Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

इस काम को एनआईएच (R01MH121433, R01MH118349, और R01MH120125 से JLS और R01NS110791 से GW) और फाउंडेशन ऑफ होप द्वारा समर्थित किया गया था। हम नमूना इमेजिंग में सहायता के लिए माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला के पाब्लो एरियल को धन्यवाद देते हैं। पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग में माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय (यूएनसी) लाइनबर्गर कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट पी 30 सीए 016086 द्वारा समर्थित है। न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर अनुदान पी 30 एनएस 045892 द्वारा समर्थित है। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को उत्तरी कैरोलिना बायोटेक सेंटर इंस्टीट्यूशनल सपोर्ट ग्रांट 2016-आईडीजी -1016 द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी चूहों का उपयोग चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार और अनुमोदित किया गया था।
1. माउस विच्छेदन और छिड़काव
<p class="jove_cont...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. 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ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क के 3 डी सेलुलर संगठन को मापने के लिए उपयोगी तकनीकें हैं। साहित्य में वर्णित ऊतक समाशोधन विधियों की एक मेजबानी है, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और सीमाएं 6,7,8,9 हैं?...

एकल-कोशिका संकल्प पर पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क छवियां मस्तिष्क सर्किटरी के विस्तृत विश्लेषण और सिस्टम-स्तरीय मानचित्रण की अनुमति देती हैं और न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों, विकासशील भ्रूण में सेलुलर व्यवहार, साथ ही वयस्क मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट के लिए आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोखिम कारकों द्वारा सर्किटरीकैसे बाधित होती है। कई हिस्टोलॉजिकल विधियां हैं जो पुनर्निर्मित 3 डी मस्तिष्क की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की अनुमति देती हैं; हालांकि, इन तकनीकों को महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, इम्यूनोलेबलिंग के साथ संगत नहीं हो सकते हैं, और कुछ तरीकों की दो-आयामी (2 डी) प्रकृति से सेक्शनिंग 4,5 के दौरान ऊतक क्षति और कतरन हो सकता है।
हाल की प्रगति ने पूरे दिमाग की इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान किया है जिसे ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं है; वे दिमाग को पारदर्शी बनाने के लिए ऊतक समाशोधन का उपयोग करना शामिल करते हैं। लिपिड को हटाकर अधिकांश ऊतक समाशोधन विधियों में पारदर्शिता प्राप्त की जाती है, क्योंकि वे प्रकाश प्रकीर्णन का एक प्रमुख स्रोत हैं, और इमेजिंग के दौरान नमूना विसर्जन समाधान के आरआई के साथ वस्तु के अपवर्तक सूचकांक (आरआई) का मिलान करते हैं। प्रकाश तब बिखरे हुए 6,7,8,9 के बिना सामग्री के बीच की सीमा से गुजर सकता है।
ऊतक समाशोधन विधियों, जैसे कि आईडीआईएससीओ +, को अक्सर एकल-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तेजी से 3 डी इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, जैसे कि एलएसएफएम 6,7,10। फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए पारदर्शी ऊतकों के भीतर, प्रकाश-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रकाश 11 के पतले विमान के साथ उत्तेजना द्वारा वर्गों कोचित्रित करती है। एलएसएफएम का मुख्य लाभ यह है कि एक एकल ऑप्टिकल खंड एक समय में रोशन होता है, जिसमें उस खंड के भीतर अणुओं से सभी प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है, जो फोटोब्लीचिंग को कम करती है। इसके अलावा, एक पूरे ऑप्टिकल स्लाइस की इमेजिंग उस उत्तेजित स्लाइस का कैमरा-आधारित पता लगाने में सक्षम बनाती है, जिससे पॉइंट स्कैनिंग12 के सापेक्ष गति बढ़ जाती है। एलएसएफएम गैर-विनाशकारी रूप से अच्छी तरह से पंजीकृत ऑप्टिकल वर्गों का उत्पादन करता है जो 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त हैं।
जबकि आईडीआईएससीओ + विधि ~ 3 सप्ताह के भीतर सस्ती ऊतक समाशोधन की अनुमति देती है, प्रोटोकॉल के भीतर निर्जलीकरण चरणों से ऊतक संकोचन और नमूना आकृति विज्ञान का संभावित परिवर्तन हो सकता है, इस प्रकार वॉल्यूमेट्रिक माप 6,10 को प्रभावित कर सकता है। ऊतक समाशोधन प्रक्रिया से पहले उपयोग की जाने वाली एमआरआई जैसी द्वितीयक इमेजिंग विधि को जोड़ना नमूने में ऊतक समाशोधन-प्रेरित संकोचन की डिग्री को माप सकता है। निर्जलीकरण चरणों के दौरान, ग्रे और सफेद पदार्थ के बीच यांत्रिक गुणों में अंतर से गैर-समान मस्तिष्क पदार्थ विरूपण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती नमूनों के बीच असमान ऊतक समाशोधन-प्रेरित मात्रा विरूपण हो सकता है और इन नमूनों में वॉल्यूमेट्रिक अंतर की व्याख्या को भ्रमित कर सकताहै 10,13 . एमआरआई पहले जानवर को एक कंट्रास्ट एजेंट (जैसे, गैडोलीनियम) के साथ जोड़कर किया जाता है, इसके बाद इमेजिंग14 से पहले विसर्जन समाधान (जैसे, फोम्ब्लिन) में रुचि के निकाले गए ऊतक को इंजेक्ट किया जाता है। एमआरआई ऊतक समाशोधन और एक ही नमूने पर एलएसएफएम करने के साथ संगत है।
एलएसएफएम का उपयोग अक्सर मस्तिष्क संरचना के मात्रात्मक मूल्यांकन के बजाय रुचि के मस्तिष्क ऊतक के गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बड़े पैमाने पर माइक्रोस्कोपी छवियां बनाने के लिए किया जाता है (चित्रा 1)। मात्रात्मक मूल्यांकन के बिना, आनुवंशिक या पर्यावरणीय अपमान के परिणामस्वरूप संरचनात्मक अंतर प्रदर्शित करना मुश्किल है। चूंकि ऊतक-समाशोधन और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में सुधार होता है, भंडारण और कंप्यूटिंग शक्ति की लागत में कमी के साथ, रुचि के ऊतक के भीतर सेल प्रकार के स्थानीयकरण की मात्रा निर्धारित करना अधिक सुलभ होता जा रहा है, जिससे अधिक शोधकर्ता इन आंकड़ों को अपने अध्ययन में शामिल कर सकते हैं।
माउस मस्तिष्क15 और पूरे मस्तिष्क इमेजिंग सत्रों में 100 मिलियन से अधिक कोशिकाओं के साथ जो डेटा के टेराबाइट उत्पन्न कर सकते हैं, उन्नत छवि विश्लेषण उपकरणों की मांग बढ़ जाती है जो छवियों के भीतर सुविधाओं की सटीक मात्रा की अनुमति देते हैं, जैसे कि कोशिकाएं। ऊतक-साफ़ छवियों के लिए विभाजन विधियों की एक मेजबानी मौजूद है जो परमाणु धुंधला तीव्रता के लिए दहलीज लागू करती है और पूर्वनिर्धारित आकृतियों, आकारों या घनत्व10,16,17,18 के साथ वस्तुओं को फ़िल्टर करती है। हालांकि, परिणामों की गलत व्याख्या सेल आकार, छवि कंट्रास्ट और लेबलिंग तीव्रता जैसे मापदंडों में भिन्नता से उत्पन्न हो सकती है। यह पेपर माउस मस्तिष्क में सेल नाभिक को निर्धारित करने के लिए हमारे स्थापित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सबसे पहले, हम पी 4 माउस मस्तिष्क के ऊतक संग्रह के लिए चरणों का विस्तार करते हैं, इसके बाद सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आईडीआईएससीओ + विधि10 से अनुकूलित ऊतक समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल। दूसरा, हम एमआरआई और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि अधिग्रहण का वर्णन करते हैं, जिसमें छवियों को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर शामिल हैं। अंत में, हम न्यूमोर्फ19 का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, हमारे समूह द्वारा विकसित छवि विश्लेषण उपकरणों का एक सेट जो ऊतक समाशोधन, परमाणु मार्करों के साथ इम्यूनोलेबलिंग और एनोटेटेड क्षेत्रों की लाइट-शीट इमेजिंग के बाद सेल-प्रकार विशिष्ट परिमाणीकरण की अनुमति देता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के बाद ऊतक समाशोधन बरकरार मस्तिष्क संरचना के सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे आनुवंशिक या पर्यावरणीय गड़बड़ी के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है। पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की अधिक सटीक मात्रा और क्षेत्र-विशिष्ट मतभेदों का अध्ययन होता है जो शारीरिक रूप से विभाजित ऊतक के आमतौर पर उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी के साथ याद किया जा सकता है। साफ़ किए गए दिमाग की छवि के लिए लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिग्रहण की गति बहुत बढ़ जाती है। यद्यपि ये छवियां बहुत बड़ी मात्रा में मस्तिष्क संरचनात्मक डेटा का उत्पादन करती हैं, अधिकांश कम्प्यूटेशनल उपकरण जो साफ ऊतक की छवियों में सुविधा परिमाणीकरण करते हैं, सभी नाभिकों के बजाय विरल सेल आबादी की गिनती तक सीमित हैं।
यहां, हम न्यूमोर्फ (परमाणु-आधारित मॉर्फोमेट्री), विश्लेषण उपकरणों का एक समूह प्रदर्शित करते हैं, जो एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर समाशोधन और इमेजिंग के बाद प्रसवोत्तर दिन 4 (पी 4) माउस मस्तिष्क के एनोटेट क्षेत्रों के भीतर सभी नाभिक और परमाणु मार्करों को निर्धारित करने के लिए है। हम चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का वर्णन ऊतक समाशोधन निर्जलीकरण चरणों के कारण होने वाले संकोचन से पहले मस्तिष्क की मात्रा को मापने के लिए करते हैं, इम्यूनोलेबलिंग सहित आईडीआईएससीओ + विधि का उपयोग करके ऊतक समाशोधन, इसके बाद सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर माउस दिमाग की छवि बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच का उपयोग करके लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। फिर हम न्यूमोर्फ का उपयोग करके इस छवि विश्लेषण पाइपलाइन का प्रदर्शन करते हैं, जिसका उपयोग तीव्रता अंतर को ठीक करने, छवि टाइलों को सिलाई करने, कई चैनलों को संरेखित करने, नाभिक की गणना करने और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एटलस में पंजीकरण के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों को एनोटेट करने के लिए किया जाता है।
हमने सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस दृष्टिकोण को डिजाइन किया, जिससे किसी भी शोधकर्ता को इन तकनीकों को करने के लिए आवश्यक माइक्रोस्कोप और कम्प्यूटेशनल संसाधनों की अनुमति मिली। ये ऊतक समाशोधन, इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल उपकरण कॉर्टेक्स में सेल-प्रकारों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन के माप और परिमाणीकरण की अनुमति देते हैं और किसी भी जंगली-प्रकार / नॉकआउट माउस अध्ययन डिजाइन पर व्यापक रूप से लागू होना चाहिए।

जैसा कि आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण ऊतक संकोचन का परिचय देता है, जो आंखों द्वारा आसानी से ध्यान देने योग्य है (चित्रा 2 बी), हमने ऊतक समाशोधन से प्रेरित संकोचन को निर्धारित करने के लिए ?...

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Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

यह प्रोटोकॉल आईडीआईएससीओ + का उपयोग करके बरकरार माउस दिमाग के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग के संचालन के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेजिंग का विस्तृत विवरण और न्यूमोर्फ का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करता है।

एमआरआई, ऊतक समाशोधन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका इमेजिंग और बरकरार नवजात माउस दिमाग का विश्लेषण

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

माउस मस्तिष्क में लगभग 100 मिलियन कोशिकाओं और पूरे मस्तिष्क सेलुलर रिज़ॉल्यूशन छवियों के आकार के साथ टेराबाइट पैमाने के करीब, कोशिकाओं को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए उन्नत छवि विश्लेषण उपकरण की आवश्यकता होती है। हमारी कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन सेल-डिटेक्शन सटीकता, इमेजिंग समय और कम्प्यूटेशनल संसाधनों के बीच उचित समझौता बनाए रखते हुए माउस कॉर्टेक्स के भीतर छवियों को प्रीप्रोसेस कर सकती है और नाभिक की मात्रा निर्धारित कर सकती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन फेलिक्स केयर और इयान कर्टिन, मेरी प्रयोगशाला के स्नातक छात्र होंगे।शुरू करने के लिए, नमूने को सही नमूना आकार धारक में माउंट करें ताकि नमूना अल्ट्रामाइक्रोस्कोप II माइक्रोस्कोप की रेटेड कार्य दूरी के कारण जेड-आयाम गहराई में 5.2 मिलीमीटर से अधिक न हो। फिर धारक को नमूना पालने में डालें ताकि धारक का पेंच पालने के समर्थन के लिए 45 डिग्री कोण पर हो। इसके बाद, पालने को ऐसी स्थिति में रखें कि नमूना प्रकाश पथ के लंबवत उन्मुख हो।बाद में, माइक्रोस्कोप पर ज़ूम बॉडी को 4x आवर्धन या उच्चतर पर सेट करें, जिससे प्रति पिक्सेल 0.75 माइक्रोमीटर प्राप्त हो। इंस्पेक्टर प्रो सॉफ्टवेयर में, लगभग 0.08 के संख्यात्मक एपर्चर मान के साथ एक एकल प्रकाश शीट का चयन करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवि की चौड़ाई के साथ अक्षीय रिज़ॉल्यूशन बनाए रखा गया है, क्षैतिज गतिशील फोकसिंग का चयन करें और लेजर तरंग दैर्ध्य के आधार पर चरणों की अनुशंसित संख्या लागू करें।फिर चैनल गुणों के संबंध में पंजीकरण चैनल और प्रति चैनल लेजर पावर के संबंध में प्रत्येक चैनल के लिए ठीक फ़ोकस समायोजित करें। इसके बाद, नमूना आकार के लिए वाई-आयाम में शीट पावर को बेहतर ढंग से वितरित करने के लिए प्रकाश-शीट चौड़ाई को लगभग 50% तक समायोजित करें। बाद में, टाइलों के बीच 15% के अनुशंसित ओवरलैप के साथ नमूने के आकार के संबंध में टाइलों की संख्या सेट करें, और किसी दिए गए टाइल की स्थिति में प्रत्येक स्टैक के लिए क्रमिक रूप से प्रत्येक चैनल के लिए छवियों को कैप्चर करें।सबसे पहले, लिनक्स और न्यूमोर्फ छवि-प्रसंस्करण उपकरण के लिए कोंडा पर्यावरण प्रबंधक डाउनलोड और स्थापित करें। कमांड लाइन पर, मैटलैब और NM_setup चलाएं। विश्लेषण के लिए आवश्यक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज डाउनलोड और इंस्टॉल करने के लिए NuMorph से m।फिर फ़ाइल NM_samples.एम संपादित करके नमूना नाम, इनपुट और आउटपुट निर्देशिका, चैनल जानकारी और लाइट-शीट इमेजिंग पैरामीटर निर्दिष्ट करें। तीव्रता समायोजन के लिए, NMp_template में, छवियों के एक नए सेट के साथ काम करते समय सही और use_processed_images के समायोजन को गलत के रूप में सेट करें। इसके बाद, save_images और save_samples को सच के रूप में सेट करें।इसके बाद, मूल एल्गोरिथ्म का उपयोग करके छायांकन सुधार लागू करने के लिए टाइल छायांकन को मूल पर सेट करें, या विशिष्ट प्रकाश-शीट चौड़ाई पर अल्ट्रामाइक्रोस्कोप II से माप का उपयोग करके टाइल छायांकन सुधार लागू करने के लिए मैनुअल। छवि चैनल संरेखण के लिए, NMp_template में, channel_alignment को सही पर सेट करें और अनुवाद या लोचदार के लिए चैनल alignment_method। इसके बाद, इमेजिंग के दौरान टाइल ओवरलैप से मेल खाने के लिए sift_refinement को सही और 0.15 के ओवरलैप मान के रूप में सेट करें।MATLAB में प्रीप्रोसेसिंग चरणों को चलाने के लिए, नमूना नाम निर्दिष्ट करें और कॉन्फ़िगरेशन को NM_config प्रक्रिया नमूने पर सेट करें। फिर तीव्रता, संरेखण, या स्टिच का उपयोग करके चरण निर्दिष्ट करते समय NM_process कॉन्फ़िगरेशन स्टिच निर्दिष्ट करके किसी भी प्रीप्रोसेसिंग चरण को चलाएं, और प्रत्येक चरण के लिए आउटपुट फ़ाइलों के लिए आउटपुट निर्देशिका की जांच करें। एक 3 डी एटलस छवि और एक संबद्ध एनोटेशन छवि से शुरू करें जो प्रत्येक वोक्सेल को एक विशेष संरचना को प्रदान करता है।एटलस छवि और एनोटेशन फ़ाइल दोनों को संरेखित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे सही अभिविन्यास में सही ढंग से मेल खाते हैं। संरेखण के बाद, कमांड निष्पादित करके पांडुलिपि में वर्णित इनपुट को निर्दिष्ट करने के लिए न्यूमोर्फ में फ़ाइलों को संसाधित करें। NMa_template में, एटलस से मेल खाने के लिए resample_images को सच और resample_resolution पर सेट करें।फिर resample_channels का उपयोग करके पुन: नमूना लेने के लिए चैनल नंबर निर्दिष्ट करें। बाद में, register_images को सत्य में सेट करें, एटलस निर्देशिका में फ़ाइल से मेल खाने के लिए atlas_file निर्दिष्ट करें, और registration_parameters डिफ़ॉल्ट रूप से सेट करें। फिर save_registered_images सच करें।नाभिक का पता लगाने, कोशिका गणना और वर्गीकरण के लिए, count_nuclei और classify_cells दोनों को सत्य के रूप में सेट करें। फिर count_method को 3dunet पर सेट करें और पता लगाए गए ऑब्जेक्ट्स के लिए न्यूनतम तीव्रता सीमा को परिभाषित करने के लिए min_intensity करें। इसके बाद, classify_method को या तो दहलीज पर सेट करें जो केन्द्रक पदों पर एक गैर-पर्यवेक्षित प्रतिदीप्ति तीव्रता पर आधारित है, या एसवीएम जो एक पर्यवेक्षित रैखिक समर्थन वेक्टर मशीन क्लासिफायर को मॉडल करता है।MATLAB में विश्लेषण चरणों को निष्पादित करने के लिए, नमूना नाम निर्दिष्ट करें और नमूना विश्लेषण करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन सेट NM_config करें। इसके बाद, प्रत्येक चरण के लिए आउटपुट फ़ाइलों के लिए आउटपुट निर्देशिका को वर्गीकृत और जांचते समय चरण को निर्दिष्ट करते समय NM_analyze कॉन्फ़िगरेशन चरण को निर्दिष्ट करके किसी भी विश्लेषण चरण को चलाएं। NMe_template में, अपडेट को सही पर सेट करें और किसी भी इंडेक्स पर compare_structures_by करें।फिर टेम्पलेट फ़ाइल और संरचना तालिका सेट करें जो सेल गिनती और सेल प्रकार वर्गीकरण निर्दिष्ट करते समय मूल्यांकन करने के लिए सभी संभावित संरचना अनुक्रमणिका और संरचनाओं को निर्दिष्ट करता है। आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल और न्यूरोनल परत-विशिष्ट नाभिक मार्करों का उपयोग करके ऊतक समाशोधन के परिणामस्वरूप आइसोकॉर्टेक्स में ऊपरी और निचली परत न्यूरॉन्स के स्पष्ट रूप से परिभाषित सेल समूह थे। न्यूमोर्फ का उपयोग करके सेल गिनती तीव्रता समायोजन, चैनल संरेखण और सिलाई से जुड़े सफल प्रीप्रोसेसिंग चरणों पर निर्भर थी।हालांकि, प्रीप्रोसेसिंग चरणों में त्रुटियों के परिणामस्वरूप अनुचित सिलाई हो सकती है, जिससे अनुचित संरेखण और सिलाई हो सकती है, और इस प्रकार, इन-फोकस और आउट-ऑफ-फोकस पैटर्न के साथ छवियां बन सकती हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से नाभिक की गणना करने के लिए, सिले हुए चित्रों को एटलस का उपयोग करके एनोटेट किया जाएगा, जिससे मस्तिष्क क्षेत्रों पर एनोटेशन को ओवरलेड किया जा सकता है। नाभिक के केन्द्रक का पता न्यूमोर्फ में एक प्रशिक्षित 3 डी यू-नेट मॉडल के साथ लगाया गया था, जिसमें लगभग 12 मिलियन कुल नाभिक थे जो लगभग 2.6 मिलियन मस्तिष्क-दो-सकारात्मक और 1.6 मिलियन सीटीआईपी 2-पॉजिटिव नाभिक के साथ आइसोकॉर्टेक्स में टीओ-प्रो-3-पॉजिटिव थे।बेसल गैन्ग्लिया और हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स में क्रमशः लगभग 3.7 और 2.9 मिलियन टीओ-प्रो-3-पॉजिटिव कुल नाभिक का पता लगाया गया था। हालांकि, इन दो मस्तिष्क क्षेत्रों में पाए गए मस्तिष्क-दो-सकारात्मक कोशिकाएं नगण्य थीं, और बेसल गैन्ग्लिया और हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स में प्रत्येक में एक मिलियन से कम सीटीआईपी 2-पॉजिटिव कोशिकाओं में केवल 1.5 का पता चला था। अच्छे विभाजन को प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण के दौरान दृश्य गुणवत्ता जांच करें।और यह सुनिश्चित करने के लिए कोंडा वातावरण को ठीक से सेट करें कि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में कोई त्रुटि नहीं आई है। सेल गिनती के अलावा, यह पाइपलाइन अन्य विभाजन उपकरणों के साथ एकीकरण की अनुमति देती है जो सेल आकार और आकार को मापते हैं जिन्हें तब जीनोटाइप समूहों में तुलना की जा सकती है। हमारी पाइपलाइन के साथ, हम पहचान सकते हैं कि सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर मस्तिष्क शरीर रचना कैसे बदलती है, जिससे रोग के जोखिम के लिए महत्वपूर्ण सेल प्रकार और मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान होती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

एकाधिक माउस Neuroanatomical चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

कार्यात्मक न्यूरोइमेजिंग अल्ट्रासोनिक रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन और मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई का उपयोग

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Confocal लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे माउस दिमाग की माइक्रोन पैमाने संकल्प ऑप्टिकल टोमोग्राफी

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

मोटर Axon नेविगेशन और माउस के ठहराव में Axon Arborization के दृश्य प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग भ्रूण

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

ट्रांसक्रैनियल फंक्शनल अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके चूहों में पूरे मस्तिष्क 3डी एक्टिवेशन और कार्यात्मक कनेक्टिविटी मैपिंग

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

स्पष्टता ऊतक समाशोधन के माध्यम से बरकरार न्यूरोनल डेंड्राइट्स की इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

अक्षुण्ण माउस और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में गहरे ऊतक तीन फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

मेसोस्कोपिक से माइक्रोस्कोपिक तराजू तक न्यूरोनल इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...