün uzun süreli glioblastoma hücre invazyonunu in vivo olarak balıkların genel sağlığını etkilemeden durdurduğunu ortaya koymuştur. Hücreleri kılcal damara konsantre etmek, beyne enjekte edilen hacmi en aza indirmek ve benzersiz bir tümör kütlesi oluşturmak için döllenmeden üç gün sonra sağlıklı larvalarla başlamayı unutmayın ve beyin ventriküllerine enjekte etmekten kaçınmaya çalışın.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...