Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

Een deel van dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie HL090630 (ISK).

1. Voorbereidingsstappen voor de peel-blot techniek
OPMERKING: Voorbereiding vereist dat de volgende items naast elkaar worden geplaatst.
<ol><li>Stapel twee stukken filterpapier van 20-25 μm porieformaat (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats een paraffinefilm van ~8 cm x 10 cm lang naast het filtreerpapier met het papier naar boven gericht.</li>
	<li>Leg een stuk submicronfilterpapier op twee extra stukken #4-filterpapier (figuur</str...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

De peel-blot is een krachtige methode om stapeling en dikte van meerlaagse 2D-kristallen en soortgelijke monsters voor cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking te overwinnen. Een beslissing over het gebruik van de peel-blot zal gebaseerd zijn op biologische parameters van het monster en zal ook moeten worden beoordeeld zodra een 3D cryo-EM-model beschikbaar is. Het biologische belang van contacten en de potentiële flexibiliteit van contactregio's zullen bij deze beoordeling bijzonder belangrijk zijn.
<p class=...

De peel-blot-techniek is ontwikkeld om gestapelde tweedimensionale kristallen van membraaneiwitten in enkele lagen te scheiden om voldoende dunne monsters te verkrijgen voor cryo-EM 2D- en 3D-gegevensverzameling en beeldverwerkingte vergemakkelijken 1. Het protocol is ook geschikt voor andere soorten multilamellaire monsters en voor het bereiken van hoge monsterconcentraties van beide monstertypen op het rooster zonder de dikte in Z te vergroten.
Reductie van monsterlagen tot één laag wordt bereikt door een combinatie van capillaire druk en schuifkrachten toe te passen in een protocol dat de teruginjectiemethode aanzienlijk verlengt en wijzigt2. Een eerste blotting-stap resulteert in strakke sandwiching en hechting aan de koolstoffilm en een rasterbalk aan weerszijden van het meerlagige monster tijdens het blotting op submicron in plaats van de 20-25μm filterpapierporiëngrootte in de back-injectiemethode. De scheiding, of peeling, van een individuele laag vindt plaats bij het forceren van de scheiding van de ingeklemde lagen zodra het raster verticaal op een trehalosedruppel wordt gedrukt, waardoor de koolstoffilm weg wordt gedwongen van de rasterbalk (figuur 1). Het verplaatsen van de koolstoffilm weg van het oorspronkelijke contactpunt met de rasterbalk vindt plaats in de volgende stap, wanneer het raster opnieuw wordt uitgeveegd op submicronfilterpapier. Het aantal iteraties van deze stappen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke voorbeelden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de monsterconcentraties te verhogen en tegelijkertijd aggregatie in Z te vermijden. Vanwege de afhankelijkheid van de naleving van de rasterbalk en koolstoffilm en krachtige scheiding, is deze aanpak mogelijk niet geschikt voor zeer fragiele moleculen zoals bepaalde delicate en / of onstabiele eiwitten en eiwitcomplexen.
De peel-blot techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur of dure benodigdheden. Toepasbaarheid op specifieke monsters vereist echter zorgvuldige overwegingen van biologische parameters. De beslissing is gemakkelijker voor 2D-kristallen omdat koolstoffilm nodig is om vlakheid te garanderen, maar manipulatie via de peel-blot-techniek kan de biologische integriteit van het monster of de kristallijne volgorde beïnvloeden. De geschiktheid van de peel-blot-techniek voor afzonderlijke deeltjes is beperkt tot en kan worden getest voor deeltjes die koolstoffilm nodig hebben en stabiel zijn voor manipulatie. Specimens met kritische biologische interacties tussen lagen zijn mogelijk niet geschikt voor karakterisering met behulp van de peel-blot-techniek vanwege de verstoring van dergelijke interacties.
De peel-blot techniek ("peel-blot") wordt het snelst geoptimaliseerd door testen en screenen met negatieve vlekken of niet-gekleurde monsters door TEM bij kamertemperatuur. Zodra het optimale aantal peel-blot iteraties is geïdentificeerd, kan de tijd om de dikte vóór de vitrificatie te regelen worden bepaald.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

De peel-blot cryo-EM grid preparation techniek is een significant gewijzigde back-injection methode met als doel het bereiken van een vermindering van lagen van meerlagige monsters. Deze verwijdering van lagen voorafgaand aan het bevriezen van de duik kan helpen bij het verminderen van de dikte van het monster tot een niveau dat geschikt is voor cryo-EM-gegevensverzameling, het verbeteren van de vlakheid van het monster en het vergemakkelijken van beeldverwerking. De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om multilamellaire membranen in enkele lagen te scheiden, van gelaagde 2D-kristallen in individuele kristallen en van gestapelde, plaatachtige structuren van oplosbare eiwitten die eveneens in enkele lagen moeten worden gescheiden. De hoge monsterdikte van dit soort monsters levert vaak onoverkomelijke problemen op voor cryo-EM-gegevensverzameling en cryo-EM-beeldverwerking, vooral wanneer de microscoopfase moet worden gekanteld voor gegevensverzameling. Bovendien kunnen rasters van hoge concentraties van elk van deze monsters worden voorbereid voor efficiënte gegevensverzameling, omdat de monsterconcentratie voorafgaand aan de rastervoorbereiding kan worden verhoogd en de peel-blot-techniek kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van eenlaags monster.

Een succesvol peel-blot experiment zal resulteren in enkele lagen monsters in vaak hoge concentraties. Het is te verwachten dat sommige regio's in de meeste rastervierkanten nog steeds meerdere lagen zullen bevatten, vooral bij minder iteraties van de peel-blot-stappen. De meerderheid van de rastervierkanten zal echter uitgebreide gebieden van enkele lagen bevatten, zoals waargenomen voor 2D-kristallen van humaan leukotrieen C4-synthase (figuur 2) en liposomen (toegevoegd in stap ...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om meerlagige en geconcentreerde biologische cryo-EM-monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de concentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken. Monsterconcentraties kunnen worden verhoogd voorafgaand aan de rastervoorbereiding en de peel-blot kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van enkellaagse monsters voor zeer efficiënte gegevensverzameling. Stapel om te beginnen twee stukken filterpapier van 20-25 micrometer porieformaat en plaats ernaast een lange paraffinefilm met het papier naar boven gericht.Leg een stuk submicron filterpapier op twee extra stukken filterpapier. Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden en selecteer een raster van 600 mesh met de gladde of glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 microliter, dus 4% trehalose-oplossing op ongeveer één tot twee centimeter van een korte kant van de paraffinefilm. De twee druppels moeten ongeveer een centimeter uit elkaar liggen.Giet vervolgens op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer en plaats een kleine cryo-EM-roostercontainer in de vloeibare stikstof. Bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes. Om de koolstoffilm van het mica te laten zweven, gebruikt u dumont 5 tang en raakt u één kant van het mica aan in een lichte hoek naar beneden op een van de druppels trehalose-oplossing.Beweeg de mica naar beneden om de waterspanning langzaam van de koolstoffilm af te laten komen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft. Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang wordt vastgehouden in een hoek van 20-30 graden in een trehalosedruppel op een positie ernaast en centreer het raster vervolgens onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op, houd het rooster in dezelfde richting en laat het rooster langzaam zakken op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken. Dit verwijdert onnodige koolstoffilm die mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant is gewikkeld.Draai de anti-capillaire tang en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht. Pipetteer 1,3 microliter van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer vervolgens de oplossing ongeveer 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.Pipetteer een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 microliter op de paraffinefilm terwijl u de monstertrehalose-oplossing gedurende één minuut op het rooster incubeert. Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht en druk het raster op het submicronfilterpapier met behulp van de anti-capillaire tang. Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u drie seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de 1,7 microliter druppel trehalose-oplossing beweegt.Deze stappen kunnen worden herhaald tussen één tot drie herhalingen of meer, afhankelijk van het monster. Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til vervolgens het raster van het filterpapier op. Na ongeveer 13 seconden, afhankelijk van de luchtvochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.Een 2D-kristalmonster van humaan leukotrieen C4-synthase onderworpen aan de peel-blot-methode wordt hier getoond. Het gebied links van de pijl werd grotendeels gereduceerd tot enkellaagse 2D-kristallen in een contactgebied tussen de koolstoffilm en de rasterbalk die werd afgepeld en vervolgens verschoven. Het gebied rechts van de pijl werd niet beïnvloed door de peel-blot.De onderste helft van de afbeelding vertegenwoordigt de regio's met grote, meestal enkellaagse fosfolipidenbilagen als gevolg van het aanbrengen van de peel-blot. De bovenste helft bevond zich niet in een contactzone tussen de rasterbalk en de koolstoffilm en bevatte dus complete liposomen met twee fosfolipide bilayers. Het rastervierkant van een raster met 400 mazen toont de voetafdruk van de rasterbalk en de resulterende peel-blotted-gebieden, evenals de regio's die niet in contact waren met een rasterbalk of werden onderworpen aan minder peel-blot-iteraties.Deze beelden toonden de blotting van een EM-raster bereid door de teruginjectie op een submicron filterpapier met behulp van zeer dunne koolstoffilm. De beelden zijn afzonderlijke frames bij het eerste contact met het membraan, 1.000 milliseconden na contact en 2.000 milliseconden na contact. De pijl geeft rastervierkanten aan waar de capillaire druk de koolstoffilm scheurde.Het vermijden van breuken in de koolstoffilm en het combineren van submicron filterpapier met een trehalosedruppel van 1,7 microliter om te zuigen en vervolgens de lagen te scheiden, zijn belangrijke stappen. De peel-blotted monsters worden gebruikt voor cryo-EM-gegevensverzameling met hoge resolutie, gevolgd door beeldverwerking voor de structuurbepaling. De peel-blot maakt gestructureerde bepaling mogelijk van enkellaagse eiwit 2D-kristallen die voorheen te dik waren voor cryo-EM.Bovendien kan het verschillende monsters concentreren in enkele lagen op koolstoffilm.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...