Name: whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma NIH (R01MH121433, R01MH118349 ve R01MH120125 JLS'ye ve R01NS110791'den GW'ye) ve Umut Vakfı tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı'ndan Pablo Ariel'e örnek görüntülemeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı'ndaki Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı, kısmen Kuzey Carolina Üniversitesi (UNC) Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'ne Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibe P30 CA016086 tarafından desteklenmektedir. Nörobilim Mikroskopi Çekirdeği, hibe P30 NS045892 tarafından desteklenmektedir. Bu yayında bildirilen araştırmalar kısmen Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi Kurumsal Destek Hibe 2016-IDG-1016 tarafından desteklenmiştir.

Tüm fareler, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak kullanılmış ve onaylanmıştır.
1. Fare diseksiyonu ve perfüzyonu
NOT: Aşağıdaki diseksiyonlar P4 ve P14 farelerde bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Perfüzyon sıvısının hacmi, hayvanın yaşına bağlı olarak değişecektir.
<ol><li>Perfüzyon DİKKAT: Paraformaldehit (PFA) te...

<ol>
	<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>H&#228;gerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+system:+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy.">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li><li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism.">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation.">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li><li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology.">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li><li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains.">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>F&#252;rth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution.">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li><li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudReg:+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration.">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li><li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMorph:+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images.">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).</li><li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer's+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging.">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li><li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSL.">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li><li>. iDISCO method Available from: <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022)</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide.">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).</li><li>. Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022)</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836 (2017).</li><li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elastix:+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration.">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li><li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sift-the+scale+invariant+feature+transform.">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper.">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Vel&#237;&#353;ek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+(Light)+sheet+after+the+iDISCO.">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li><li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain.">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li><li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping.">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains.">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li><li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images.">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).</li><li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem.">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework:+A+3D+reference+atlas.">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li><li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentor:+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations.">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li></ol>

Doku temizleme yöntemleri, beynin 3D hücresel organizasyonunu ölçmek için yararlı tekniklerdir. Literatürde tanımlanan ve her biri avantajları ve sınırlamaları olan bir dizi doku temizleme yöntemi vardır 6,7,8,9. Doku temizlenmiş görüntülerdeki hücre tiplerini analiz etmek için hesaplama araçlarının seçenekleri nispeten sınırlıdır. Segmentasyonun daha az zor olduğu ...

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir 1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, özel ekipman gerektirir, immünoetiketleme ile uyumlu olmayabilir ve bazı yöntemlerin iki boyutlu (2D) doğası, 4,5 kesiti sırasında doku hasarına ve kesmeye neden olabilir.
Son gelişmeler, doku kesiti gerektirmeyen tüm beyinleri görüntülemek için alternatif bir yaklaşım sağlamıştır; beyinleri şeffaf hale getirmek için doku temizlemeyi kullanmayı içerirler. Çoğu doku temizleme yönteminde şeffaflık, hem ışık saçılmasının önemli bir kaynağı oldukları için lipitlerin çıkarılması hem de görüntüleme sırasında nesnenin kırılma indisinin (RI) numune daldırma çözeltisinin RI ile eşleştirilmesi ile sağlanır. Işık daha sonradağılmadan malzemeler arasındaki sınırdan geçebilir 6,7,8,9.
İDISCO+ gibi doku temizleme yöntemleri genellikle LSFM 6,7,10 gibi tek foton uyarma mikroskobu kullanılarak hızlı 3D görüntüleme ile birleştirilir. Florofor ile etiketlenmiş şeffaf dokular içinde, ışık tabakası floresan mikroskopi, ince bir ışık düzlemi ile uyarılarak bölümlerhalinde görüntülenir 11. LSFM'nin temel avantajı, bir seferde tek bir optik bölümün aydınlatılması, bu bölümdeki moleküllerden gelen tüm floresanların uyarılması ve bu da fotobeyazlatmayı en aza indirmesidir. Dahası, tüm optik dilimin görüntülenmesi, bu heyecanlı dilimin kamera tabanlı algılanmasını sağlayarak nokta tarama12'ye göre hızı artırır. LSFM, tahribatsız bir şekilde, 3D rekonstrüksiyon için uygun olan iyi kaydedilmiş optik bölümler üretir.
iDISCO + yöntemi ~ 3 hafta içinde ucuz doku temizlemeye izin verirken, protokoldeki dehidrasyon adımları doku büzülmesine ve numune morfolojisinin potansiyel olarak değişmesine neden olabilir, böylece hacimsel ölçümleri etkileyebilir 6,10. Doku temizleme prosedüründen önce kullanılacak MRI gibi ikincil bir görüntüleme yönteminin eklenmesi, numune boyunca doku temizlemeye bağlı büzülme derecesini ölçebilir. Dehidrasyon aşamaları sırasında, gri ve beyaz cevher arasındaki mekanik özelliklerdeki farklılıklar, düzgün olmayan beyin maddesi deformasyonlarına yol açabilir, bu da vahşi tip ve mutant numuneler arasında farklı doku temizlemeye bağlı hacim deformasyonlarına neden olabilir ve bu numunelerdeki hacimsel farklılıkların yorumlarını karıştırabilir10,13 . MRG, ilk önce hayvanı bir kontrast madde (örneğin, gadolinyum) ile perfüze ederek, ardından görüntüleme14'ten önce ekstrakte edilen dokuyu bir daldırma çözeltisinde (örneğin, fomblin) inkübe ederek gerçekleştirilir. MRG, doku temizleme ve aynı numune üzerinde LSFM yapılması ile uyumludur.
LSFM genellikle beyin yapısının nicel olarak değerlendirilmesinden ziyade, ilgilenilen beyin dokusunun kalitatif görselleştirmesi için büyük ölçekli mikroskopi görüntüleri oluşturmak için kullanılır (Şekil 1). Nicel değerlendirme olmadan, genetik veya çevresel hakaretlerden kaynaklanan yapısal farklılıkları göstermek zordur. Doku temizleme ve görüntüleme teknolojileri geliştikçe, depolama ve hesaplama gücünün maliyetlerinin azalmasıyla birlikte, ilgilenilen doku içindeki hücre tipi lokalizasyonlarını ölçmek daha erişilebilir hale geliyor ve daha fazla araştırmacının bu verileri çalışmalarına dahil etmesine izin veriyor.
Fare beynindeki 100 milyondan fazla hücre15 ve terabaytlarca veri üretebilen tüm beyin görüntüleme oturumlarıyla, hücreler gibi görüntülerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan gelişmiş görüntü analiz araçlarına olan talep artmaktadır. Nükleer boyama yoğunluğu için eşik uygulayan ve önceden tanımlanmış şekil, boyut veya yoğunluklara sahip nesneleri filtreleyen doku temizlenmiş görüntüler için bir dizi segmentasyon yöntemi mevcuttur10,16,17,18. Bununla birlikte, sonuçların yanlış yorumlanması, hücre boyutu, görüntü kontrastı ve etiketleme yoğunluğu gibi parametrelerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu makale, fare beynindeki hücre çekirdeklerini ölçmek için kurulan protokolümüzü açıklamaktadır. İlk olarak, P4 fare beyninin doku toplanması için adımları detaylandırıyoruz, ardından halka açık iDISCO+ yöntem10'dan optimize edilmiş bir doku temizleme ve immünoetiketleme protokolü izliyoruz. İkincisi, görüntü yakalama için kullanılan parametreler de dahil olmak üzere MRI ve ışık tabakası mikroskobu kullanarak görüntü yakalamayı açıklıyoruz. Son olarak, grubumuzun geliştirdiği, doku temizleme, nükleer belirteçlerle immünoetiketleme ve açıklamalı bölgelerin ışık tabakası görüntülemesinden sonra hücre tipine özgü nicelleştirmeye izin veren bir dizi görüntü analiz aracı olan NuMorph19'u tanımlıyoruz ve gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner</td>
			<td>Bruker Biospec</td>
			<td></td>
			<td>Horizontal Bore Animal MRI System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>ICN19605590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVO 860 4TB external SSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin Y</td>
			<td>Speciality Fluids Company</td>
			<td>YL-VAC-25-6</td>
			<td>perfluoropolyether lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent (ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gadolinium contrast agent(ProHance)</td>
			<td>Bracco Diagnostics</td>
			<td>0270-1111-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td>
			<td>EVGA</td>
			<td>08G-P4-6286-KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector Pro</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Microscope image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK Snap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>segmentation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Dissolved in 1x PBS to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Diluted to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Dissolved in H2O to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergitol type NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NP40S-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>BP337 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope II Light Sheet Microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeon Processor E5-2690 v4</td>
			<td>Intel</td>
			<td>E5-2690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Complementary metal oxide semiconductor camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11369</td>
			<td>(1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>(1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-Ctip2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Brn2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12137</td>
			<td>(1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To-Pro 3 (TP3)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>(1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain single-cell imaging and analysis of intact neonatal mouse brains using mri, tissue clearing, and light-sheet microscopy

Doku temizlemenin ardından ışık tabakası mikroskobu (LSFM), bozulmamış beyin yapısının hücresel çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu yapısal değişikliklerin nicel analizine izin verir. Tüm beyin görüntülemesi, hücrelerin daha doğru bir şekilde ölçülmesi ve fiziksel olarak kesitlenmiş dokunun yaygın olarak kullanılan mikroskopisi ile gözden kaçırılabilecek bölgeye özgü farklılıkların incelenmesi ile sonuçlanır. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için ışık tabakası mikroskobu kullanmak, konfokal mikroskopiye kıyasla edinme hızını büyük ölçüde artırır. Bu görüntüler çok büyük miktarlarda beyin yapısal verisi üretmesine rağmen, temizlenmiş doku görüntülerinde özellik ölçümü yapan çoğu hesaplama aracı, tüm çekirdeklerden ziyade seyrek hücre popülasyonlarını saymakla sınırlıdır.
Burada, bir ışık tabakası mikroskobunda temizlendikten ve görüntülendikten sonra, doğum sonrası 4. gün (P4) fare beyninin açıklamalı bölgelerindeki tüm çekirdekleri ve nükleer belirteçleri ölçmek için bir grup analiz aracı olan NuMorph'u (Nükleer Tabanlı Morfometri) gösteriyoruz. Doku temizleme dehidrasyon adımlarının neden olduğu büzülmeden önce beyin hacmini ölçmek için manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG), immünoetiketleme de dahil olmak üzere iDISCO + yöntemini kullanarak doku temizlemeyi ve ardından fare beyinlerini hücresel çözünürlükte görüntülemek için ticari olarak temin edilebilen bir platform kullanarak ışık tabakası mikroskobu kullanıyoruz. Daha sonra, yoğunluk farklılıklarını düzeltmek, görüntü döşemelerini dikmek, birden fazla kanalı hizalamak, çekirdekleri saymak ve genel kullanıma açık atlaslara kayıt yoluyla beyin bölgelerine açıklama eklemek için kullanılan NuMorph'u kullanarak bu görüntü analizi işlem hattını gösteriyoruz.
Bu yaklaşımı, gerekli mikroskop ve hesaplama kaynaklarına sahip herhangi bir araştırmacının bu teknikleri gerçekleştirmesine izin veren halka açık protokolleri ve yazılımları kullanarak tasarladık. Bu doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçları, korteksteki hücre tiplerinin üç boyutlu (3B) organizasyonunun ölçülmesine ve nicelleştirilmesine izin verir ve herhangi bir vahşi tip / nakavt fare çalışması tasarımına yaygın olarak uygulanmalıdır.

iDISCO+ protokolü, gözle kolayca fark edilebilen önemli doku büzülmesini beraberinde getirdiğinden (Şekil 2B), doku temizlemenin neden olduğu büzülmeyi ölçmek için doku temizlemeden önce bu boru hattına bir MRI adımı ekledik. İş akışı, beyin dışı dokunun MR görüntüsünden çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2C). Daha sonra, MR görüntüsünü ışık tabakası görüntüsüne hizalamak için katı bir dönüşüm (3 çeviri ve 3 dön?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Fare beynindeki yaklaşık 100 milyon hücre ve terabayt ölçeğine yaklaşan tüm beyin hücresel çözünürlüklü görüntülerin boyutlarıyla, hücreleri doğru bir şekilde ölçmek için gelişmiş görüntü analiz araçlarına ihtiyaç vardır. Hesaplamalı işlem hattımız, hücre algılama doğruluğu, görüntüleme süresi ve hesaplama kaynakları arasında makul bir uzlaşmayı korurken görüntüleri önceden işleyebilir ve fare korteksi içindeki çekirdekleri ölçebilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Felix Kyere ve Ian Curtin olacak.Başlamak için, numuneyi doğru numune büyüklüğü tutucusuna monte edin, böylece numune, UltraMicroscope II mikroskobunun nominal çalışma mesafesi nedeniyle en fazla 5,2 milimetre derinlikte z-boyutu ile yönlendirilecektir. Ardından, tutucuyu, tutucunun vidası kızağın desteklerine 45 derecelik açıyla olacak şekilde numune yuvasına yerleştirin. Ardından, beşiği numune ışık yoluna dik olarak yönlendirilecek şekilde bir konuma getirin.Daha sonra, mikroskoptaki yakınlaştırma gövdesini 4x büyütme veya daha yüksek bir değere ayarlayarak piksel başına 0,75 mikrometre üretin. Inspector Pro yazılımında, sayısal diyafram açıklığı değeri yaklaşık 0,08 olan tek bir ışık sayfası seçin. Eksenel çözünürlüğün görüntünün genişliği boyunca korunmasını sağlamak için Yatay Dinamik Odaklama'yı seçin ve lazer dalga boyuna bağlı olarak önerilen adım sayısını uygulayın.Ardından, kayıt kanalına göre her kanal için ince odağı ve kanal özelliklerine göre kanal başına lazer gücünü ayarlayın. Ardından, levha gücünün numune boyutu için y boyutunda en uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için ışık tabakası genişliğini yaklaşık% 50'ye ayarlayın. Daha sonra, kutucuk sayısını numunenin boyutuna göre karolar arasında önerilen %15'lik bir örtüşme ile ayarlayın ve belirli bir döşeme konumundaki her yığın için sırayla her kanal için görüntüler yakalayın.İlk olarak, Linux ve NuMorph görüntü işleme araçları için Conda ortam yöneticisini indirin ve yükleyin. Komut satırında matlab ve NM_setup çalıştırın. Analiz için gerekli görüntü analizi yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NuMorph'tan m.Ardından, NM_samples dosyayı düzenleyerek örnek adlarını, giriş ve çıkış dizinlerini, kanal bilgilerini ve ışık sayfası görüntüleme parametrelerini belirtin. Yoğunluk ayarı için, NMp_template bölümünde, yeni bir görüntü kümesiyle çalışırken yoğun ayarı true ve use_processed_images false olarak ayarlayın. Ardından, save_images ve save_samples true olarak ayarlayın.Ardından, temel algoritmayı kullanarak gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için karo gölgelendirmesini temel olarak ayarlayın veya UltraMicroscope II'den belirli ışık tabakası genişliklerinde ölçümleri kullanarak karo gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için manuel olarak ayarlayın. Görüntü kanalı hizalaması için NMp_template true olarak ayarlayın ve kanal channel_alignment çeviri veya elastik olarak alignment_method. Ardından, görüntüleme sırasında kutucuk çakışmalarını eşleştirmek için sift_refinement true ve örtüşme değerini 0,15 olarak ayarlayın.MATLAB'de ön işleme adımlarını çalıştırmak için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config işlem örneği olarak ayarlayın. Ardından, yoğunluk, hizalama veya dikiş kullanarak sahne alanını belirtirken NM_process yapılandırma dikişi belirterek ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. Bir 3B Atlas görüntüsü ve her vokseli belirli bir yapıya atayan ilişkili bir ek açıklama görüntüsüyle başlayın.Atlas görüntüsünün ve ek açıklama dosyasının doğru yönde doğru şekilde eşleştiğinden emin olmak için hem Atlas görüntüsünü hem de ek açıklama dosyasını hizalayın. Hizalamadan sonra, komutu yürüterek girişleri makalede açıklandığı gibi belirtmek için NuMorph'taki dosyaları işleyin. NMa_template'de, resample_images true ve resample_resolution Atlas'la eşleşecek şekilde ayarlayın.Ardından, resample_channels kullanılarak yeniden örneklenecek kanal numarasını belirtin. Daha sonra, register_images true olarak ayarlayın, Atlas dizinindeki dosyayla eşleşmesi için atlas_file belirtin ve registration_parameters varsayılan olarak ayarlayın. Ardından save_registered_images true olarak ayarlayın.Çekirdek algılama, hücre sayımı ve sınıflandırma için hem count_nuclei hem de classify_cells doğru olarak ayarlayın. Ardından, algılanan nesneler için minimum yoğunluk eşiği tanımlamak üzere count_method 3dunet ve min_intensity ayarlayın. Ardından, classify_method merkezcil konumlarda denetlenmeyen bir floresan yoğunluğuna dayanan eşiğe veya denetimli bir doğrusal destek vektör makinesi sınıflandırıcısını modelleyen SVM'ye ayarlayın.MATLAB'da çözümleme adımlarını gerçekleştirmek için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config çözümleme örneği olarak ayarlayın. Ardından, yeniden örnekleme, kaydetme, sayma veya sınıflandırma kullanarak aşamayı belirtirken NM_analyze yapılandırma aşaması belirterek analiz adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. NMe_template'de, güncellemeyi true olarak ayarlayın ve dizinlerden birine compare_structures_by ayarlayın.Ardından, hücre sayımını ve hücre türü sınıflandırmasını belirtirken değerlendirilecek tüm olası yapı dizinlerini ve yapılarını belirten şablon dosyasını ve yapı tablosunu ayarlayın. iDISCO + protokolü ve nöronal tabakaya özgü çekirdek belirteçleri kullanılarak doku temizleme, izokortekste üst ve alt tabaka nöronlarının açıkça tanımlanmış hücre gruplarıyla sonuçlandı. NuMorph kullanarak hücre sayımı, yoğunluk ayarı, kanal hizalaması ve dikiş içeren başarılı ön işleme adımlarına bağlıydı.Bununla birlikte, ön işleme adımlarındaki hatalar yanlış dikişlere neden olabilir, bu da yanlış hizalama ve dikişlere yol açabilir ve bu nedenle odak içi ve odak dışı desene sahip görüntülerle sonuçlanabilir. Belirli beyin bölgelerindeki çekirdekleri saymak için, dikişli görüntülere Atlas kullanılarak açıklama eklenecek ve ek açıklamaların beyin bölgelerine bindirilmesine izin verilecektir. Çekirdeklerin sentroidleri, NuMorph'ta eğitimli bir 3D U-Net modeli ile tespit edildi ve yaklaşık 2.6 milyon beyin-iki-pozitif ve 1.6 milyon CTIP2-pozitif çekirdek ile izokortekste TO-PRO-3-pozitif olan yaklaşık 12 milyon toplam çekirdek vardı.Bazal gangliyon ve hipokampal allokortekste sırasıyla yaklaşık 3.7 ve 2.9 milyon TO-PRO-3-pozitif toplam çekirdek tespit edildi. Bununla birlikte, bu iki beyin bölgesinde tespit edilen beyin-iki-pozitif hücreler ihmal edilebilir düzeydeydi ve bazal gangliyonlar ve hipokampal allokortekste her biri bir milyondan az CTIP2-pozitif hücrede sadece 1.5 civarında tespit edildi. İyi bir segmentasyon elde etmek için edinme sırasında görsel kalite kontrolleri yapın.Ayrıca, aşağı akış analizinde hiçbir hatayla karşılaşılmamasını sağlamak için Conda ortamını doğru şekilde ayarlayın. Hücre sayımına ek olarak, bu işlem hattı, hücre boyutunu ve şeklini ölçen ve daha sonra genotip grupları arasında karşılaştırılabilen diğer segmentasyon araçlarıyla entegrasyona izin verir. Boru hattımızla, beyin anatomisinin hücresel çözünürlükte nasıl değiştiğini tanımlayabiliriz, bu da hastalık riski için önemli olan hücre tiplerinin ve beyin bölgelerinin tanımlanmasına yol açar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Transkraniyal Fonksiyonel Ultrason Görüntüleme Kullanan Farelerde Tüm Beyin 3D Aktivasyon ve Fonksiyonel Bağlantı Haritalaması

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Sağlam Fare ve Zebra Balığı Beyinde Derin Doku Üç Fotonlu Floresan Mikroskopisi

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...