Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

이 작업은 NIH (R01MH121433, R01MH118349 및 R01MH120125에서 JLS로, R01NS110791에서 GW로)와 희망의 재단에 의해 지원되었습니다. 샘플 이미징을 지원해 주신 현미경 서비스 연구소의 Pablo Ariel에게 감사드립니다. 병리학 및 실험실 의학과의 현미경 서비스 실험실은 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC) Lineberger 종합 암 센터에 대한 암 센터 핵심 지원 보조금 P30 CA016086에 의해 부분적으로 지원됩니다. 신경 과학 현미경 코어는 보조금 P30 NS045892에 의해 지원됩니다. 이 간행물에보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 생명 공학 센터 기관 지원 보조금 2016-IDG-1016에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

모든 마우스는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 승인되었습니다.
1. 마우스 해부 및 관류
참고: 다음 해부는 주사기를 사용하여 P4 및 P14 마우스에서 수행되었습니다. 관류액의 양은 동물의 나이에 따라 다릅니다.
<ol><li>관류 주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA)는 위험한 화학 물질입?...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. 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M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. 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American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

조직 제거 방법은 뇌의 3D 세포 조직을 측정하는 데 유용한 기술입니다. 문헌에 기술된 다수의 조직 투명화 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계가 있다 6,7,8,9. 조직 투명 이미지에서 세포 유형을 분석하기 위한 계산 도구에 대한 옵션은 상대적으로 제한적입니다. 다른 이용가능한 도구들은 분할이 덜 ?...

단일 세포 분해능의 전체 뇌 영상은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 세포 해상도 뇌 이미지는 뇌 회로에 대한 상세한 분석 및 시스템 수준 매핑과 신경 정신 장애에 대한 유전 적 또는 환경 적 위험 요소, 발달중인 배아의 세포 행동 및 성인 뇌의 신경 회로 1,2,3에 의해 회로가 어떻게 파괴되는지를 허용합니다. 재구성 된 3D 뇌의 고해상도 이미지를 허용하는 여러 조직 학적 방법이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 값 비싸고 전문화 된 장비가 필요하며 면역 표지와 호환되지 않을 수 있으며 일부 방법의 2 차원 (2D) 특성으로 인해 절편 4,5 동안 조직 손상 및 전단이 발생할 수 있습니다.
최근의 발전은 조직 절편이 필요하지 않은 전체 뇌를 영상화하는 대안적인 접근 방식을 제공했습니다. 그들은 뇌를 투명하게 만들기 위해 조직 청소를 사용하는 것을 포함합니다. 대부분의 조직 투명화 방법에서 지질은 광산란의 주요 원인이기 때문에 지질을 제거하고 이미징 중에 물체의 굴절률(RI)을 샘플 액침 용액의 RI와 일치시킴으로써 달성됩니다. 빛은 산란되지 않고 물질 사이의 경계를 통과 할 수 있습니다 6,7,8,9.
iDISCO+와 같은 조직 투명화 방법은 종종 LSFM 6,7,10과 같은 단일 광자 여기 현미경을 사용하는 신속한 3D 이미징과 결합됩니다. 형광단으로 표지된 투명한 조직 내에서, 얇은 광면(11)을 사용한 여기(여기)에 의한 광시트 형광 현미경 이미지 절편. LSFM의 주요 장점은 한 번에 하나의 광학 섹션이 조명되고 해당 섹션 내의 분자에서 나오는 모든 형광이 여기되어 광퇴색을 최소화한다는 것입니다. 더욱이, 전체 광학 슬라이스를 이미징하는 것은 그 여기 슬라이스의 카메라 기반 검출을 가능하게 하여, 포인트 스캐닝(12)에 비해 속도를 증가시킨다. LSFM은 3D 재구성에 적합한 잘 등록된 광학 섹션을 비파괴적으로 생산합니다.
iDISCO+ 방법은 ~3주 이내에 저렴한 조직 청소를 가능하게 하지만, 프로토콜 내의 탈수 단계는 조직 수축 및 샘플 형태의 잠재적 변화로 이어질 수 있으므로 체적 측정에 영향을 미칠 수 있습니다6,10. 조직 투명화 절차 전에 사용되는 MRI와 같은 2차 이미징 방법을 추가하면 샘플 전체에 걸쳐 조직 투명화 유도 수축 정도를 측정할 수 있습니다. 탈수 단계에서 회백질과 백질 사이의 기계적 특성의 차이는 불균일한 뇌 물질 변형을 유발할 수 있으며, 이로 인해 야생형 샘플과 돌연변이 샘플 간에 서로 다른 조직 투명으로 인한 부피 변형이 발생할 수 있으며 이러한 샘플의 체적 차이에 대한 해석이 혼란스러울 수 있습니다.10,13 . MRI는 먼저 동물을 조영제(예를 들어, 가돌리늄)로 관류시킨 다음, 추출된 관심 조직을 이미징 전에 침지 용액(예를 들어, 폼블린)에서 인큐베이션함으로써 수행된다(14). MRI는 조직 투명화 및 동일한 샘플에서 LSFM 수행과 호환됩니다.
LSFM은 뇌 구조의 정량적 평가보다는 관심 있는 뇌 조직의 정성적 시각화를 위한 대규모 현미경 이미지를 생성하는 데 자주 사용됩니다(그림 1). 정량적 평가 없이는 유전 적 또는 환경 적 모욕으로 인한 구조적 차이를 입증하기가 어렵습니다. 조직 청소 및 이미징 기술이 향상되고 스토리지 및 컴퓨팅 성능 비용이 감소함에 따라 관심 조직 내에서 세포 유형 위치를 정량화하는 것이 더 쉬워지고 더 많은 연구자들이 이러한 데이터를 연구에 포함할 수 있게 되었습니다.
마우스 뇌(15) 내의 1억 개 이상의 세포와 테라바이트의 데이터를 생성할 수 있는 전뇌 이미징 세션으로 인해, 세포와 같은 이미지 내의 특징을 정확하게 정량화할 수 있는 고급 이미지 분석 도구에 대한 수요가 증가하고 있다. 핵 염색 강도에 대한 임계값을 적용하고 미리 정의된 모양, 크기 또는 밀도가10,16,17,18인 물체를 필터링하는 조직 투명 이미지에 대한 다양한 분할 방법이 있습니다. 그러나 결과의 부정확한 해석은 세포 크기, 이미지 대비 및 라벨링 강도와 같은 매개변수의 변화로 인해 발생할 수 있습니다. 이 논문은 마우스 뇌의 세포핵을 정량화하기 위해 확립 된 프로토콜을 설명합니다. 먼저, P4 마우스 뇌의 조직 수집을 위한 단계를 자세히 설명한 다음, 공개적으로 이용 가능한 iDISCO+ 방법(10)으로부터 최적화된 조직 투명화 및 면역표지 프로토콜이 뒤따른다. 둘째, 이미지 캡처에 사용되는 매개 변수를 포함하여 MRI 및 라이트 시트 현미경을 사용한 이미지 획득에 대해 설명합니다. 마지막으로, 조직 제거 후 세포 유형 특이적 정량화, 핵 마커를 사용한 면역 표지 및 주석이 달린 영역의 라이트 시트 이미징을 가능하게 하는 우리 그룹이 개발한 이미지 분석 도구 세트인 NuMorph19를 설명하고 시연합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

조직 투명화 후 라이트 시트 현미경(LSFM)을 통해 온전한 뇌 구조의 세포 분해능 이미징이 가능하여 유전적 또는 환경적 섭동으로 인한 구조적 변화를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 전뇌 영상은 세포의 보다 정확한 정량화와 물리적으로 절단된 조직의 일반적으로 사용되는 현미경으로는 놓칠 수 있는 영역별 차이에 대한 연구를 가능하게 합니다. 라이트 시트 현미경을 사용하여 맑은 뇌를 이미지화하면 컨포칼 현미경에 비해 획득 속도가 크게 향상됩니다. 이러한 이미지는 매우 많은 양의 뇌 구조 데이터를 생성하지만 제거 된 조직의 이미지에서 특징 정량화를 수행하는 대부분의 계산 도구는 모든 핵이 아닌 희소 세포 집단을 계산하는 것으로 제한됩니다.
여기에서는 분석 도구 그룹인 NuMorph(핵 기반 형태 측정법)를 시연하여 라이트 시트 현미경으로 투명화 및 이미징한 후 출생 후 4일차(P4) 마우스 뇌의 주석이 달린 영역 내의 모든 핵과 핵 마커를 정량화합니다. 조직 제거 탈수 단계로 인한 수축 전에 뇌 부피를 측정하는 자기 공명 영상 (MRI), 면역 표지를 포함한 iDISCO + 방법을 사용한 조직 청소, 상용 플랫폼을 사용하여 세포 해상도로 마우스 뇌를 이미지화하는 라이트 시트 현미경에 대해 설명합니다. 그런 다음 강도 차이를 수정하고, 이미지 타일을 연결하고, 여러 채널을 정렬하고, 핵을 계산하고, 공개적으로 사용 가능한 지도책에 등록을 통해 뇌 영역에 주석을 추가하는 데 사용되는 NuMorph를 사용하여 이 이미지 분석 파이프라인을 시연합니다.
우리는 공개적으로 사용 가능한 프로토콜과 소프트웨어를 사용하여 이 접근 방식을 설계하여 필요한 현미경과 계산 리소스를 가진 모든 연구원이 이러한 기술을 수행할 수 있도록 했습니다. 이러한 조직 청소, 이미징 및 계산 도구를 사용하면 피질에서 세포 유형의 3차원(3D) 조직을 측정하고 정량화할 수 있으며 모든 야생형/녹아웃 마우스 연구 설계에 널리 적용할 수 있어야 합니다.

iDISCO+ 프로토콜은 눈으로 쉽게 알아볼 수 있는 상당한 조직 수축을 도입하므로(그림 2B), 조직 투명화로 인한 수축을 정량화하기 위해 조직 제거 전에 이 파이프라인에 MRI 단계를 추가했습니다. 워크플로우는 MR 이미지에서 뇌가 아닌 조직을 제거하는 것으로 시작됩니다(그림 2C). 다음으로, 강체 변환(3개의 평행 이동 및 3개의 회전 각도)을 적용하여 MR ?...

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Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

쥐의 뇌에 있는 약 1억 개의 세포와 테라바이트 규모에 육박하는 전체 뇌 세포 해상도 이미지의 크기로 인해 세포를 정확하게 정량화하려면 고급 이미지 분석 도구가 필요합니다. 당사의 전산 파이프라인은 이미지를 전처리하고 마우스 피질 내의 핵을 정량화하는 동시에 세포 검출 정확도, 이미징 시간 및 계산 리소스 간의 합리적인 절충안을 유지할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Felix Kyere와 Ian Curtin이 될 것입니다.시작하려면 UltraMicroscope II 현미경의 정격 작동 거리로 인해 샘플이 z 치수의 깊이가 5.2mm 이하가 되도록 올바른 샘플 크기 홀더에 샘플을 장착하십시오. 그런 다음 홀더의 나사가 크래들의 지지대와 45도 각도가 되도록 홀더를 샘플 크래들에 삽입합니다. 다음으로, 샘플이 광 경로에 수직으로 향하도록 크래들을 배치합니다.그런 다음 현미경의 줌 바디를 4x 배율 이상으로 설정하여 픽셀당 0.75마이크로미터를 생성합니다. Inspector Pro 소프트웨어에서 개구수 값이 약 0.08인 단일 라이트 시트를 선택합니다. 축 해상도가 이미지 너비를 따라 유지되도록 하려면 수평 동적 초점을 선택하고 레이저 파장에 따라 권장되는 단계 수를 적용합니다.그런 다음 등록 채널에 대하여 각 채널에 대한 미세 초점을 조정하고 채널 특성에 대하여 채널당 레이저 파워를 조정합니다. 다음으로, 라이트 시트 너비를 약 50%로 조정하여 시트 전력이 샘플 크기에 맞는 y 치수에 최적으로 분배되도록 합니다. 그런 다음 샘플 크기에 따라 타일 수를 타일 간 권장 겹침 15%로 설정하고 지정된 타일 위치에서 각 스택에 대해 각 채널에 대한 이미지를 순차적으로 캡처합니다.먼저 Linux 및 NuMorph 이미지 처리 도구용 Conda 환경 관리자를 다운로드하여 설치합니다. 명령줄에서 matlab을 실행하고 NM_setup. NuMorph에서 분석에 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다.그런 다음 NM_samples.m 파일을 편집하여 샘플 이름, 입력 및 출력 디렉토리, 채널 정보 및 라이트 시트 이미징 파라미터를 지정합니다. 강도 조정의 경우 NMp_template 새 이미지 세트로 작업할 때 강렬한 조정을 true로 설정하고 use_processed_images false로 설정합니다. 다음으로 save_images 및 save_samples true로 설정합니다.그런 다음 타일 음영을 기본으로 설정하여 기본 알고리즘을 사용하여 음영 보정을 적용하거나 수동으로 설정하여 특정 라이트 시트 너비에서 UltraMicroscope II의 측정값을 사용하여 타일 음영 보정을 적용합니다. 이미지 채널 정렬의 경우 NMp_template에서 channel_alignment true로 설정하고 채널 alignment_method 변환 또는 탄성체로 설정합니다. 그런 다음 sift_refinement true로 설정하고 겹침 값을 0.15로 설정하여 이미징 중 타일 겹침과 일치시킵니다.MATLAB에서 전처리 단계를 실행하려면 샘플 이름을 지정하고 구성을 샘플 처리NM_config로 설정하십시오. 그런 다음 강도, 정렬 또는 스티치를 사용하여 스테이지를 지정하는 동안 NM_process구성 스티치를 지정하여 전처리 단계를 실행하고 출력 디렉터리에서 각 스테이지의 출력 파일을 확인합니다. 3D Atlas 이미지 및 각 복셀을 특정 구조에 할당하는 관련 주석 이미지로 시작합니다.Atlas 이미지와 주석 파일을 모두 정렬하여 올바른 방향으로 올바르게 일치하는지 확인합니다. 정렬 후 NuMorph에서 파일을 처리하여 명령을 실행하여 원고에 설명된 대로 입력을 지정합니다. NMa_template에서는 resample_images true로 설정하고 resample_resolution Atlas와 일치하도록 설정합니다.그런 다음 resample_channels를 사용하여 리샘플링할 채널 번호를 지정합니다. 그런 다음 register_images true로 설정하고 Atlas 디렉터리의 파일과 일치하도록 atlas_file 지정한 다음 기본값으로 registration_parameters 설정합니다. 그런 다음 save_registered_images true로 설정합니다.핵 검출, 세포 계수 및 분류의 경우 count_nuclei과 classify_cells 모두 true로 설정합니다. 그런 다음 count_method 3dunet으로 설정하고 min_intensity하여 감지된 객체에 대한 최소 강도 임계값을 정의합니다. 다음으로, classify_method 중심 위치에서 비지도 형광 강도를 기반으로 하는 임계값 또는 감독된 선형 서포트 벡터 머신 분류기를 모델링하는 SVM으로 설정합니다.MATLAB에서 분석 단계를 수행하려면 샘플 이름을 지정하고 구성을 NM_config 분석 샘플로 설정하십시오. 그런 다음 리샘플링, 레지스터, 카운트 또는 분류를 사용하여 단계를 지정하는 동안 NM_analyze구성 단계를 지정하여 분석 단계를 실행하고 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다. NMe_template에서 업데이트를 true로 설정하고 compare_structures_by 인덱스 중 하나로 설정합니다.그런 다음 셀 계수 및 셀 유형 분류를 지정하는 동안 평가할 가능한 모든 구조 인덱스 및 구조를 지정하는 템플릿 파일 및 구조 테이블을 설정합니다. iDISCO+프로토콜과 뉴런 층 특이적 핵 마커를 사용한 조직 청소는 등피질에서 상층 및 하층 뉴런의 명확하게 정의된 세포 그룹을 생성했습니다. NuMorph를 사용한 세포 계수는 강도 조정, 채널 정렬 및 스티칭과 관련된 성공적인 전처리 단계에 따라 달라졌습니다.그러나 전처리 단계에서 오류가 발생하면 부적절한 스티칭이 발생하여 정렬 및 스티칭이 잘못되어 초점이 맞지 않고 초점이 맞지 않는 패턴이 이미지가 생성될 수 있습니다. 특정 뇌 영역의 핵을 계산하기 위해 스티칭된 이미지에 Atlas를 사용하여 주석을 달아 뇌 영역에 주석을 겹칠 수 있습니다. 핵의 중심은 약 260만 개의 뇌-2-양성 핵과 160만 개의 CTIP2 양성 핵이 있는 등피질에서 TO-PRO-3 양성인 약 1,200만 개의 총 핵이 있는 NuMorph에서 훈련된 3D U-Net 모델로 감지되었습니다.기저핵 및 해마 동종 피질에서 각각 약 3.7 및 290 만 개의 TO-PRO-3 양성 총 핵이 검출되었다. 그러나이 두 뇌 영역에서 검출 된 뇌 2 양성 세포는 무시할 수 있었으며 기저핵과 해마 allocortex에서 각각 백만 개 미만의 CTIP2 양성 세포에서 약 1.5 개만 검출되었습니다. 획득 중에 시각적 품질 검사를 수행하여 우수한 세분화를 달성합니다.또한 다운스트림 분석에서 오류가 발생하지 않도록 Conda 환경을 올바르게 설정합니다. 세포 계수 외에도 이 파이프라인을 사용하면 세포 크기와 모양을 측정하는 다른 분할 도구와 통합하여 유전자형 그룹 간에 비교할 수 있습니다. 우리의 파이프라인을 통해 우리는 세포 분해능에서 뇌 해부학이 어떻게 변하는지 식별할 수 있으며, 이는 질병 위험에 중요한 세포 유형과 뇌 영역을 식별하는 데 도움이 됩니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

경두개 기능 적 초음파 이미징을 사용하여 마우스의 전신 뇌 3D 활성화 및 기능 적 연결 매핑

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...