Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

この作業は、NIH(R01MH121433、R01MH118349、およびR01MH120125からJLSおよびR01NS110791からGW)と財団の支援を受けました。サンプルイメージングを支援してくれた顕微鏡サービスラボのPablo Arielに感謝します。病理学および検査医学部門の顕微鏡サービスラボは、ノースカロライナ大学(UNC)ラインバーガー総合がんセンターへのがんセンターコアサポート助成金P30 CA016086によって部分的にサポートされています。神経科学顕微鏡コアは、助成金P30 NS045892によってサポートされています。この出版物で報告された研究は、ノースカロライナバイオテクノロジーセンターの制度的支援助成金2016-IDG-1016によって部分的にサポートされています。

すべてのマウスは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理使用委員会(IACUC)に従って使用され、承認されました。
1.マウスの解剖と灌流
注:以下の解剖は、注射器を使用してP4およびP14マウスで実施されました。灌流液の量は動物の年齢によって異なります。
<ol><li>灌 流 注意: パラホルムアルデヒド(PFA)は危険な化学物?...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

組織透明化法は、脳の3D細胞組織を測定するための有用な技術である。文献に記載されている多数の組織透明化方法があり、それぞれに利点と制限があります6、7、8、9。組織クリア画像内の細胞タイプを分析するための計算ツールの選択肢は比較的限られています。他の利用可能なツールは、セ?...

単一細胞分解能での全脳イメージングは、神経科学における重要な課題です。細胞解像度の脳画像は、脳回路の詳細な分析とシステムレベルのマッピングを可能にし、その回路が神経精神障害の遺伝的または環境的危険因子、発生中の胚の細胞挙動、および成人脳の神経回路によってどのように破壊されるかを可能にします1,2,3。再構築された3D脳の高解像度画像を可能にする複数の組織学的方法があります。しかしながら、これらの技術は、高価で特殊な装置を必要とし、免疫標識と互換性がない場合があり、そしていくつかの方法の2次元(2D)性質は、切片化中の組織損傷および剪断をもたらし得る4、5。
最近の進歩は、組織切片を必要としない脳全体を画像化するための代替アプローチを提供しました。それらは、脳を透明にするために組織クリアリングを使用することを含みます。ほとんどの組織透明化法では、光散乱の主要な光源である脂質を除去し、イメージング中に目的の屈折率(RI)をサンプル浸漬溶液のRIと一致させることによって、透明性が達成されます。その後、光は散乱されることなく材料間の境界を通過することができます6、7、8、9。
iDISCO+などの組織クリアリング法は、LSFM 6,7,10などの単一光子励起顕微鏡を用いた迅速な3Dイメージングと組み合わせることがよくあります。蛍光色素で標識した透明組織内で、光の薄い平面11で励起することにより光シート蛍光顕微鏡画像切片を画像化する。LSFMの主な利点は、一度に1つの光学セクションが照らされ、そのセクション内の分子からのすべての蛍光が励起され、光退色が最小限に抑えられることです。さらに、光学スライス全体を画像化することで、その励起スライスのカメラベースの検出が可能になり、ポイントスキャン12に対して速度が増加する。LSFMは、3D再構成に適した十分に登録された光学セクションを非破壊で生成します。
iDISCO+法は~3週間以内に安価な組織透明化を可能にしますが、プロトコル内の脱水ステップは、組織の収縮とサンプル形態の潜在的な変化につながる可能性があり、したがって体積測定に影響を与える可能性があります6,10。組織クリアリング手順の前に使用するMRIなどの二次イメージング法を追加すると、サンプル全体の組織クリアリング誘発収縮の程度を測定できます。脱水ステップでは、灰白質と白質の機械的特性の違いが脳物質の不均一な変形を引き起こし、野生型サンプルと変異型サンプルの間で異なる組織透明化誘発体積変形を引き起こし、これらのサンプルの体積差の解釈を混乱させる可能性があります10,13.MRIは、まず動物を造影剤(例えば、ガドリニウム)で灌流し、続いて、画像化14の前に、目的の抽出された組織を浸漬溶液(例えば、フォンブリン)中でインキュベートすることによって行われる。MRIは、同じサンプルで組織を透明化し、LSFMを実行することと互換性があります。
LSFMは、脳構造の定量的評価ではなく、目的の脳組織を定性的に視覚化するための大規模な顕微鏡画像を作成するためによく使用されます(図1)。定量的評価がなければ、遺伝的または環境的侮辱に起因する構造の違いを実証することは困難です。組織透明化およびイメージング技術が向上し、ストレージと計算能力のコストが削減されるにつれて、関心のある組織内の細胞タイプの局在を定量化することがよりアクセスしやすくなり、より多くの研究者がこれらのデータを研究に含めることができます。
マウスの脳内の1億個以上の細胞15と、テラバイトのデータを生成できる全脳イメージングセッションにより、細胞などの画像内の特徴を正確に定量化できる高度な画像解析ツールの需要が高まっています。核染色強度の閾値を適用し、事前定義された形状、サイズ、または密度10、16、17、18でオブジェクトをフィルタリングする、組織クリア画像には多数のセグメンテーション方法が存在します。ただし、結果の不正確な解釈は、セルサイズ、画像のコントラスト、標識強度などのパラメーターの変動から発生する可能性があります。この論文では、マウス脳内の細胞核を定量するための確立されたプロトコルについて説明します。まず、P4マウス脳の組織採取の手順を詳しく説明し、続いて、公開されているiDISCO+メソッド10から最適化された組織クリアリングおよび免疫標識プロトコルについて説明します。次に、MRIとライトシート顕微鏡を使用した画像取得について、画像のキャプチャに使用されるパラメーターを含めて説明します。最後に、組織クリアリング後の細胞種特異的定量、核マーカーによる免疫標識、アノテーション領域のライトシートイメージングを可能にする、当グループが開発した画像解析ツールのセットであるNuMorph19について説明し、デモンストレーションします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

組織透明化とそれに続くライトシート顕微鏡(LSFM)により、無傷の脳構造の細胞分解能イメージングが可能になり、遺伝的または環境的摂動によって引き起こされる構造変化の定量的分析が可能になります。全脳イメージングは、細胞のより正確な定量化と、物理的に切片化された組織の一般的に使用される顕微鏡では見逃される可能性のある領域特異的な違いの研究をもたらします。ライトシート顕微鏡を使用してクリアされた脳を画像化すると、共焦点顕微鏡と比較して取得速度が大幅に向上します。これらの画像は非常に大量の脳構造データを生成しますが、除去された組織の画像で特徴の定量化を実行するほとんどの計算ツールは、すべての核ではなく、まばらな細胞集団のカウントに限定されています。
ここでは、分析ツールのグループであるNuMorph(核ベースの形態測定)を示し、生後4日目(P4)マウスの脳のアノテーション領域内のすべての核および核マーカーを、ライトシート顕微鏡でクリアしてイメージングした後、定量化します。組織クリアの脱水ステップによって引き起こされる収縮前の脳容積を測定する磁気共鳴画像法(MRI)、免疫標識を含むiDISCO+法を使用した組織クリアリング、続いて市販のプラットフォームを使用してマウスの脳を細胞解像度で画像化するライトシート顕微鏡について説明します。次に、強度差の修正、画像タイルのステッチ、複数のチャネルの整列、核のカウント、公開されているアトラスへの登録による脳領域の注釈付けに使用されるNuMorphを使用したこの画像分析パイプラインを示します。
このアプローチは、公開されているプロトコルとソフトウェアを使用して設計され、必要な顕微鏡と計算リソースを持つすべての研究者がこれらの手法を実行できるようにしました。これらの組織クリアリング、イメージング、および計算ツールは、皮質内の細胞タイプの3次元(3D)組織の測定と定量化を可能にし、あらゆる野生型/ノックアウトマウス研究デザインに広く適用できるはずです。

iDISCO+プロトコルでは、目で簡単にわかる有意な組織収縮が発生するため(図2B)、組織透明化の前にこのパイプラインにMRIステップを追加して、組織透明化によって誘発される収縮を定量化しました。ワークフローは、MR画像から非脳組織を除去することから始まります(図2C)。次に、剛体変換(3つの並進角度と3つの回転角度)を適用して、MR画像をラ?...

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Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。

MRI、組織透明化、ライトシート顕微鏡を用いた無傷新生児マウス脳の全脳単一細胞イメージングと解析

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

マウスの脳内には約1億個の細胞があり、全脳の細胞解像度の画像サイズはテラバイト規模に近づいており、細胞を正確に定量化するには高度な画像解析ツールが必要です。私たちの計算パイプラインは、細胞検出の精度、イメージング時間、および計算リソースの間の合理的な妥協を維持しながら、画像を前処理し、マウス皮質内の核を定量することができます。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるフェリックス・キエールとイアン・カーティンです。まず、UltraMicroscope II顕微鏡の定格作動距離により、サンプルがz寸法の深さが5.2ミリメートル以下の方向になるように、サンプルを正しいサンプルサイズホルダーに取り付けます。次に、ホルダーのネジがクレードルのサポートに対して45度の角度になるように、ホルダーをサンプルクレードルに挿入します。次に、サンプルが光路に対して垂直に向けられる位置にクレードルを配置します。その後、顕微鏡のズーム本体を4倍以上の倍率に設定し、ピクセルあたり0.75マイクロメートルを生成します。「インスペクター Pro」ソフトウェアで、絞り値が約0.08のライトシートを1枚選択します。画像の幅に沿って軸方向の解像度を維持するには、「水平ダイナミックフォーカス」を選択し、レーザー波長に応じて推奨されるステップ数を適用します。次に、レジストレーションチャンネルに関して各チャンネルのファインフォーカスを調整し、チャンネルプロパティに関してチャンネルごとのレーザーパワーを調整します。次に、ライトシートの幅を約50%に調整して、シートパワーがサンプルサイズのY次元に最適に分散されるようにします。その後、サンプルのサイズに対してタイルの数をタイル間で 15% の推奨オーバーラップに設定し、特定のタイル位置でスタックごとに各チャネルの画像を順番にキャプチャします。まず、Linux 用の Conda 環境マネージャーと NuMorph 画像処理ツールをダウンロードしてインストールします。コマンドラインで、matlabを実行してNM_setupします。NuMorphからmを使用して、解析に必要な画像解析ソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします。次に、ファイル NM_samples.m を編集して、サンプル名、入力ディレクトリと出力ディレクトリ、チャンネル情報、およびライトシートイメージングパラメータを指定します。強度調整の場合、NMp_templateでは、新しい画像セットを操作するときに、調整を true に設定し、use_processed_imagesを false に設定します。次に、save_imagesとsave_samplesをtrueに設定します。次に、タイル シェーディングを Basic に設定して基本アルゴリズムを使用してシェーディング補正を適用するか、手動に設定して、特定のライト シート幅で UltraMicroscope II の測定値を使用してタイル シェーディング補正を適用します。画像チャンネルの配置については、NMp_template で channel_alignment を true に設定し、チャンネルalignment_methodを平行移動または伸縮性に設定します。次に、sift_refinementを true に設定し、オーバーラップ値を 0.15 に設定して、イメージング中のタイルのオーバーラップを一致させます。MATLAB で前処理手順を実行するには、サンプル名を指定し、構成を [プロセス サンプルNM_config] に設定します。次に、強度、整列、またはステッチを使用してステージを指定しながらNM_process構成ステッチを指定して前処理ステップを実行し、各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリを確認します。3D Atlas 画像と、各ボクセルを特定の構造に割り当てる関連する注釈画像から始めます。Atlas 画像と注釈ファイルの両方を位置合わせして、正しい方向に正しく一致するようにします。アライメント後、NuMorphでファイルを処理して、コマンドを実行して原稿に記載されている入力を指定します。NMa_template で、resample_imagesを true に設定し、アトラスと一致するように resample_resolution を設定します。次に、resample_channelsを使用してリサンプリングするチャンネル番号を指定します。その後、register_imagesをtrueに設定し、Atlasディレクトリ内のファイルと一致するatlas_fileを指定し、registration_parametersをデフォルトとして設定します。次に、save_registered_imagesを true に設定します。核の検出、細胞カウント、および分類では、count_nucleiとclassify_cellsの両方をtrueに設定します。次に、count_methodを3dunetに設定し、min_intensityして、検知されたオブジェクトの最小強度しきい値を定義します。次に、classify_methodを、重心位置での教師なし蛍光強度に基づく閾値、または教師あり線形サポートベクターマシン分類器をモデル化するSVMのいずれかに設定します。MATLAB で分析手順を実行するには、サンプル名を指定し、サンプルを分析するNM_configするように構成を設定します。次に、リサンプリング、レジスタ、カウント、または分類を使用してステージを指定しNM_analyzeながら、構成ステージを指定して任意の分析ステップを実行し、各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリーを確認します。NMe_template で、update を true に設定し、いずれかのインデックスに compare_structures_by を設定します。次に、細胞カウントと細胞タイプの分類を指定しながら、評価するすべての可能な構造インデックスと構造を指定するテンプレートファイルと構造テーブルを設定します。iDISCO+プロトコルと神経細胞層特異的核マーカーを用いた組織クリアリングにより、同皮質における上層ニューロンと下層ニューロンの細胞群が明確に定義されました。NuMorphを使用した細胞カウントは、強度調整、チャンネルアライメント、ステッチングを含む前処理ステップの成功に依存していました。ただし、前処理手順のエラーにより、スティッチングが不適切になり、位置合わせやスティッチングが不適切になり、画像の焦点が合ったり焦点が合ったり外れたりする可能性があります。特定の脳領域からの核をカウントするために、ステッチされた画像はアトラスを使用して注釈が付けられ、注釈を脳領域にオーバーレイできます。核の重心は、NuMorphのトレーニング済み3D U-Netモデルで検出され、約1,200万個の全核が同皮質でTO-PRO-3陽性であり、約260万個の脳2陽性核と160万個のCTIP2陽性核がありました。大脳基底核および海馬同皮質において、それぞれ約3.7および290万個のTO-PRO-3陽性全核が検出された。しかし、これら2つの脳領域で検出された脳2陽性細胞はごくわずかであり、大脳基底核と海馬同皮質でそれぞれ検出されたCTIP2陽性細胞は100万個未満で約1.5個にすぎませんでした。集録中に視覚的な品質チェックを実行して、適切なセグメンテーションを実現します。また、Conda 環境を適切に設定して、ダウンストリーム解析でエラーが発生しないようにします。細胞カウントに加えて、このパイプラインは、細胞のサイズと形状を測定し、遺伝子型グループ間で比較できる他のセグメンテーションツールとの統合を可能にします。私たちのパイプラインにより、脳の解剖学的構造が細胞の解像度でどのように変化するかを特定し、疾患リスクにとって重要な細胞の種類と脳領域を特定することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

経頭蓋機能超音波画像を用いたマウスにおける脳全体3D活性化と機能結合性マッピング

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

インタクトマウスおよびゼブラフィッシュ脳における深部組織3光子蛍光顕微鏡

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...