Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

تم دعم جزء من هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة HL090630 (ISK).

1. خطوات التحضير لتقنية التقشير
ملاحظة: يتطلب التحضير وضع العناصر التالية بجوار بعضها البعض.
<ol><li>قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر (انظر جدول المواد).</li>
	<li>ضع فيلم بارافين بطول ~ 8 سم × 10 سم بجوار ورق الترشيح بحيث يكون الورق متجها لأعل...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

تعد لطخة التقشير طريقة قوية للتغلب على تكديس وسمك بلورات 2D متعددة الطبقات وعينات مماثلة لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة الصور. سيعتمد قرار استخدام لطخة التقشير على المعلمات البيولوجية للعينة وسيتطلب أيضا تقييما بمجرد توفر نموذج 3D cryo-EM. وستكون الأهمية البيولوجية للمخالطين والمرونة المحتملة لمن?...

تم تطوير تقنية التقشير من أجل فصل البلورات ثنائية الأبعاد المكدسة من البروتينات الغشائية إلى طبقات مفردة للحصول على عينات رقيقة مناسبة لجمع البيانات cryo-EM 2D و 3D وتسهيل معالجة الصور1. البروتوكول مناسب بالمثل لأنواع أخرى من العينات متعددة الصفائح وكذلك لتحقيق تركيزات عالية للعينات من أي نوع عينة على الشبكة دون زيادة السماكة في Z.
يتم تقليل طبقات العينة إلى طبقة واحدة من خلال تطبيق مزيج من الضغط الشعري وقوى القص في بروتوكول يمتد بشكل كبير ويعدل طريقة الحقن الخلفي2. تؤدي خطوة النشاف الأولى إلى شطيرة ضيقة والالتزام بفيلم الكربون وشريط شبكي على جانبي العينة متعددة الطبقات أثناء النشاف على الميكرون الفرعي بدلا من حجم مسام ورق الترشيح 20-25 ميكرومتر في طريقة الحقن الخلفي. يحدث فصل أو تقشير طبقة فردية عند فرض فصل الطبقات المحصورة بمجرد ضغط الشبكة عموديا على قطرة تريهالوز ، مما يجبر فيلم الكربون بعيدا عن شريط الشبكة (الشكل 1). يحدث تغيير موضع فيلم الكربون بعيدا عن نقطة الاتصال الأصلية مع شريط الشبكة في الخطوة التالية ، عندما يتم مسح الشبكة مرة أخرى على ورق ترشيح submicron. يمكن تحسين عدد التكرارات لهذه الخطوات لعينات محددة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لزيادة تركيزات العينات مع تجنب التجميع في Z. نظرا للاعتماد على الالتزام بشريط الشبكة وفيلم الكربون بالإضافة إلى الفصل القسري ، قد لا يكون هذا النهج مناسبا للجزيئات شديدة الهشاشة مثل بعض البروتينات الحساسة و / أو غير المستقرة ومجمعات البروتين.
لا تتطلب تقنية التقشير معدات متخصصة ولا إمدادات باهظة الثمن. غير أن قابلية التطبيق على عينات محددة ستتطلب اعتبارات متأنية للبارامترات البيولوجية. القرار أسهل بالنسبة لبلورات 2D حيث أن فيلم الكربون مطلوب لضمان التسطيح ، ومع ذلك فإن التلاعب عبر تقنية التقشير قد يؤثر على السلامة البيولوجية للعينة أو الترتيب البلوري. تقتصر ملاءمة تقنية التقشير واللطخة للجسيمات المفردة على تلك التي تتطلب طبقة كربونية ومستقرة للتلاعب. قد لا تكون العينات ذات التفاعلات البيولوجية الحرجة بين الطبقات مناسبة للتوصيف بمساعدة تقنية التقشير بسبب تعطيل مثل هذه التفاعلات.
يتم تحسين تقنية التقشير ("التقشير اللطخ") بسرعة أكبر عن طريق الاختبار والفحص باستخدام البقع السلبية أو العينات غير الملوثة بواسطة TEM في درجة حرارة الغرفة. بمجرد تحديد العدد الأمثل لتكرارات التقشير ، يمكن تحديد وقت التحكم في السماكة قبل التزجيج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

تقنية تحضير شبكة التقشير والبقع cryo-EM هي طريقة حقن عكسي معدلة بشكل كبير بهدف تحقيق تقليل في طبقات العينات متعددة الطبقات. يمكن أن تساعد إزالة الطبقات قبل التجميد بالغطس في تقليل سمك العينة إلى مستوى مناسب لجمع بيانات cryo-EM ، وتحسين تسطيح العينة ، وتسهيل معالجة الصور. تسمح تقنية التقشير بفصل الأغشية متعددة الصفائح إلى طبقات مفردة ، وبلورات 2D ذات الطبقات إلى بلورات فردية ، وهياكل مكدسة تشبه الصفيحة من البروتينات القابلة للذوبان ليتم فصلها بالمثل إلى طبقات مفردة. غالبا ما يطرح سمك العينة العالي لهذه الأنواع من العينات مشاكل لا يمكن التغلب عليها لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة صور cryo-EM ، خاصة عندما يجب إمالة مرحلة المجهر لجمع البيانات. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد شبكات ذات تركيزات عالية من أي من هذه العينات لجمع البيانات بكفاءة حيث يمكن زيادة تركيز العينة قبل إعداد الشبكة وتعديل تقنية التقشير لطخة لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينة أحادية الطبقة.

ستؤدي تجربة التقشير الناجحة إلى طبقات مفردة من العينات بتركيزات عالية في كثير من الأحيان. من المتوقع أن تظل بعض المناطق في معظم مربعات الشبكة تحتوي على طبقات متعددة ، خاصة عند عدد أقل من التكرارات لخطوات التقشير. ومع ذلك ، فإن غالبية مربعات الشبكة ستحتوي على مناطق واسعة من الطبقات المفردة ...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

تسمح تقنية التقشير بفصل عينات cryo-EM البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة التركيز وتسهيل معالجة الصور. يمكن زيادة تركيزات العينات قبل تحضير الشبكة ، ويمكن تعديل لطخة التقشير لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينات أحادية الطبقة لجمع البيانات بكفاءة عالية. للبدء ، قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر ووضع فيلم بارافين طويل بجواره بحيث يكون الورق متجها لأعلى.ضع قطعة من ورق الترشيح دون الميكرون فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح. ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل وحدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس أو اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو أي سطح مرتفع آخر لتجنب ملامسة الشبكة النظيفة مع العناصر الأخرى.قم بإزالة الورق من فيلم البارافين واسحب الجوانب لإنشاء حافة صغيرة. ماصة اثنين 150 ميكرولتر قطرات 4٪ محلول تريهالوز في حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين من جانب قصير واحد من فيلم البارافين. يجب أن تكون المسافة بين القطبتين حوالي سنتيمتر واحد.بعد ذلك ، على مقعد منفصل أو على الأرض ، صب النيتروجين السائل في وعاء صغير من رغوة البوليسترين وضع حاوية شبكة cryo-EM صغيرة في النيتروجين السائل. قم بتغطية وعاء رغوة البوليسترين بمناديل خالية من النسالة. لتعويم فيلم الكربون من الميكا ، استخدم Dumont 5 Forceps والمس جانبا واحدا من الميكا بزاوية طفيفة لأسفل على إحدى قطرات محلول تريهالوز.حرك الميكا لأسفل للسماح لتوتر الماء برفع فيلم الكربون ببطء. حرر الميكا بمجرد أن يطفو فيلم الكربون على سطح القطرة. افحص بصريا فيلم الكربون لتجنب استخدام الكربون مع تلف في شكل كسور.أدخل الشبكة التي يحملها الملقط المضاد للشعيرات الدموية بزاوية 20-30 درجة في قطرة تريهالوز في موضع مجاور ، ثم قم بتوسيط الشبكة أسفل فيلم الكربون. التقط فيلم الكربون ، وحافظ على الشبكة في نفس الاتجاه وقم بخفض الشبكة ببطء على سطح القطرة الثانية من trehalose دون كسر التوتر السطحي للقطرة. سيؤدي ذلك إلى إزالة فيلم الكربون غير الضروري الذي قد يكون ملفوفا حول حافة الشبكة إلى الجانب الخشن.قم بتدوير الملقط المضاد للشعيرات الدموية وضعه على طبق بتري بحيث يكون الجانب الكربوني للشبكة متجها لأسفل. ماصة 1.3 ميكرولتر من العينة في الغضروف المفصلي trehalose طفيف على الجزء العلوي من الشبكة. بعد ذلك ، ماصة المحلول حوالي 8-10 مرات لخلط وتوزيع trehalose والعينة على جانبي الشبكة.ماصة واحدة أو أكثر من قطرات 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز على فيلم البارافين أثناء احتضان عينة محلول تريهالوز على الشبكة لمدة دقيقة واحدة. قم بتدوير الشبكة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى واضغط على الشبكة على ورقة الترشيح تحت الميكرون باستخدام الملقط المضاد للشعيرات الدموية. بمجرد أن يتم امتصاص المحلول بواسطة ورق الترشيح ويكون فيلم الكربون مسطحا ، انتظر لمدة ثلاث ثوان قبل رفع الشبكة وتحريكها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز.يمكن تكرار هذه الخطوات بين تكرار واحد إلى ثلاثة أو أكثر ، اعتمادا على العينة. امسح الشبكة على قطعتي ورق الترشيح ثم ارفع الشبكة من ورق الترشيح. بعد حوالي 13 ثانية ، اعتمادا على الرطوبة والمخزن المؤقت للعينة ، قم بغمر الشبكة في النيتروجين السائل في حاوية الستايروفوم الصغيرة وضعها في حاوية شبكة cryo-EM أو نقلها مباشرة لفحص cryo-EM أو جمع البيانات.تظهر هنا عينة بلورية ثنائية الأبعاد من سينسيز الليكوترين C4 البشري الخاضع لطريقة قشر اللطخة. تم تقليل المنطقة الموجودة على يسار السهم إلى حد كبير إلى بلورات 2D أحادية الطبقة في منطقة تلامس بين فيلم الكربون وشريط الشبكة الذي تم تقشيره ثم إزاحته. لم تتأثر المنطقة الموجودة على يمين السهم ببقعة التقشير.يمثل النصف السفلي من الصورة المناطق ذات الطبقات الثنائية الكبيرة ذات الطبقة الفوسفو الدهنية الكبيرة ذات الطبقة الواحدة الناتجة عن تطبيق لطخة التقشير. لم يكن النصف العلوي في منطقة تلامس بين شريط الشبكة وفيلم الكربون ، وبالتالي احتوى على جسيمات شحمية كاملة مع طبقتين فوسفوليبيد. يظهر مربع الشبكة لشبكة 400 شبكة بصمة شريط الشبكة والمناطق الناتجة عن التقشير بالإضافة إلى المناطق التي لم تكن على اتصال بشريط الشبكة أو تعرضت لعدد أقل من تكرارات بقع التقشير.أظهرت هذه الصور نشاف شبكة EM محضرة عن طريق الحقن الخلفي على ورقة ترشيح دون ميكرون باستخدام فيلم كربوني رقيق جدا. الصور عبارة عن إطارات مفردة عند التلامس الأولي مع الغشاء ، 1،000 مللي ثانية بعد الاتصال ، و 2،000 مللي ثانية بعد الاتصال. يشير السهم إلى مربعات الشبكة حيث أدى الضغط الشعري إلى تمزق فيلم الكربون.يعد تجنب الكسور في فيلم الكربون والجمع بين ورق الترشيح تحت الميكرون مع قطرة تريهالوز 1.7 ميكرولتر للشفط ثم فصل الطبقات من الخطوات الرئيسية. يتم استخدام العينات المقشرة لجمع بيانات cryo-EM عالية الدقة ، تليها معالجة الصور لتحديد الهيكل. تسمح لطخة التقشير بتحديد منظم لبلورات البروتين 2D أحادية الطبقة التي كانت في السابق سميكة جدا بالنسبة ل cryo-EM.علاوة على ذلك ، يمكنه تركيز عينات مختلفة في طبقات مفردة على فيلم الكربون.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq في البكتيريا: مجموعة عينة وبروتوكول إعداد المكتبة لتسلسل NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...