Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

En del af dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud HL090630 (ISK).

1. Forberedelsestrin til skrælblot-teknikken
BEMÆRK: Forberedelse kræver, at følgende genstande placeres ved siden af hinanden.
<ol><li>Stak to stykker filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm (se Materialetabel).</li>
	<li>Placer en ~8 cm x 10 cm lang paraffinfilm ved siden af filterpapiret med papiret opad.</li>
	<li>Placer et stykke submikronfilterpapir oven på yderligere to stykker #4 filterpapir (figur 1-1</s...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Peel-blot er en kraftfuld metode til at overvinde stabling og tykkelse af flerlags 2D-krystaller og lignende prøver til cryo-EM-dataindsamling og billedbehandling. En beslutning om brugen af peel-blot vil være baseret på biologiske parametre i prøven og vil også kræve vurdering, når en 3D cryo-EM-model er tilgængelig. Den biologiske betydning af kontakter og kontaktregionernes potentielle fleksibilitet vil være særlig vigtig i denne vurdering.
Antallet af skrælpletter vil i første ...

Peel-blot-teknikken blev udviklet for at adskille stablede todimensionelle krystaller af membranproteiner i enkeltlag for at opnå passende tynde prøver til cryo-EM 2D- og 3D-dataindsamling og lette billedbehandling1. Protokollen er ligeledes velegnet til andre typer multilamellare prøver samt til at opnå høje prøvekoncentrationer af begge prøvetyper på gitteret uden at øge tykkelsen i Z.
Reduktion af prøvelag til et lag opnås ved at anvende en kombination af kapillærtryk og forskydningskræfter i en protokol, der væsentligt udvider og ændrer ryginjektionsmetoden2. Et første blottingtrin resulterer i tæt sandwiching og vedhæftning af carbonfilmen og en gitterstang på hver side af flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25 μm filterpapirporestørrelse i tilbageinjektionsmetoden. Adskillelsen eller afskalningen af et individuelt lag sker ved at tvinge adskillelsen af de klemte lag, når gitteret presses lodret på et trehalosefald, hvilket tvinger carbonfilmen væk fra gitterbjælken (figur 1). Omplacering af carbonfilmen væk fra det oprindelige kontaktpunkt med gitterbjælken sker i næste trin, når gitteret igen blottes på submikronfilterpapir. Antallet af gentagelser af disse trin kan optimeres til specifikke prøver. Desuden kan protokollen bruges til at øge prøvekoncentrationerne og samtidig undgå aggregering i Z. På grund af afhængigheden af overholdelse af gitterbjælken og carbonfilmen samt kraftig adskillelse er denne tilgang muligvis ikke egnet til meget skrøbelige molekyler såsom visse sarte og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.
Peel-blot-teknikken kræver hverken specialudstyr eller dyre forsyninger. Anvendelighed på specifikke prøver vil dog kræve nøje overvejelser om biologiske parametre. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da kulstoffilm er nødvendig for at sikre fladhed, men manipulation via peel-blot-teknikken kan påvirke prøvens biologiske integritet eller krystallinske rækkefølge. Peel-blot-teknikkens egnethed til enkeltpartikler er begrænset til og kan testes for dem, der kræver kulstoffilm og er stabile over for manipulation. Prøver med kritiske biologiske interaktioner mellem lag er muligvis ikke egnede til karakterisering ved hjælp af skrælblot-teknikken på grund af forstyrrelsen af sådanne interaktioner.
Peel-blot-teknikken ("peel-blot") optimeres hurtigst ved at teste og screene med negativ plet eller ufarvede prøver ved TEM ved stuetemperatur. Når det optimale antal peel-blot-iterationer er blevet identificeret, kan tiden til at kontrollere tykkelsen før forglasning bestemmes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Peel-blot cryo-EM-gitterforberedelsesteknikken er en signifikant modificeret tilbageinjektionsmetode med det formål at opnå en reduktion i lag af flerlagsprøver. Denne fjernelse af lag inden nedfrysning kan hjælpe med at reducere prøvetykkelsen til et niveau, der er egnet til cryo-EM-dataindsamling, forbedre prøvefladheden og lette billedbehandling. Peel-blot-teknikken gør det muligt at adskille multilamellarmembraner i enkeltlag, af lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller og af stablede, arklignende strukturer af opløselige proteiner, der ligeledes kan adskilles i enkeltlag. Den høje prøvetykkelse af disse typer prøver udgør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-dataindsamling og cryo-EM-billedbehandling, især når mikroskoptrinnet skal vippes for dataindsamling. Desuden kan gitre med høje koncentrationer af nogen af disse prøver forberedes til effektiv dataindsamling, da prøvekoncentrationen inden gitterforberedelse kan øges, og peel-blot-teknikken justeres for at resultere i en tæt fordeling af enkeltlagsprøve.

Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag af prøver i ofte høje koncentrationer. Det kan forventes, at nogle regioner i de fleste gitterkvadrater stadig vil indeholde flere lag, især ved færre antal iterationer af skrælblot-trinnene. Størstedelen af gitterkvadrater vil imidlertid indeholde omfattende regioner af enkeltlag som observeret for 2D-krystaller af human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (tilføjet i trin 3.2, figur 3).<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gitterforberedelsesmetode, der gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge prøvekoncentrationen og lette billedbehandlingen.

Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Peel-blot-teknikken gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske cryo-EM-prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge koncentrationen og lette billedbehandlingen. Prøvekoncentrationer kan øges inden gitterforberedelse, og skrælpletten kan justeres for at resultere i en tæt fordeling af enkeltlagsprøver til meget effektiv dataindsamling. Til at begynde med skal du stable to stykker filterpapir på 20-25 mikrometer pore størrelse og placere en lang paraffinfilm ved siden af den med papiret opad.Placer et stykke submikronfilterpapir oven på yderligere to stykker filterpapir. Placer antikapillærtangen med det bøjede ben opad og det lige ben nedad, og vælg et gitter med 600 net med den glatte eller skinnende side opad. Placer tangen på en petriskål eller anden hævet overflade for at undgå kontakt med det rene gitter med andre genstande.Fjern papiret fra paraffinfilmen, og træk i siderne for at skabe en lille kant. Pipetter to 150 mikroliter dråber, så 4% trehaloseopløsning er omkring en til to centimeter fra den ene korte side af paraffinfilmen. De to dråber skal være omkring en centimeter fra hinanden.Hæld derefter flydende nitrogen i en lille polystyrenskumbeholder på en separat bænk eller på gulvet og læg en lille cryo-EM-gitterbeholder i det flydende nitrogen. Dæk polystyrenskumbeholderen med fnugfri klude. For at flyde carbonfilmen fra glimmeret skal du bruge Dumont 5 Forceps og røre den ene side af glimmeret i en lille vinkel nedad på en af dråberne af trehaloseopløsning.Flyt glimmeret nedad for at lade vandspændingen løfte sig langsomt af kulstoffilmen. Slip glimmeret, når kulstoffilmen flyder på overfladen af dråben. Visuelt inspicere carbonfilmen for at undgå at bruge kulstof med skader i form af brud.Indsæt gitteret, der holdes af antikapillærtangen i en 20-30 graders vinkel, i et trehalosefald i en position ved siden af, og centrer derefter gitteret under carbonfilmen. Tag kulstoffilmen op, hold gitteret i samme retning, og sænk langsomt gitteret ned på overfladen af den anden dråbe trehalose uden at bryde dråbens overfladespænding. Dette vil fjerne unødvendig kulstoffilm, der kan have viklet sig rundt om gitterets kant til den ru side.Drej antikapillærtangen og læg dem på en petriskål med kulstofsiden af gitteret nedad. Pipetter 1,3 mikroliter af prøven i den lette trehalose menisk oven på gitteret. Derefter pipetteres opløsningen ca. 8-10 gange for at blande og fordele trehalosen og prøven på begge sider af gitteret.Der pipetteres en eller flere 1,7 mikroliter dråber trehaloseopløsning på paraffinfilmen, mens prøve-trehaloseopløsningen inkuberes på gitteret i et minut. Drej gitteret tilbage til sin oprindelige position med kulfilmen opad, og tryk gitteret på submikronfilterpapiret ved hjælp af antikapillærtangen. Når opløsningen er absorberet af filterpapiret, og kulfilmen ligger fladt, skal du vente i tre sekunder, før du løfter gitteret og flytter det lodret på 1,7 mikroliter dråbe trehaloseopløsning.Disse trin kan gentages mellem en til tre gentagelser eller mere, afhængigt af prøven. Blotter gitteret på de to stykker filterpapir, og løft derefter gitteret fra filterpapiret. Efter ca. 13 sekunder, afhængigt af fugtighed og prøvebuffer, dykkes gitteret ned i det flydende nitrogen i den lille styrofoambeholder og placeres i cryo-EM-gitterbeholderen eller overføres direkte til cryo-EM-screening eller dataindsamling.En 2D-krystalprøve af human leukotrien C4-syntase udsat for skrælblot-metoden er vist her. Området til venstre for pilen blev stort set reduceret til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellem carbonfilmen og gitterbjælken, der blev skrællet og derefter skiftet. Regionen til højre for pilen blev ikke påvirket af skrælpletten.Den nederste halvdel af billedet repræsenterer regionerne med store, for det meste enkeltlags phospho lipid dobbeltlag som følge af påføring af skrælpletten. Den øverste halvdel var ikke i en kontaktzone mellem gitterstangen og carbonfilmen og indeholdt således komplette liposomer med to phospholipid dobbeltlag. Gitterkvadratet på et 400 netgitter viser fodaftrykket af gitterbjælken og de resulterende skræl-blottede regioner samt de regioner, der ikke var i kontakt med en gitterstang eller udsat for færre skrælblot-iterationer.Disse billeder viste blotting af et EM-gitter fremstillet ved ryginjektion på et submikronfilterpapir ved hjælp af meget tynd carbonfilm. Billederne er enkeltrammer ved første kontakt med membranen, 1.000 millisekunder efter kontakt og 2.000 millisekunder efter kontakt. Pilen angiver gitterfirkanter, hvor kapillærtrykket sprængte kulstoffilmen.At undgå brud i carbonfilmen og kombinere submikronfilterpapir med et 1,7 mikroliter trehalosefald til sugning og derefter adskille lagene er vigtige trin. De skrællede prøver bruges til højopløsnings cryo-EM-dataindsamling efterfulgt af billedbehandling til strukturbestemmelse. Skræl-blotten giver mulighed for struktureret bestemmelse af enkeltlags protein 2D-krystaller, som tidligere var for tykke til cryo-EM.Desuden kan den koncentrere forskellige prøver i enkeltlag på kulstoffilm.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepræparat ved hjælp af en Lipid Monolayer-metode til elektronkrygrafiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...