Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (R01MH121433, R01MH118349 ו-R01MH120125 ל-JLS ו-R01NS110791 ל-GW) וקרן התקווה. אנו מודים לפבלו אריאל מהמעבדה לשירותי מיקרוסקופיה על הסיוע בהדמיית דגימות. המעבדה לשירותי מיקרוסקופיה במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית נתמכת בחלקה על ידי מענק התמיכה המרכזי של מרכז הסרטן P30 CA016086 למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת צפון קרוליינה (UNC) ליינברגר. ליבת המיקרוסקופיה של מדעי המוח נתמכת על ידי מענק P30 NS045892. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך בחלקו על ידי מענק התמיכה המוסדית של מרכז הביוטק של צפון קרוליינה 2016-IDG-1016.

כל העכברים שימשו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
1. דיסקציה של עכבר וזלוף
הערה: הניתוחים הבאים בוצעו בעכברי P4 ו-P14 באמצעות מזרק. נפח נוזל הזלוף ישתנה בהתאם לגיל החיה.
<ol><li>פרפוזיה<br...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+system:+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy.">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li><li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism.">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSL.">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li><li>. iDISCO method Available from: <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022)</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide.">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).</li><li>. Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022)</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836 (2017).</li><li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

שיטות ניקוי רקמות הן טכניקות שימושיות למדידת ארגון תאי תלת-ממדי של המוח. ישנן שורה של שיטות ניקוי רקמות המתוארות בספרות, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה 6,7,8,9. האפשרויות לכלים חישוביים לניתוח סוגי התאים בתמונות המנוקות ?...

דימות מוחי שלם ברזולוציה של תא בודד הוא אתגר חשוב במדעי המוח. תמונות מוח ברזולוציה תאית מאפשרות ניתוח מפורט ומיפוי ברמת המערכת של מעגלי המוח וכיצד מעגלים אלה מופרעים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים להפרעות נוירופסיכיאטריות, התנהגות תאית בעוברים מתפתחים, כמו גם מעגלים עצביים במוח הבוגר 1,2,3. ישנן שיטות היסטולוגיות מרובות המאפשרות תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח התלת-ממדי המשוחזר; עם זאת, טכניקות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, ייתכן שאינן תואמות את התווית החיסונית, והאופי הדו-ממדי (2D) של שיטות מסוימות עלול להוביל לנזק לרקמות ולגזירה במהלך חתך 4,5.
ההתקדמות האחרונה סיפקה גישה חלופית להדמיית מוחות שלמים שאינה דורשת חיתוך רקמות; הם כוללים שימוש בניקוי רקמות כדי להפוך את המוחות לשקופים. שקיפות מושגת ברוב שיטות ניקוי הרקמות הן על ידי הסרת שומנים, מכיוון שהם מקור עיקרי לפיזור אור, והן על ידי התאמת מקדם השבירה (RI) של האובייקט ל- RI של תמיסת טבילת הדגימה במהלך ההדמיה. האור יכול לעבור את הגבול בין החומרים מבלי להיות מפוזר 6,7,8,9.
שיטות ניקוי רקמות, כגון iDISCO+, משולבות לעתים קרובות עם הדמיה תלת-ממדית מהירה באמצעות מיקרוסקופיית עירור של פוטון יחיד, כגון LSFM 6,7,10. בתוך רקמות שקופות המסומנות בפלואורופור, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מצלמת מקטעים על ידי עירור עם מישור דק של אור11. היתרון העיקרי של LSFM הוא שמקטע אופטי יחיד מואר בכל פעם, כאשר כל הפלואורסצנטיות מהמולקולות בתוך אותו מקטע נרגשות, מה שממזער את הפוטו-הלבנה. יתר על כן, הדמיית פרוסה אופטית שלמה מאפשרת זיהוי מבוסס מצלמה של אותה פרוסה נרגשת, מה שמגדיל את המהירות ביחס לסריקת נקודה12. LSFM מייצרת באופן לא פולשני חלקים אופטיים רשומים היטב המתאימים לשחזור תלת-ממדי.
בעוד ששיטת iDISCO+ מאפשרת ניקוי רקמות זול תוך ~3 שבועות, שלבי התייבשות בתוך הפרוטוקול עלולים להוביל להתכווצות רקמות ולשינוי פוטנציאלי במורפולוגיה של הדגימה, ובכך להשפיע על מדידות נפחיות 6,10. הוספת שיטת הדמיה משנית, כגון MRI, לשימוש לפני הליך ניקוי הרקמות יכולה למדוד את מידת ההתכווצות הנגרמת על ידי ניקוי רקמות על פני הדגימה. במהלך שלבי ההתייבשות, הבדלים בתכונות המכניות בין החומר האפור והלבן עלולים להוביל לעיוותים לא אחידים של חומר מוחי, וכתוצאה מכך לעיוותי נפח שונים הנגרמים על ידי ניקוי רקמות בין דגימות מסוג בר לדגימות מוטנטיות, ועלולים לבלבל פרשנויות של הבדלים נפחיים בדגימות אלה10,13 . MRI מבוצע על ידי החדרת החיה תחילה עם חומר ניגוד (למשל, גדוליניום), ולאחר מכן דגירה של הרקמה המופקת המעניינת בתמיסת טבילה (למשל, פומבלין) לפני הדמיה14. MRI תואם לניקוי רקמות וביצוע LSFM על אותה דגימה.
LSFM משמש לעתים קרובות ליצירת תמונות מיקרוסקופיה בקנה מידה גדול להדמיה איכותית של רקמת המוח המעניינת, במקום להערכה כמותית של מבנה המוח (איור 1). ללא הערכה כמותית, קשה להדגים הבדלים מבניים הנובעים מעלבונות גנטיים או סביבתיים. ככל שטכנולוגיות ניקוי הרקמות וההדמיה משתפרות, יחד עם ירידה בעלויות האחסון וכוח המחשוב, כימות לוקליזציות של סוגי תאים בתוך הרקמה המעניינת הופך לנגיש יותר, ומאפשר ליותר חוקרים לכלול נתונים אלה במחקריהם.
עם למעלה מ-100 מיליון תאים במוח העכבר15 ומפגשי הדמיה של מוח שלם שיכולים לייצר טרה-בייטים של נתונים, יש ביקוש מוגבר לכלי ניתוח תמונה מתקדמים המאפשרים כימות מדויק של תכונות בתוך התמונות, כגון תאים. קיימות שורה של שיטות סגמנטציה לתמונות מנוקות רקמות המיישמות סף לעוצמת צביעה גרעינית ומסננות עצמים עם צורות, גדלים או צפיפויותמוגדרים מראש 10,16,17,18. עם זאת, פרשנויות לא מדויקות של תוצאות יכולות לנבוע מווריאציות בפרמטרים כגון גודל התא, ניגודיות התמונה ועוצמת התיוג. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול המבוסס שלנו לכימות גרעיני תאים במוח העכבר. ראשית, אנו מפרטים שלבים לאיסוף רקמות של מוח עכבר P4, ולאחר מכן פרוטוקול ניקוי רקמות ותיוג חיסוני המותאם לשיטת iDISCO+10 הזמינה לציבור. שנית, אנו מתארים רכישת תמונות באמצעות MRI ומיקרוסקופיה של יריעות אור, כולל הפרמטרים המשמשים ללכידת תמונות. לבסוף, אנו מתארים ומדגימים את NuMorph19, סט של כלי ניתוח תמונה שהקבוצה שלנו פיתחה המאפשר כימות ספציפי של סוג התא לאחר ניקוי רקמות, תיוג חיסוני עם סמנים גרעיניים והדמיית יריעות אור של אזורים מבוארים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

ניקוי רקמות ואחריו מיקרוסקופיה של יריעות אור (LSFM) מאפשרים הדמיה ברזולוציה תאית של מבנה מוח שלם, ומאפשרים ניתוח כמותי של שינויים מבניים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או סביבתיות. הדמיה של מוח שלם מביאה לכימות מדויק יותר של תאים ולחקר הבדלים ספציפיים לאזור שעלולים להתפספס במיקרוסקופיה נפוצה של רקמות שנחתכו פיזית. שימוש במיקרוסקופיה של יריעות אור כדי לצלם מוחות מנוקים מגביר מאוד את מהירות הרכישה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אף על פי שתמונות אלה מייצרות כמויות גדולות מאוד של נתונים מבניים על המוח, רוב הכלים החישוביים המבצעים כימות תכונות בתמונות של רקמות מנוקות מוגבלים לספירת אוכלוסיות תאים דלילות, ולא לכל הגרעינים.
כאן אנו מדגימים את NuMorph (מורפומטריה מבוססת גרעין), קבוצה של כלי ניתוח, כדי לכמת את כל הגרעינים והסמנים הגרעיניים באזורים מבוארים במוח עכבר ביום 4 (P4) לאחר הלידה לאחר ניקוי והדמיה במיקרוסקופ של יריעת אור. אנו מתארים דימות תהודה מגנטית (MRI) למדידת נפח המוח לפני התכווצות הנגרמת על ידי שלבי התייבשות של ניקוי רקמות, ניקוי רקמות בשיטת iDISCO+, כולל תיוג חיסוני, ולאחר מכן מיקרוסקופיה של יריעות אור באמצעות פלטפורמה זמינה מסחרית לצילום מוחות עכברים ברזולוציה תאית. לאחר מכן אנו מדגימים את צינור ניתוח התמונות הזה באמצעות NuMorph, המשמש לתיקון הבדלי עוצמה, לתפירת אריחי תמונה, יישור ערוצים מרובים, ספירת גרעינים וביאור אזורי מוח באמצעות רישום לאטלסים הזמינים לציבור.
עיצבנו גישה זו תוך שימוש בפרוטוקולים ובתוכנות הזמינים לציבור, ומאפשרים לכל חוקר בעל המיקרוסקופ והמשאבים החישוביים הדרושים לבצע טכניקות אלה. כלים אלה של ניקוי רקמות, הדמיה וחישוב מאפשרים מדידה וכימות של הארגון התלת-ממדי (3D) של סוגי תאים בקליפת המוח, והם אמורים להיות ישימים באופן נרחב לכל תכנון מחקר של עכברי בר/נוקאאוט.

מכיוון שפרוטוקול iDISCO+ מציג התכווצות משמעותית של רקמות, שניתן להבחין בה בקלות בעין (איור 2B), הוספנו שלב MRI לצינור זה לפני פינוי הרקמות כדי לכמת את ההתכווצות הנגרמת על-ידי ניקוי רקמות. תהליך העבודה מתחיל בהסרת הרקמה שאינה במוח מתמונת ה-MR (איור 2C). לאחר מכן, טרנספ?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

עם כ-100 מיליון תאים במוח העכבר וגדלים של תמונות ברזולוציה תאית של מוח שלם המתקרבים לסולם טרה-בייט, יש צורך בכלי ניתוח תמונה מתקדמים כדי לכמת במדויק תאים. הצינור החישובי שלנו יכול לעבד מראש תמונות ולכמת גרעינים בתוך קליפת המוח של העכבר תוך שמירה על פשרה סבירה בין דיוק זיהוי התאים, זמן ההדמיה והמשאבים החישוביים. מי שידגימו את ההליך יהיו פליקס קייר ואיאן קרטין, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, הרכב את הדגימה במחזיק גודל המדגם הנכון כך שהמדגם מכוון עם ממד z לא יותר מ 5.2 מילימטרים בעומק בשל מרחק העבודה המדורג של מיקרוסקופ UltraMicroscope II. לאחר מכן הכנס את המחזיק לעריסת הדגימה כך שהבורג של המחזיק נמצא בזווית של 45 מעלות לתמיכות העריסה. לאחר מכן, מקם את העריסה במיקום כך שהדגימה מכוונת בניצב לנתיב האור.לאחר מכן, הגדר את גוף הזום במיקרוסקופ להגדלה של פי 4 ומעלה, והניב 0.75 מיקרומטר לפיקסל. בתוכנת Inspector Pro, בחר גיליון אור יחיד עם ערך צמצם מספרי של כ- 0.08. כדי להבטיח שמירה על רזולוציה צירית לאורך רוחב התמונה, בחרו 'מיקוד דינמי אופקי' והחלו את מספר הצעדים המומלץ בהתאם לאורך גל הלייזר.לאחר מכן התאם את המיקוד העדין עבור כל ערוץ ביחס לערוץ הרישום ועוצמת הלייזר לערוץ ביחס למאפייני הערוץ. לאחר מכן, התאם את רוחב גיליון האור לכ-50% כדי להבטיח שעוצמת הגיליון תחולק בצורה אופטימלית בממד y עבור גודל המדגם. לאחר מכן, הגדר את מספר האריחים ביחס לגודל המדגם עם חפיפה מומלצת של 15% בין אריחים, ולכוד תמונות עבור כל ערוץ ברצף עבור כל ערימה במיקום אריח נתון.ראשית, הורד והתקן את מנהל הסביבה של Conda עבור לינוקס וכלי עיבוד תמונה NuMorph. בשורת הפקודה, הפעל את matlab ו- NM_setup. m מ NuMorph כדי להוריד ולהתקין חבילות תוכנה לניתוח תמונות הדרושות לניתוח.לאחר מכן ציין שמות לדוגמה, ספריות קלט ופלט, פרטי ערוץ ופרמטרים של הדמיית גיליון אור על-ידי עריכת הקובץ NM_samples.m. להתאמת עוצמה, ב- NMp_template, הגדר את ההתאמה ל- true ו- use_processed_images כ- false בעת עבודה עם ערכת תמונות חדשה. לאחר מכן, הגדר את save_images ואת save_samples כאמת.לאחר מכן, הגדר את הצללת האריחים לבסיסית כדי להחיל תיקון הצללה באמצעות האלגוריתם הבסיסי, או ידנית להחלת תיקון הצללת אריחים באמצעות מדידות מ- UltraMicroscope II ברוחב גיליון אור ספציפי. ליישור ערוץ תמונה, ב- NMp_template, הגדר channel_alignment ל- true ואת alignment_method הערוץ לתרגום או לגלסטיות. לאחר מכן, הגדר sift_refinement כערך true וערך חפיפה של 0.15 כדי להתאים לחפיפת אריחים במהלך ההדמיה.כדי להפעיל שלבי עיבוד מקדים ב- MATLAB, ציין את שם הדגימה והגדר את התצורה NM_config דגימת תהליך. לאחר מכן הפעל כל אחד משלבי העיבוד המקדים על-ידי ציון תפר תצורה NM_process תוך ציון השלב באמצעות עוצמה, יישור או תפירה, ובדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים. התחל עם תמונת אטלס תלת-ממדית ותמונת ביאור משויכת המקצה כל ווקסל למבנה מסוים.יישר הן את תמונת Atlas והן את קובץ הביאור כדי לוודא שהם תואמים כהלכה בכיוון הנכון. לאחר היישור, עבד את הקבצים ב- NuMorph כדי לציין את הקלטים כמתואר בכתב היד על-ידי ביצוע הפקודה. בשנת NMa_template, הגדר resample_images ל- true ו- resample_resolution להתאים לאטלס.לאחר מכן ציין את מספר הערוץ שיידגם מחדש באמצעות resample_channels. לאחר מכן, הגדר את register_images ל- true, ציין את atlas_file שיתאים לקובץ בספריית Atlas והגדר את registration_parameters כברירת מחדל. לאחר מכן הגדר את save_registered_images כ- true.עבור זיהוי גרעינים, ספירת תאים וסיווגם, הגדר הן count_nuclei והן classify_cells כאמת. לאחר מכן הגדר את count_method ל- 3dunet ו- min_intensity כדי להגדיר סף עוצמה מינימלי עבור אובייקטים שזוהו. לאחר מכן, הגדר classify_method לסף המבוסס על עוצמת פלואורסצנטיות לא מפוקחת במיקומים צנטרואידים, או SVM אשר מדגים מסווג מכונת וקטור תמיכה ליניארית מפוקחת.כדי לבצע שלבי ניתוח ב- MATLAB, ציין את שם הדגימה והגדר את התצורה לניתוח דגימה NM_config. לאחר מכן, הפעל כל אחד משלבי הניתוח על-ידי ציון שלב קביעת התצורה NM_analyze תוך ציון השלב באמצעות דגימה מחדש, רישום, ספירה או סיווג ובדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים. ב- NMe_template, הגדר את העדכון ל- true ואת compare_structures_by- לכל אחד מהאינדקסים.לאחר מכן הגדר את קובץ התבנית ואת טבלת המבנה, המציינת את כל האינדקסים והמבנים האפשריים למבנה להערכה, תוך ציון ספירת תאים וסיווג סוגי תאים. ניקוי רקמות באמצעות פרוטוקול iDISCO+ וסמני גרעינים ספציפיים לשכבה העצבית הביא לקבוצות תאים מוגדרות בבירור של נוירונים בשכבה העליונה והתחתונה באיזוקורטקס. ספירת תאים באמצעות NuMorph הייתה תלויה בשלבי עיבוד מקדים מוצלחים שכללו התאמת עוצמה, יישור ערוצים ותפירה.עם זאת, שגיאות בשלבי העיבוד המקדים עלולות לגרום לתפירה לא נכונה, מה שיוביל ליישור ותפירה לא תקינים, וכך לגרום לתמונות עם דפוס לא ממוקד ולא ממוקד. על מנת לספור גרעינים מאזורי מוח ספציפיים, התמונות התפורות יעברו ביאורים באמצעות אטלס, מה שיאפשר לכסות ביאורים על אזורי המוח. הצנטרואידים של הגרעינים זוהו באמצעות מודל U-Net תלת-ממדי מאומן ב-NuMorph עם כ-12 מיליון גרעינים סה"כ שהיו TO-PRO-3-חיוביים באיזוקורטקס עם כ-2.6 מיליון גרעינים חיוביים למוח ו-1.6 מיליון גרעינים חיוביים ל-CTIP2.כ-3.7 ו-2.9 מיליון גרעינים חיוביים ל-TO-PRO-3 בסך הכל בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס בהיפוקמפוס זוהו, בהתאמה. עם זאת, התאים הדו-חיוביים במוח שזוהו בשני אזורי המוח האלה היו זניחים, ורק כ-1.5 מתוך פחות ממיליון תאים חיוביים ל-CTIP2 זוהו כל אחד בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס בהיפוקמפוס. בצע בדיקות איכות חזותיות במהלך הרכישה כדי להשיג פילוח טוב.והגדר כראוי את סביבת Conda כדי להבטיח שלא ייתקלו בשגיאות בניתוח במורד הזרם. בנוסף לספירת תאים, צינור זה מאפשר אינטגרציה עם כלי סגמנטציה אחרים המודדים את גודל התא וצורתו, אשר לאחר מכן ניתן להשוות בין קבוצות גנוטיפ. בעזרת הצינור שלנו, אנו יכולים לזהות כיצד האנטומיה של המוח משתנה ברזולוציה התאית, מה שמוביל לזיהוי סוגי תאים ואזורים במוח החשובים לסיכון למחלות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

הפעלה תלת-ממדית של המוח כולו ומיפוי קישוריות תפקודית בעכברים באמצעות הדמיית אולטרסאונד תפקודית טרנס-ת-רה-אופן

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...