Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
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这项工作的一部分得到了NIH资助HL090630（ISK）的支持。

1. 剥离印迹技术的制备步骤
注意：准备工作需要将以下物品彼此相邻放置。
<ol><li>堆叠两张20-25μm孔径的滤纸（见 材料表）。</li>
	<li>将~8 cm x 10 cm长的石蜡薄膜放在滤纸旁边，纸张朝上。</li>
	<li>将一张亚微米滤纸放在另外两张#4滤纸的顶部（图1-1）。</li>
	<li>将反毛细管镊子放在弯曲的腿朝上，直腿朝下。然后，...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

剥离印迹是一种强大的方法，可以克服多层二维晶体和类似样品的堆叠和厚度，以进行冷冻电镜数据收集和图像处理。关于使用剥离印迹的决定将基于样品的生物学参数，一旦3D冷冻电镜模型可用，也需要进行评估。接触的生物学重要性和接触区域的潜在灵活性在这项评估中尤为重要。
剥离印迹的数量最初将在标准阴性染色网格制备后通过观察 确定 ，其中过多的层或?...

开发剥离印迹技术是为了将堆叠的膜蛋白二维晶体分离成单层，以获得用于冷冻电镜 2D 和 3D 数据收集的适当薄样品，并促进图像处理1.该方案同样适用于其他类型的多层样品，以及在不增加Z厚度的情况下在网格上实现任一样品类型的高样品浓度。
通过在协议中施加毛细管压力和剪切力的组合，将样品层减少到一层，该方案大大扩展并修改了背注方法2。第一个印迹步骤导致紧密夹层，并在亚微米（而不是背面进样方法中的20-25μm滤纸孔径）上粘附在多层样品两侧的碳膜和网格条上。一旦将网格垂直压在海藻糖液滴上，迫使碳膜远离网格条，就会发生单个层的分离或剥离，从而迫使夹层分离（图 1）。在下一步中，当网格再次印迹在亚微米滤纸上时，碳膜将远离与网格条的原始接触点重新定位。这些步骤的迭代次数可以针对特定样本进行优化。此外，该方案可用于增加样品浓度，同时避免聚集在Z中。 由于依赖于对网格条和碳膜的粘附以及强制分离，这种方法可能不适用于高度脆弱的分子，例如某些脆弱和/或不稳定的蛋白质和蛋白质复合物。
剥离印迹技术既不需要专门的设备，也不需要昂贵的耗材。然而，对特定样品的适用性需要仔细考虑生物参数。对于2D晶体来说，这个决定更容易，因为需要碳膜来确保平整度，但通过剥离印迹技术 进行操作 可能会影响样品或晶体顺序的生物完整性。剥离印迹技术对单个颗粒的适用性仅限于需要碳膜且对操作稳定的颗粒，并且可以对其进行测试。层间具有关键生物相互作用的标本可能不适合借助剥离-印迹技术进行表征，因为这种相互作用会中断。
剥离-印迹技术（“剥离-印迹”）通过在室温下通过 TEM 对阴性染色或未染色样品进行测试和筛选来最快速地优化。一旦确定了最佳的剥离-印迹迭代次数，就可以确定玻璃化前控制厚度的时间。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

剥离印迹冷冻电镜网格制备技术是一种经过显著修改的背进样方法，目的是减少多层样品的层数。在冷冻之前去除层有助于将样品厚度降低到适合冷冻电镜数据收集的水平，提高样品平坦度并促进图像处理。剥离-印迹技术允许将多层膜分离成单层，将分层的2D晶体分离成单个晶体，并将可溶性蛋白质的堆叠片状结构分离成单层。这些类型样品的高样品厚度经常给冷冻电镜数据收集和冷冻电镜图像处理带来无法克服的问题，特别是当显微镜载物台必须倾斜以进行数据收集时。此外，可以制备高浓度的这些样品的网格以进行有效的数据收集，因为可以增加网格制备之前的样品浓度，并且可以调整剥离印迹技术以产生单层样品的密集分布。

成功的剥离印迹实验将产生通常高浓度的单层样品。预计大多数网格方块中的某些区域仍将包含多个层，尤其是在剥离印迹步骤迭代次数较少的情况下。然而，大多数网格正方形将包含广泛的单层区域，如人白三烯C4合酶（图2）和脂质体（在步骤3.2， 图3中添加）的2D晶体所观察到的那样。可能需要对未显示所需层数减少的样品测试额外的剥离?...

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The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

剥离-印迹技术是一种冷冻电镜网格制备方法，可将多层和浓缩的生物样品分离成单层，以减小厚度、提高样品浓度并促进图像处理。

剥离印迹技术：一种冷冻电镜样品制备方法，用于从多层或浓缩生物样品中分离单层

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

剥离-印迹技术允许将多层和浓缩的生物冷冻电镜样品分离成单层，以减小厚度、提高浓度并促进图像处理。在网格制备之前可以增加样品浓度，并且可以调整剥离印迹，使单层样品的密集分布，从而实现高效的数据收集。首先，堆叠两张孔径为20-25微米的滤纸，并在旁边放置一层长石蜡膜，纸张朝上。将一张亚微米滤纸放在另外两张滤纸的顶部。将反毛细管镊子放在弯曲的腿朝上，直腿朝下，并选择光滑或有光泽的一面朝上的 600 目网格。将镊子放在培养皿或其他凸起的表面上，以避免干净的网格与其他物品接触。从石蜡膜上取下纸张，拉动侧面以形成一个小边缘。移取两滴150微升的4%海藻糖溶液，距离石蜡膜的一个短边约1至2厘米。两滴应相距约一厘米。接下来，在单独的工作台上或地板上，将液氮倒入一个小的聚苯乙烯泡沫容器中，并将一个小的冷冻电镜网格容器放入液氮中。用不起毛的湿巾覆盖聚苯乙烯泡沫容器。要从云母中漂浮碳膜，请使用 Dumont 5 镊子，在其中一滴海藻糖溶液上以轻微的向下角度触摸云母的一侧。向下移动云母，让水张力慢慢地从碳膜上抬起。一旦碳膜漂浮在液滴表面，就释放云母。目视检查碳膜，以避免使用以裂缝形式损坏的碳。将反毛细管镊子以20-30度角固定的网格插入相邻位置的海藻糖滴中，然后将网格居中到碳膜下方。拿起碳膜，将网格保持在相同的方向，然后缓慢地将网格降低到第二滴海藻糖的表面上，而不会破坏滴的表面张力。这将去除不必要的碳膜，这些碳膜可能已经缠绕在网格边缘到粗糙的一面。旋转反毛细管镊子并将它们放在培养皿上，网格的碳面朝下。将1.3微升样品移液到网格顶部的轻微海藻糖弯月面中。然后，移液约8-10次，以混合海藻糖和样品在网格的两侧。将一滴或多滴 1.7 微升海藻糖溶液移液到石蜡膜上，同时将样品海藻糖溶液在网格上孵育一分钟。将网格旋转回其原始位置，碳膜朝上，并使用反毛细管镊子将网格压在亚微米滤纸上。一旦溶液被滤纸吸收并且碳膜平放，等待三秒钟，然后抬起网格并将其垂直移动到 1.7 微升海藻糖溶液上。这些步骤可以在一到三次或更多次重复之间重复，具体取决于样本。将网格吸干在两张滤纸上，然后从滤纸上提起网格。大约 13 秒后，根据湿度和样品缓冲液，将网格插入小聚苯乙烯泡沫塑料容器中的液氮中，并将其放入冷冻电镜网格容器中或直接转移以进行冷冻电镜筛选或数据收集。此处显示了经受剥离印迹法的人白三烯 C4 合酶的 2D 晶体样品。箭头左侧的区域在碳膜和网格条之间的接触区域中在很大程度上减少为单层2D晶体，网格条被剥离印迹然后移动。箭头右侧的区域不受剥离印迹的影响。图像的下半部分表示由于应用剥离印迹而产生的具有大的，主要是单层磷酸脂质双层的区域。上半部分不在网格棒和碳膜之间的接触区，因此包含具有两个磷脂双层的完整脂质体。400目网格的网格方块显示了网格条的足迹和产生的剥离印迹区域，以及未与网格条接触或剥离印迹迭代次数较少的区域。这些图像显示了使用非常薄的碳膜在亚微米滤纸上反向注射制备的EM网格的印迹。图像是与膜初次接触时的单帧，接触后1， 000毫秒和接触后2， 000毫秒。箭头表示毛细管压力使碳膜破裂的网格正方形。避免碳膜破裂并将亚微米滤纸与 1.7 微升海藻糖滴液滴相结合，然后分离层是关键步骤。剥离印迹样品用于高分辨率冷冻电镜数据收集，然后进行图像处理以进行结构测定。剥离印迹允许结构化测定单层蛋白质2D晶体，这些晶体以前对于冷冻电镜来说太厚了。此外，它可以将各种样品浓缩成碳膜上的单层。

Research

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Biochemistry

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强大的单颗粒冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 处理工作流程，具有冷冻 SPARC、RELION 和 Scipion

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