Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01MH121433, R01MH118349 en R01MH120125 voor JLS en R01NS110791 voor GW) en de Foundation of Hope. We bedanken Pablo Ariel van het Microscopy Services Laboratory voor zijn hulp bij het afbeelden van monsters. Het Microscopy Services Laboratory in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde wordt gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 aan het Lineberger Comprehensive Cancer Center van de University of North Carolina (UNC). De Neuroscience Microscopy Core wordt ondersteund door subsidie P30 NS045892. Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd gedeeltelijk ondersteund door de North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.
1. Muisdissectie en perfusie
OPMERKING: De volgende dissecties werden uitgevoerd op P4- en P14-muizen met behulp van een spuit. Het volume perfusievloeistof zal variëren afhankelijk van de leeftijd van het dier.
<ol><li>Perfusie LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is een...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+system:+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy.">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li><li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism.">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSL.">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li><li>. iDISCO method Available from: <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022)</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide.">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).</li><li>. Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022)</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836 (2017).</li><li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

Weefselopruimingsmethoden zijn nuttige technieken voor het meten van 3D cellulaire organisatie van de hersenen. Er zijn een groot aantal weefselzuiveringsmethoden beschreven in de literatuur, elk met zijn voordelen en beperkingen 6,7,8,9. De opties voor computationele hulpmiddelen om de celtypen in de weefsel-gewiste beelden te analyseren zijn relatief beperkt. Andere beschikbare hulpmiddelen z...

Beeldvorming van de hele hersenen met eencellige resolutie is een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Hersenbeelden met cellulaire resolutie maken gedetailleerde analyse en het in kaart brengen op systeemniveau van hersencircuits mogelijk en hoe die circuits worden verstoord door genetische of omgevingsrisicofactoren voor neuropsychiatrische aandoeningen, cellulair gedrag bij het ontwikkelen van embryo's, evenals neurale circuits in de volwassen hersenen 1,2,3. Er zijn meerdere histologische methoden die beelden met hoge resolutie van het gereconstrueerde 3D-brein mogelijk maken; deze technieken vereisen echter dure, gespecialiseerde apparatuur, zijn mogelijk niet compatibel met immunolabeling en de tweedimensionale (2D) aard van sommige methoden kan leiden tot weefselbeschadiging en afschuiving tijdens sectie 4,5.
Recente ontwikkelingen hebben een alternatieve benadering geboden voor het in beeld brengen van hele hersenen waarvoor geen weefselsectie nodig is; ze omvatten het gebruik van weefselzuivering om hersenen transparant te maken. Transparantie wordt bereikt in de meeste weefselzuiveringsmethoden door zowel lipiden te verwijderen, omdat ze een belangrijke bron van lichtverstrooiing zijn, als door de brekingsindex (RI) van het object af te stemmen op de RI van de monsterdompelingsoplossing tijdens beeldvorming. Licht kan dan de grens tussen materialen passeren zonder 6,7,8,9 te worden verstrooid.
Weefselzuiveringsmethoden, zoals iDISCO+, worden vaak gecombineerd met snelle 3D-beeldvorming met behulp van single-photon excitatiemicroscopie, zoals LSFM 6,7,10. In transparante weefsels gelabeld met een fluorofoor, licht-sheet fluorescentie microscopie beelden secties door excitatie met een dun lichtvlak11. Het belangrijkste voordeel van LSFM is dat een enkele optische sectie tegelijkertijd wordt verlicht, waarbij alle fluorescentie van de moleculen in die sectie wordt geëxciteerd, wat fotobleaching minimaliseert. Bovendien maakt het in beeld brengen van een volledig optisch segment cameragebaseerde detectie van dat opgewonden segment mogelijk, waardoor de snelheid toeneemt ten opzichte van puntscanning12. LSFM produceert niet-destructief goed geregistreerde optische secties die geschikt zijn voor 3D-reconstructie.
Hoewel de iDISCO + -methode goedkope weefselzuivering binnen ~ 3 weken mogelijk maakt, kunnen uitdrogingsstappen binnen het protocol leiden tot weefselkrimp en mogelijke verandering van de morfologie van het monster, waardoor volumetrische metingen worden beïnvloed 6,10. Het toevoegen van een secundaire beeldvormingsmethode, zoals MRI, die voorafgaand aan de weefselopruimingsprocedure moet worden gebruikt, kan de mate van door weefselzuivering geïnduceerde krimp over het monster meten. Tijdens de dehydratiestappen kunnen verschillen in mechanische eigenschappen tussen grijze en witte stof leiden tot niet-uniforme hersenmaterievervormingen, wat resulteert in ongelijksoortige weefselzuivering-geïnduceerde volumevervormingen tussen wildtype en mutante monsters en kan interpretaties van volumetrische verschillen in deze monsters verstoren10,13 . MRI wordt uitgevoerd door het dier eerst te perfuseren met een contrastmiddel (bijv. gadolinium), gevolgd door het geëxtraheerde weefsel van belang in een onderdompelingsoplossing (bijv. fomblin) te incuberen voordat beeldvormingplaatsvindt 14. MRI is compatibel met het opruimen van weefsel en het uitvoeren van LSFM op hetzelfde monster.
LSFM wordt vaak gebruikt om grootschalige microscopiebeelden te maken voor kwalitatieve visualisatie van het hersenweefsel van belang in plaats van kwantitatieve evaluatie van de hersenstructuur (figuur 1). Zonder kwantitatieve evaluatie is het moeilijk om structurele verschillen aan te tonen die het gevolg zijn van genetische of milieubeledigingen. Naarmate weefselzuiverings- en beeldvormingstechnologieën verbeteren, samen met lagere kosten van opslag en rekenkracht, wordt het kwantificeren van celtypelokalisaties in het weefsel van belang toegankelijker, waardoor meer onderzoekers deze gegevens in hun studies kunnen opnemen.
Met meer dan 100 miljoen cellen in het muizenbrein15 en beeldvormingssessies voor de hele hersenen die terabytes aan gegevens kunnen genereren, is er een toegenomen vraag naar geavanceerde beeldanalysetools die nauwkeurige kwantificering van functies in de afbeeldingen, zoals cellen, mogelijk maken. Er bestaan een groot aantal segmentatiemethoden voor weefselgeklaarde afbeeldingen die drempels toepassen voor nucleaire kleuringsintensiteit en filterobjecten met vooraf gedefinieerde vormen, maten of dichtheden 10,16,17,18. Onnauwkeurige interpretaties van resultaten kunnen echter het gevolg zijn van variaties in parameters zoals celgrootte, beeldcontrast en labelintensiteit. Dit artikel beschrijft ons gevestigde protocol om celkernen in het muizenbrein te kwantificeren. Eerst beschrijven we stappen voor weefselverzameling van de P4-muizenhersenen, gevolgd door een weefselzuiverings- en immunolabelingprotocol dat is geoptimaliseerd met de openbaar beschikbare iDISCO + -methode10. Ten tweede beschrijven we beeldacquisitie met behulp van MRI en lichtbladmicroscopie, inclusief de parameters die worden gebruikt voor het vastleggen van beelden. Ten slotte beschrijven en demonstreren we NuMorph19, een reeks beeldanalysetools die onze groep heeft ontwikkeld en die celtypespecifieke kwantificering mogelijk maakt na weefselzuivering, immunolabeling met nucleaire markers en light-sheet beeldvorming van geannoteerde regio's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

Weefselopruiming gevolgd door light-sheet microscopie (LSFM) maakt beeldvorming met cellulaire resolutie van intacte hersenstructuur mogelijk, waardoor kwantitatieve analyse van structurele veranderingen veroorzaakt door genetische of omgevingsverstoringen mogelijk is. Beeldvorming van de hele hersenen resulteert in een nauwkeurigere kwantificering van cellen en de studie van regiospecifieke verschillen die kunnen worden gemist met veelgebruikte microscopie van fysiek gesneden weefsel. Het gebruik van light-sheet microscopie om gewiste hersenen in beeld te brengen, verhoogt de acquisitiesnelheid aanzienlijk in vergelijking met confocale microscopie. Hoewel deze beelden zeer grote hoeveelheden structurele hersengegevens produceren, zijn de meeste computationele hulpmiddelen die functiekwantificering uitvoeren in afbeeldingen van gewist weefsel beperkt tot het tellen van schaarse celpopulaties, in plaats van alle kernen.
Hier demonstreren we NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), een groep analysetools, om alle kernen en nucleaire markers te kwantificeren binnen geannoteerde gebieden van een postnatale dag 4 (P4) muizenhersen na clearing en beeldvorming op een light-sheet microscoop. We beschrijven magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om het hersenvolume te meten voorafgaand aan krimp veroorzaakt door uitdrogingsstappen van weefsel, weefsel opruimen met behulp van de iDISCO + -methode, inclusief immunolabeling, gevolgd door light-sheet microscopie met behulp van een commercieel beschikbaar platform om muizenhersenen met cellulaire resolutie in beeld te brengen. Vervolgens demonstreren we deze pijplijn voor beeldanalyse met Behulp van NuMorph, dat wordt gebruikt om intensiteitsverschillen te corrigeren, beeldtegels te naaien, meerdere kanalen uit te lijnen, kernen te tellen en hersengebieden te annoteren door registratie op openbaar beschikbare atlassen.
We hebben deze aanpak ontworpen met behulp van openbaar beschikbare protocollen en software, waardoor elke onderzoeker met de nodige microscoop en computationele middelen deze technieken kan uitvoeren. Deze weefselopruimings-, beeldvormings- en computationele hulpmiddelen maken het mogelijk om de driedimensionale (3D) organisatie van celtypen in de cortex te meten en kwantificeren en zouden op grote schaal toepasbaar moeten zijn op elk wild-type / knock-out muisstudieontwerp.

Omdat het iDISCO+ protocol aanzienlijke weefselkrimp introduceert, die gemakkelijk merkbaar is door het oog (figuur 2B), hebben we een MRI-stap aan deze pijplijn toegevoegd voorafgaand aan het opruimen van weefsel om de krimp te kwantificeren die wordt veroorzaakt door weefselopruiming. De workflow begint met het verwijderen van het niet-hersenweefsel uit het MR-beeld (figuur 2C). Vervolgens wordt een rigide transformatie (3 translatie- en 3 rotatiehoeken) toege...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Met ongeveer 100 miljoen cellen in het muizenbrein en de grootte van cellulaire resolutiebeelden in de hele hersenen die de terabyteschaal benaderen, zijn geavanceerde beeldanalysetools nodig om cellen nauwkeurig te kwantificeren. Onze computationele pijplijn kan beelden voorbewerken en kernen in de cortex van de muis kwantificeren met behoud van een redelijk compromis tussen celdetectienauwkeurigheid, beeldtijd en computationele middelen. De procedure wordt gedemonstreerd door Felix Kyere en Ian Curtin, afgestudeerde studenten uit mijn lab.Monteer het monster om te beginnen in de juiste monstergroottehouder, zodat het monster is georiënteerd met de z-dimensie niet meer dan 5,2 millimeter diep vanwege de nominale werkafstand van de UltraMicroscope II-microscoop. Steek de houder vervolgens in de monsterhouder, zodat de schroef van de houder zich in een hoek van 45 graden bevindt ten opzichte van de steunen van de houder. Plaats vervolgens de houder in een zodanige positie dat het monster loodrecht op het lichtpad is gericht.Stel daarna de zoombody op de microscoop in op 4x vergroting of hoger, wat 0,75 micrometer per pixel oplevert. Selecteer in de Inspector Pro-software een enkel lichtblad met een numerieke diafragmawaarde van ongeveer 0,08. Om ervoor te zorgen dat de axiale resolutie over de breedte van de afbeelding wordt gehandhaafd, selecteert u Horizontaal dynamisch scherpstellen en past u het aanbevolen aantal stappen toe, afhankelijk van de golflengte van de laser.Pas vervolgens de fijnfocus voor elk kanaal aan ten opzichte van het registratiekanaal en het laservermogen per kanaal ten opzichte van de kanaaleigenschappen. Pas vervolgens de breedte van de lichte plaat aan op ongeveer 50% om ervoor te zorgen dat het plaatvermogen optimaal wordt verdeeld in de y-dimensie voor de steekproefgrootte. Stel daarna het aantal tegels in met betrekking tot de grootte van het monster met een aanbevolen overlap van 15% tussen tegels en leg afbeeldingen voor elk kanaal sequentieel vast voor elke stapel op een bepaalde tegelpositie.Download en installeer eerst Conda environment manager voor Linux en NuMorph beeldverwerkingstools. Voer matlab uit op de opdrachtregel en NM_setup. m van NuMorph om softwarepakketten voor beeldanalyse te downloaden en te installeren die nodig zijn voor analyse.Geef vervolgens voorbeeldnamen, invoer- en uitvoermappen, kanaalinformatie en light-sheet imaging-parameters op door het bestand NM_samples.m. te bewerken. Voor intensiteitsaanpassing, in NMp_template, stelt u intense aanpassing in op true en use_processed_images als onwaar wanneer u met een nieuwe set afbeeldingen werkt. Stel vervolgens save_images en save_samples in als waar.Stel vervolgens tegelschaduw in op basis om arceringscorrectie toe te passen met behulp van het basisalgoritme, of handmatig om tegelschaduwcorrectie toe te passen met behulp van metingen van de UltraMicroscope II op specifieke breedten van lichtplaten. Voor het uitlijnen van afbeeldingskanalen stelt u in NMp_template channel_alignment in op true en kanaal alignment_method op translatie of elastieken. Stel vervolgens sift_refinement in als true en overlapwaarde van 0,15 om tegeloverlappingen tijdens de afbeelding overeen te laten komen.Als u voorbewerkingsstappen wilt uitvoeren in MATLAB, geeft u de voorbeeldnaam op en stelt u de configuratie in op NM_config procesvoorbeeld. Voer vervolgens een van de voorbewerkingsstappen uit door NM_process configuratiesteek op te geven terwijl u de fase opgeeft met behulp van intensiteit, uitlijnen of naaien, en controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen. Begin met een 3D Atlas-afbeelding en een bijbehorende annotatieafbeelding die elke voxel aan een bepaalde structuur toewijst.Lijn zowel de Atlas-afbeelding als het annotatiebestand uit om ervoor te zorgen dat ze correct overeenkomen in de juiste richting. Verwerk na het uitlijnen de bestanden in NuMorph om de invoer op te geven zoals beschreven in het manuscript door de opdracht uit te voeren. Stel resample_images in NMa_template in op true en resample_resolution op de Atlas.Geef vervolgens het kanaalnummer op dat opnieuw moet worden bemonsterd met behulp van resample_channels. Stel daarna register_images in op true, geef de atlas_file op die overeenkomen met het bestand in de Atlas-map en stel registration_parameters in als standaard. Stel vervolgens save_registered_images in op true.Stel voor kerndetectie, celtelling en classificatie zowel count_nuclei als classify_cells als waar. Stel vervolgens de count_method in op 3dunet en min_intensity om een minimale intensiteitsdrempel voor gedetecteerde objecten te definiëren. Stel vervolgens classify_method in op een drempelwaarde die is gebaseerd op een niet-gecontroleerde fluorescentie-intensiteit op centroïde posities, of SVM die een gesuperviseerde lineaire ondersteuningsvectormachineclassificatie modelleert.Als u analysestappen wilt uitvoeren in MATLAB, geeft u de voorbeeldnaam op en stelt u de configuratie in op NM_config monster analyseren. Voer vervolgens een van de analysestappen uit door NM_analyze configuratiefase op te geven terwijl u de fase opgeeft met behulp van resample, register, count of classificeren en controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen. Stel in NMe_template update in op true en compare_structures_by op een van beide indexen.Stel vervolgens het sjabloonbestand en de structuurtabel in die alle mogelijke structuurindexen en structuren specificeert die moeten worden geëvalueerd, terwijl u celtelling en celtypeclassificatie opgeeft. Weefselzuivering met behulp van het iDISCO+-protocol en neuronale laagspecifieke kernmarkers resulteerde in duidelijk gedefinieerde celgroepen van neuronen in de bovenste en onderste laag in de isocortex. Het tellen van cellen met NuMorph was afhankelijk van succesvolle voorbewerkingsstappen met intensiteitsaanpassing, kanaaluitlijning en stiksels.Fouten in voorbewerkingsstappen kunnen echter leiden tot onjuist naaien, wat leidt tot onjuiste uitlijning en stiksels, en dus resulteren in afbeeldingen met een scherp en onscherp patroon. Om kernen uit specifieke hersengebieden te tellen, worden de gestikte afbeeldingen geannoteerd met behulp van Atlas, waardoor annotaties over hersengebieden kunnen worden gelegd. De centroïden van kernen werden gedetecteerd met een getraind 3D U-Net-model in NuMorph met ongeveer 12 miljoen totale kernen die TO-PRO-3-positief waren in de isocortex met ongeveer 2,6 miljoen hersen-twee-positieve en 1,6 miljoen CTIP2-positieve kernen.Ongeveer 3,7 en 2,9 miljoen TO-PRO-3-positieve totale kernen in respectievelijk de basale ganglia en hippocampale allocortex werden gedetecteerd. De hersen-twee-positieve cellen gedetecteerd in deze twee hersengebieden waren echter verwaarloosbaar, en slechts ongeveer 1,5 in minder dan een miljoen CTIP2-positieve cellen werden elk gedetecteerd in de basale ganglia en hippocampale allocortex. Voer visuele kwaliteitscontroles uit tijdens acquisitie om een goede segmentatie te bereiken.En de Conda-omgeving goed in te richten om ervoor te zorgen dat er geen fouten worden aangetroffen in een downstream-analyse. Naast het tellen van cellen, maakt deze pijplijn integratie mogelijk met andere segmentatietools die de celgrootte en -vorm meten, die vervolgens kunnen worden vergeleken tussen genotypegroepen. Met onze pijplijn kunnen we identificeren hoe de anatomie van de hersenen verandert bij cellulaire resolutie, wat leidt tot identificatie van celtypen en hersengebieden die belangrijk zijn voor het ziekterisico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Whole-Brain 3D-activering en functionele connectiviteit mapping bij muizen met behulp van transcraniële functionele echografie beeldvorming

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...