Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH (R01MH121433, R01MH118349 og R01MH120125 til JLS og R01NS110791 til GW) og Foundation of Hope. Vi takker Pablo Ariel fra Microscopy Services Laboratory for at hjælpe med prøvebilleddannelse. Microscopy Services Laboratory i Institut for Patologi og Laboratoriemedicin støttes delvist af Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 til University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core er støttet af bevilling P30 NS045892. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Alle mus blev brugt i overensstemmelse med og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Musedissektion og perfusion
BEMÆRK: Følgende dissektioner blev udført på P4- og P14-mus ved hjælp af en sprøjte. Volumenet af perfusionsvæske vil variere afhængigt af dyrets alder.
<ol><li>Perfusion FORSIGTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farligt kemikalie. Udfør alle perfusions...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+system:+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy.">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li><li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism.">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSL.">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li><li>. iDISCO method Available from: <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022)</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide.">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).</li><li>. Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022)</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836 (2017).</li><li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

Vævsrensningsmetoder er nyttige teknikker til måling af 3D-cellulær organisering af hjernen. Der er et væld af vævsrensningsmetoder beskrevet i litteraturen, hver med sine fordele og begrænsninger 6,7,8,9. Mulighederne for beregningsværktøjer til at analysere celletyperne i de vævsryddede billeder er relativt begrænsede. Andre tilgængelige værktøjer er blevet implementeret til spar...

Helhjernebilleddannelse ved enkeltcelleopløsning er en vigtig udfordring inden for neurovidenskab. Hjernebilleder i cellulær opløsning giver mulighed for detaljeret analyse og kortlægning på systemniveau af hjernekredsløb, og hvordan dette kredsløb forstyrres af genetiske eller miljømæssige risikofaktorer for neuropsykiatriske lidelser, cellulær adfærd ved udvikling af embryoner samt neurale kredsløb i den voksne hjerne 1,2,3. Der er flere histologiske metoder, der giver mulighed for billeder i høj opløsning af den rekonstruerede 3D-hjerne; disse teknikker kræver imidlertid dyrt, specialiseret udstyr, er muligvis ikke kompatibelt med immunmærkning, og den todimensionale (2D) karakter af nogle metoder kan føre til vævsskade og klipning under sektionering 4,5.
Nylige fremskridt har givet en alternativ tilgang til billeddannelse af hele hjerner, der ikke kræver vævssektionering; De involverer brug af vævsrensning for at gøre hjerner gennemsigtige. Gennemsigtighed opnås i de fleste vævsrensningsmetoder ved både at fjerne lipider, da de er en vigtig kilde til lysspredning, og matche objektets brydningsindeks (RI) med RI af prøvenedsænkningsopløsningen under billeddannelse. Lys kan derefter passere gennem grænsen mellem materialer uden at være spredt 6,7,8,9.
Vævsrensningsmetoder, såsom iDISCO +, kombineres ofte med hurtig 3D-billeddannelse ved hjælp af enkeltfoton excitationsmikroskopi, såsom LSFM 6,7,10. Inden for gennemsigtigt væv mærket med en fluorophore sektionerer lysarkfluorescensmikroskopibilleder ved excitation med et tyndt lysplan11. Den største fordel ved LSFM er, at en enkelt optisk sektion belyses ad gangen, hvor al fluorescens fra molekylerne inden for dette afsnit er ophidset, hvilket minimerer fotoblegning. Desuden muliggør billeddannelse af en hel optisk skive kamerabaseret detektion af den ophidsede skive, hvilket øger hastigheden i forhold til punktscanning12. LSFM producerer ikke-destruktivt velregistrerede optiske sektioner, der er egnede til 3D-rekonstruktion.
Mens iDISCO+ metoden giver mulighed for billig vævsrensning inden for ~ 3 uger, kan dehydreringstrin inden for protokollen føre til vævskrympning og potentiel ændring af prøvemorfologien og dermed påvirke volumetriske målinger 6,10. Tilføjelse af en sekundær billeddannelsesmetode, såsom MR, der skal bruges inden vævsrensningsproceduren, kan måle graden af vævsclearing-induceret krympning på tværs af prøven. Under dehydreringstrinnene kan forskelle i mekaniske egenskaber mellem gråt og hvidt stof føre til uensartede deformationer af hjernemateriale, hvilket resulterer i forskellige vævsclearing-inducerede volumendeformationer mellem vildtype- og mutantprøver og kan forvirre fortolkninger af volumetriske forskelle i disse prøver10,13 . MR udføres ved først at perfusere dyret med et kontrastmiddel (f.eks. Gadolinium), efterfulgt af inkubation af det ekstraherede væv af interesse i en nedsænkningsopløsning (f.eks. Fomblin) før billeddannelse14. MR er kompatibel med vævsrensning og udførelse af LSFM på samme prøve.
LSFM bruges ofte til at skabe store mikroskopibilleder til kvalitativ visualisering af hjernevævet af interesse snarere end kvantitativ evaluering af hjernestruktur (figur 1). Uden kvantitativ evaluering er det vanskeligt at påvise strukturelle forskelle som følge af genetiske eller miljømæssige fornærmelser. Efterhånden som vævsrensnings- og billeddannelsesteknologier forbedres sammen med reducerede omkostninger til opbevaring og computerkraft, bliver kvantificering af celletypelokaliseringer inden for vævet af interesse mere tilgængelig, hvilket giver flere forskere mulighed for at inkludere disse data i deres undersøgelser.
Med over 100 millioner celler i musehjernen15 og billeddannelsessessioner i hele hjernen, der kan generere terabyte data, er der øget efterspørgsel efter avancerede billedanalyseværktøjer, der muliggør nøjagtig kvantificering af funktioner i billederne, såsom celler. Der findes et væld af segmenteringsmetoder til vævsryddede billeder, der anvender tærskelværdier for nuklear farvningsintensitet og filtrerer objekter med foruddefinerede former, størrelser eller tætheder10,16,17,18. Unøjagtige fortolkninger af resultater kan dog opstå som følge af variationer i parametre som cellestørrelse, billedkontrast og mærkningsintensitet. Dette papir beskriver vores etablerede protokol til kvantificering af cellekerner i musehjernen. Først beskriver vi trin til vævsindsamling af P4-musehjernen efterfulgt af en vævsrensnings- og immunmærkningsprotokol optimeret fra den offentligt tilgængelige iDISCO+ metode10. For det andet beskriver vi billedoptagelse ved hjælp af MR og lysarkmikroskopi, herunder de parametre, der bruges til optagelse af billeder. Endelig beskriver og demonstrerer vi NuMorph19, et sæt billedanalyseværktøjer, som vores gruppe har udviklet, der muliggør celletypespecifik kvantificering efter vævsrensning, immunmærkning med nukleare markører og lysarkbilleddannelse af kommenterede regioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

Vævsrensning efterfulgt af lysarkmikroskopi (LSFM) muliggør cellulær opløsningsbilleddannelse af intakt hjernestruktur, hvilket muliggør kvantitativ analyse af strukturelle ændringer forårsaget af genetiske eller miljømæssige forstyrrelser. Helhjernebilleddannelse resulterer i mere nøjagtig kvantificering af celler og undersøgelse af regionsspecifikke forskelle, der kan gå glip af med almindeligt anvendt mikroskopi af fysisk sektioneret væv. Brug af lysarkmikroskopi til billedrensede hjerner øger anskaffelseshastigheden betydeligt sammenlignet med konfokal mikroskopi. Selvom disse billeder producerer meget store mængder hjernestrukturelle data, er de fleste beregningsværktøjer, der udfører funktionskvantificering i billeder af ryddet væv, begrænset til at tælle sparsomme cellepopulationer snarere end alle kerner.
Her demonstrerer vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en gruppe analyseværktøjer, til at kvantificere alle kerner og nukleare markører inden for kommenterede områder af en postnatal dag 4 (P4) musehjerne efter rydning og billeddannelse på et lysarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) for at måle hjernevolumen før krympning forårsaget af vævsrensningsdehydreringstrin, vævsrensning ved hjælp af iDISCO + -metoden, herunder immunmærkning, efterfulgt af lysarkmikroskopi ved hjælp af en kommercielt tilgængelig platform til at afbilde musehjerner ved cellulær opløsning. Vi demonstrerer derefter denne billedanalysepipeline ved hjælp af NuMorph, som bruges til at korrigere intensitetsforskelle, sy billedfliser, justere flere kanaler, tælle kerner og kommentere hjerneområder gennem registrering til offentligt tilgængelige atlasser.
Vi designede denne tilgang ved hjælp af offentligt tilgængelige protokoller og software, så enhver forsker med de nødvendige mikroskop- og beregningsressourcer kan udføre disse teknikker. Disse vævsrensnings-, billeddannelses- og beregningsværktøjer muliggør måling og kvantificering af den tredimensionelle (3D) organisering af celletyper i cortex og bør være bredt anvendelig til ethvert vildtype / knockout-museundersøgelsesdesign.

Da iDISCO+ protokollen introducerer signifikant vævskrympning, som let kan mærkes af øjet (figur 2B), tilføjede vi et MR-trin til denne rørledning før vævsrensning for at kvantificere krympningen induceret af vævsrensning. Arbejdsgangen starter med fjernelse af ikke-hjernevævet fra MR-billedet (figur 2C). Derefter anvendes en stiv transformation (3 oversættelses- og 3 rotationsvinkler) for at justere MR-billedet til lysarkbilledet (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Denne protokol beskriver metoder til udførelse af magnetisk resonansbilleddannelse, rydning og immunmærkning af intakte musehjerner ved hjælp af iDISCO+, efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af billeddannelse ved hjælp af lysarkmikroskopi og nedstrømsanalyser ved hjælp af NuMorph.

Helhjerne enkeltcellebilleddannelse og analyse af intakte neonatale musehjerner ved hjælp af MR, vævsrensning og lysarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Med omkring 100 millioner celler i musehjernen og størrelser af helhjernebilleder med cellulær opløsning, der nærmer sig terabyteskalaen, er der behov for avancerede billedanalyseværktøjer til nøjagtigt at kvantificere celler. Vores beregningspipeline kan forbehandle billeder og kvantificere kerner i musebarken, samtidig med at der opretholdes et rimeligt kompromis mellem celledetekteringsnøjagtighed, billedbehandlingstid og beregningsressourcer. Demonstrerer proceduren vil være Felix Kyere og Ian Curtin, kandidatstuderende fra mit laboratorium.Til at begynde med monteres prøven i den korrekte prøvestørrelsesholder, således at prøven er orienteret med z-dimensionen ikke mere end 5,2 millimeter i dybden på grund af den nominelle arbejdsafstand for UltraMicroscope II-mikroskopet. Indsæt derefter holderen i prøveholderen, således at holderens skrue er i en vinkel på 45 grader i forhold til holderens understøtninger. Placer derefter vuggen i en position, så prøven er orienteret vinkelret på lysbanen.Indstil derefter zoomlegemet på mikroskopet til 4x forstørrelse eller højere, hvilket giver 0.75 mikrometer pr. Pixel. I Inspector Pro-softwaren skal du vælge et enkelt lysark med en numerisk blændeværdi på ca. 0,08. For at sikre, at aksial opløsning opretholdes langs billedets bredde, skal du vælge Vandret dynamisk fokusering og anvende det anbefalede antal trin afhængigt af laserbølgelængden.Juster derefter det fine fokus for hver kanal med hensyn til registreringskanalen og lasereffekt pr. kanal med hensyn til kanalegenskaberne. Juster derefter lysarkbredden til ca. 50% for at sikre, at arkeffekten fordeles optimalt i y-dimensionen for prøvestørrelsen. Derefter skal du indstille antallet af fliser med hensyn til prøvens størrelse med en anbefalet overlapning på 15% mellem fliser og tage billeder for hver kanal sekventielt for hver stak på en given fliseposition.Først skal du downloade og installere Conda-miljøadministrator til Linux- og NuMorph-billedbehandlingsværktøjer. På kommandolinjen skal du køre matlab og NM_setup. m fra NuMorph til at downloade og installere billedanalysesoftwarepakker, der er nødvendige til analyse.Angiv derefter eksempelnavne, input- og outputmapper, kanaloplysninger og lysarkbilledparametre ved at redigere filen NM_samples.m. For intensitetsjustering skal du i NMp_template indstille intens justeringen til sand og use_processed_images som falsk, når du arbejder med et nyt sæt billeder. Indstil derefter save_images og save_samples som sandt.Indstil derefter feltskygge til grundlæggende for at anvende skyggekorrektion ved hjælp af den grundlæggende algoritme eller manual til at anvende justering af feltskygge ved hjælp af målinger fra UltraMicroscope II ved specifikke lysarkbredder. For billedkanaljustering skal du i NMp_template indstille channel_alignment til sand og kanalisere alignment_method til enten oversættelse eller elastikker. Indstil derefter sift_refinement som sand og overlapningsværdi på 0,15 for at matche fliseoverlapninger under billeddannelse.Hvis du vil køre forbehandlingstrin i MATLAB, skal du angive eksempelnavnet og indstille konfigurationen til NM_config proceseksempel. Kør derefter et af forbehandlingstrinnene ved at angive NM_process konfigurationssøm, mens du angiver scenen ved hjælp af intensitet, justering eller søm, og kontroller outputmappen for outputfiler for hvert af trinene. Start med et 3D Atlas-billede og et tilknyttet annoteringsbillede, der tildeler hver voxel til en bestemt struktur.Juster både Atlas-billedet og annoteringsfilen for at sikre, at de matcher korrekt i den rigtige retning. Efter justering skal du behandle filerne i NuMorph for at specificere input som beskrevet i manuskriptet ved at udføre kommandoen. I NMa_template skal du indstille resample_images til sand og resample_resolution til at matche Atlas.Angiv derefter kanalnummeret, der skal gensamples ved hjælp af resample_channels. Indstil derefter register_images til sand, angiv atlas_file, der matcher filen i Atlas-mappen, og indstil registration_parameters som standard. Indstil derefter save_registered_images til sand.For kernedetektion, celletælling og klassificering skal du indstille både count_nuclei og classify_cells som sande. Indstil derefter count_method til 3dunet og min_intensity for at definere en minimumsintensitetstærskel for detekterede objekter. Indstil derefter classify_method til enten tærskel, der er baseret på en ikke-overvåget fluorescensintensitet ved centroide positioner, eller SVM, der modellerer en overvåget lineær støttevektormaskineklassifikator.Hvis du vil udføre analysetrin i MATLAB, skal du angive eksempelnavnet og indstille konfigurationen til NM_config analysere prøven. Kør derefter et af analysetrinnene ved at angive NM_analyze konfigurationstrin, mens du angiver fasen ved hjælp af resample, registrer, tæl eller klassificer og kontroller outputmappen for outputfiler for hver af faserne. I NMe_template skal du indstille opdatering til sand og compare_structures_by til begge indekser.Indstil derefter skabelonfilen og strukturtabellen, der specificerer alle mulige strukturindekser og strukturer, der skal evalueres, mens du angiver celletælling og celletypeklassificering. Vævsrensning ved hjælp af iDISCO + protokol og neuronale lagspecifikke kernemarkører resulterede i klart definerede cellegrupper af øvre og nedre lag neuroner i isocortex. Celletælling ved hjælp af NuMorph var afhængig af vellykkede forbehandlingstrin, der involverede intensitetsjustering, kanaljustering og syning.Fejl i forbehandlingstrin kan dog resultere i forkert syning, hvilket fører til forkert justering og syning og dermed resulterer i billeder med in-focus og out-of-focus mønster. For at tælle kerner fra specifikke hjerneområder vil de syede billeder blive kommenteret ved hjælp af Atlas, så annoteringer kan overlejres på hjerneområder. Centroider af kerner blev detekteret med en trænet 3D U-Net-model i NuMorph med omkring 12 millioner samlede kerner, der var TO-PRO-3-positive i isocortex med ca. 2,6 millioner hjerne-to-positive og 1,6 millioner CTIP2-positive kerner.Omkring 3,7 og 2,9 millioner TO-PRO-3-positive samlede kerner i henholdsvis basalganglierne og hippocampal allocortex blev påvist. Imidlertid var de hjerne-to-positive celler, der blev påvist i disse to hjerneområder, ubetydelige, og kun ca. 1,5 ud af mindre end en million CTIP2-positive celler blev påvist hver i de basale ganglier og hippocampal allocortex. Udfør visuel kvalitetskontrol under anskaffelsen for at opnå god segmentering.Og korrekt opsætning af Conda-miljøet for at sikre, at der ikke opstår fejl i en downstream-analyse. Ud over celletælling giver denne pipeline mulighed for integration med andre segmenteringsværktøjer, der måler cellestørrelse og form, som derefter kan sammenlignes på tværs af genotypegrupper. Med vores pipeline kan vi identificere, hvordan hjernens anatomi ændrer sig ved cellulær opløsning, hvilket fører til identifikation af celletyper og hjerneområder, der er vigtige for sygdomsrisiko.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Micron-skala Opløsning Optical Tomography af hele Mouse Brains med konfokal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxisk kirurgi for genmanipulation i Striatal celler af Neonatal mus hjerner

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisering af Motor Axon Navigation og kvantificering af Axon Arborization i mus embryoner ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Hele hjernen 3D-aktivering og funktionel forbindelse kortlægning i mus ved hjælp af transkranial funktionel ultralydsscanning

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Billeddannelse og kvantificering af intakte neuronale dendritter via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Dybvævsmikroskopi af tre-fotonfluorescens i intakt muse- og zebrafiskhjerne

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

En vævsrensningsmetode til neuronal billeddannelse fra mesoskopisk til mikroskopisk skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...