Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH (R01MH121433, R01MH118349 и R01MH120125 для JLS и R01NS110791 для GW) и Фондом надежды. Мы благодарим Пабло Ариэля из Лаборатории микроскопических услуг за помощь в визуализации образцов. Лаборатория услуг микроскопии в отделении патологии и лабораторной медицины частично поддерживается грантом первичной поддержки Онкологического центра P30 CA016086 Университету Северной Каролины (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Ядро нейробиологической микроскопии поддерживается грантом P30 NS045892. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было частично поддержано грантом институциональной поддержки Биотехнологического центра Северной Каролины 2016-IDG-1016.

Все мыши использовались в соответствии с и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.
1. Рассечение и перфузия мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие вскрытия были выполнен...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+system:+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy.">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li><li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism.">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSL.">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li><li>. iDISCO method Available from: <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022)</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide.">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).</li><li>. Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022)</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836 (2017).</li><li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

Методы очистки тканей являются полезными методами измерения 3D-клеточной организации мозга. Существует множество методов очистки тканей, описанных в литературе, каждый со своими преимуществами и ограничениями 6,7,8,9....

Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге 1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; однако эти методы требуют дорогостоящего специализированного оборудования, могут быть несовместимы с иммуномаркировкой, а двумерный (2D) характер некоторых методов может привести к повреждению тканей и сдвигу во время сечения 4,5.
Последние достижения обеспечили альтернативный подход к визуализации всего мозга, который не требует разрезания тканей; они включают в себя использование очистки тканей, чтобы сделать мозг прозрачным. Прозрачность достигается в большинстве методов очистки тканей как путем удаления липидов, поскольку они являются основным источником рассеяния света, так и путем сопоставления показателя преломления (RI) объекта с RI раствора погружения образца во время визуализации. Затем свет может проходить через границу между материалами, не рассеиваясь 6,7,8,9.
Методы очистки тканей, такие как iDISCO+, часто сочетаются с быстрой 3D-визуализацией с использованием однофотонной микроскопии возбуждения, такой как LSFM 6,7,10. Внутри прозрачных тканей, меченных флуорофором, светоплотная флуоресцентная микроскопия рисует участки путем возбуждения тонкой плоскостью света11. Основным преимуществом LSFM является то, что одна оптическая секция освещается за один раз, при этом вся флуоресценция от молекул в этой секции возбуждается, что сводит к минимуму фотоотбеливание. Кроме того, визуализация всего оптического среза позволяет обнаруживать этот возбужденный срез на основе камеры, увеличивая скорость по сравнению с точечным сканированием12. LSFM неразрушающе производит хорошо зарегистрированные оптические секции, которые подходят для 3D-реконструкции.
В то время как метод iDISCO+ позволяет провести недорогую очистку тканей в течение ~ 3 недель, этапы обезвоживания в рамках протокола могут привести к усадке ткани и потенциальному изменению морфологии образца, что влияет на объемные измерения 6,10. Добавление вторичного метода визуализации, такого как МРТ, который будет использоваться до процедуры очистки тканей, может измерить степень усадки, вызванной очисткой тканей, по всему образцу. На этапах обезвоживания различия в механических свойствах между серым и белым веществом могут привести к неоднородным деформациям мозгового вещества, что приводит к неоднородным объемным деформациям, вызванным очисткой тканей, между образцами дикого типа и мутантами и может сбивать с толку интерпретации объемных различий в этих образцах10,13 . МРТ выполняют путем сначала перфузии животного контрастным веществом (например, гадолинием), а затем инкубированием интересующей ткани в иммерсионном растворе (например, фомблине) перед визуализацией14. МРТ совместима с очисткой тканей и выполнением LSFM на одном образце.
LSFM часто используется для создания крупномасштабных микроскопических изображений для качественной визуализации интересующей ткани мозга, а не количественной оценки структуры мозга (рисунок 1). Без количественной оценки трудно продемонстрировать структурные различия, возникающие в результате генетических или экологических нарушений. По мере совершенствования технологий очистки тканей и визуализации, наряду с уменьшением затрат на хранение и вычислительную мощность, количественная оценка локализаций клеточного типа в интересующей ткани становится все более доступной, что позволяет большему количеству исследователей включать эти данные в свои исследования.
С более чем 100 миллионами клеток в мозге мыши15 и сеансами визуализации всего мозга, которые могут генерировать терабайты данных, существует повышенный спрос на передовые инструменты анализа изображений, которые позволяют точно количественно оценивать особенности в изображениях, такие как клетки. Существует множество методов сегментации для изображений, очищенных тканью, которые применяют пороговое значение для интенсивности ядерного окрашивания и фильтруют объекты с предопределенными формами, размерами или плотностями 10,16,17,18. Однако неточные интерпретации результатов могут возникать из-за различий в таких параметрах, как размер ячейки, контрастность изображения и интенсивность маркировки. В этой статье описывается наш установленный протокол для количественной оценки клеточных ядер в мозге мыши. Во-первых, мы подробно описываем шаги по сбору тканей мозга мыши P4, за которыми следует протокол очистки и иммуномаркировки тканей, оптимизированный из общедоступного метода iDISCO+10. Во-вторых, мы описываем получение изображений с помощью МРТ и световой микроскопии, включая параметры, используемые для захвата изображений. Наконец, мы описываем и демонстрируем NuMorph19, набор инструментов анализа изображений, разработанных нашей группой, которые позволяют количественно определять специфический клеточный тип после очистки тканей, иммуномаркировку ядерными маркерами и визуализацию аннотированных областей на световых листах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.
Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.
Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.

Поскольку протокол iDISCO+ вводит значительную усадку тканей, которая легко заметна на глаз (рисунок 2B), мы добавили этап МРТ в этот конвейер перед очисткой ткани, чтобы количественно оценить усадку, вызванную очисткой ткани. Рабочий процесс начинается с удаления немозгово...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

С около 100 миллионами клеток в мозге мыши и размерами изображений клеточного разрешения всего мозга, приближающихся к терабайтной шкале, для точной количественной оценки клеток необходимы передовые инструменты анализа изображений. Наш вычислительный конвейер может предварительно обрабатывать изображения и количественно оценивать ядра в коре головного мозга мыши, сохраняя при этом разумный компромисс между точностью обнаружения клеток, временем визуализации и вычислительными ресурсами. Демонстрировать процедуру будут Феликс Кайер и Ян Кертин, аспиранты из моей лаборатории.Для начала установите образец в держатель правильного размера образца таким образом, чтобы образец был ориентирован с z-размерностью не более 5,2 миллиметра в глубину из-за номинального рабочего расстояния микроскопа UltraMicroscope II. Затем вставьте держатель в колыбель образца таким образом, чтобы винт держателя находился под углом 45 градусов к опорам люльки. Затем поместите люльку в такое положение, чтобы образец был ориентирован перпендикулярно световому пути.После этого установите масштаб на микроскопе на 4-кратное увеличение или выше, что дает 0,75 микрометра на пиксель. В программном обеспечении Inspector Pro выберите один световой лист с числовым значением диафрагмы приблизительно 0,08. Чтобы обеспечить поддержание осевого разрешения по ширине изображения, выберите «Горизонтальная динамическая фокусировка» и примените рекомендуемое количество шагов в зависимости от длины волны лазера.Затем отрегулируйте тонкую фокусировку для каждого канала по отношению к каналу регистрации и мощность лазера на канал по отношению к свойствам канала. Затем отрегулируйте ширину светового листа примерно до 50%, чтобы обеспечить оптимальное распределение мощности листа в измерении Y для размера образца. После этого установите количество плиток по отношению к размеру образца с рекомендуемым перекрытием 15% между плитками и захватите изображения для каждого канала последовательно для каждого стека в заданном положении плитки.Сначала загрузите и установите диспетчер среды Conda для Linux и инструментов обработки изображений NuMorph. В командной строке запустите matlab и NM_setup. m от NuMorph для загрузки и установки пакетов программного обеспечения для анализа изображений, необходимых для анализа.Затем укажите имена образцов, входные и выходные каталоги, информацию о каналах и параметры изображения светового листа, отредактировав файл NM_samples.m. Для регулировки интенсивности в NMp_template установите интенсивную настройку на true, а use_processed_images как false при работе с новым набором изображений. Затем установите save_images и save_samples как истинное.Затем установите базовое затенение плитки, чтобы применить коррекцию затенения с помощью базового алгоритма, или вручную, чтобы применить коррекцию затенения плитки с помощью измерений из UltraMicroscope II при определенной ширине светового листа. Для выравнивания канала изображения в NMp_template задайте для channel_alignment значение true, а для alignment_method канала — трансляцию или эластичность. Затем установите значение sift_refinement true и значение перекрытия 0,15, чтобы соответствовать перекрытиям плиток во время создания изображения.Чтобы выполнить шаги предварительной обработки в MATLAB, укажите имя образца и задайте для конфигурации NM_config пример процесса. Затем выполните любой из шагов предварительной обработки, указав NM_process стежка конфигурации, указав этап с использованием интенсивности, выравнивания или сшивания, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. Начните с 3D-изображения Атласа и связанного с ним изображения аннотации, которое присваивает каждый воксель определенной структуре.Выровняйте изображение Атласа и файл аннотации, чтобы убедиться, что они правильно совпадают в правильной ориентации. После выравнивания обработайте файлы в NuMorph, чтобы указать входные данные, как описано в рукописи, выполнив команду. В NMa_template установите для resample_images значение true и resample_resolution в соответствии с Atlas.Затем укажите номер канала для ресамплинга с помощью resample_channels. После этого установите для register_images значение true, укажите atlas_file, соответствующий файлу в каталоге Atlas, и установите registration_parameters по умолчанию. Затем установите для save_registered_images значение true.Для обнаружения ядер, подсчета клеток и классификации установите как count_nuclei, так и classify_cells как истинные. Затем установите для count_method значение 3dunet и min_intensity, чтобы определить минимальный порог интенсивности для обнаруженных объектов. Затем установите classify_method либо порога, который основан на неконтролируемой интенсивности флуоресценции в центроидных положениях, либо SVM, который моделирует контролируемый линейный классификатор опорных векторов машины.Чтобы выполнить шаги анализа в MATLAB, укажите имя образца и задайте конфигурацию NM_config анализа образца. Затем выполните любой из шагов анализа, указав NM_analyze этап конфигурации, указав этап с помощью ресамплинга, регистрации, подсчета или классификации, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. В NMe_template установите для параметра update значение true и compare_structures_by для любого индекса.Затем задайте файл шаблона и таблицу структур, которая определяет все возможные структурные индексы и структуры для оценки при указании подсчета ячеек и классификации типов ячеек. Очистка тканей с использованием протокола iDISCO+ и нейронально-слой-специфических маркеров ядер привела к четко определенным клеточным группам нейронов верхнего и нижнего слоя в изокортексе. Подсчет клеток с помощью NuMorph зависел от успешных этапов предварительной обработки, включая регулировку интенсивности, выравнивание каналов и сшивание.Однако ошибки на этапах предварительной обработки могут привести к неправильному сшиванию, что приведет к неправильному выравниванию и сшиванию и, таким образом, приведет к изображениям с рисунком в фокусе и вне фокуса. Чтобы подсчитать ядра из определенных областей мозга, сшитые изображения будут аннотированы с помощью Atlas, что позволит накладывать аннотации на области мозга. Центроиды ядер были обнаружены с помощью обученной 3D-модели U-Net в NuMorph с около 12 миллионами общих ядер, которые были TO-PRO-3-положительными в изокортексе с примерно 2,6 миллионами мозг-двухположительных и 1,6 миллионами CTIP2-положительных ядер.Было обнаружено около 3,7 и 2,9 млн TO-PRO-3-положительных суммарных ядер в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа соответственно. Тем не менее, два положительных клетки мозга, обнаруженные в этих двух областях мозга, были незначительными, и только около 1,5 из менее чем одного миллиона CTIP2-положительных клеток были обнаружены в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа. Выполняйте визуальные проверки качества во время приобретения, чтобы добиться хорошей сегментации.И правильно настроить среду Conda, чтобы гарантировать, что при последующем анализе не возникает ошибок. В дополнение к подсчету клеток, этот конвейер позволяет интегрироваться с другими инструментами сегментации, которые измеряют размер и форму клеток, которые затем можно сравнивать по группам генотипов. С помощью нашего конвейера мы можем определить, как анатомия мозга изменяется при клеточном разрешении, что приводит к идентификации типов клеток и областей мозга, важных для риска заболевания.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Несколько мыши нейроанатомической Магнитно-резонансная томография

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

3D-активация всего мозга и картирование функциональной связности у мышей с использованием транскраниальной функциональной ультразвуковой визуализации

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Визуализация и количественная оценка интактных нейрональных дендритов с помощью очистки тканей CLARITY

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Глубокотканная трехфотонная флуоресцентная микроскопия в интактном мозге мышей и рыбок данио

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...