Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
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Ein Teil dieser Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss HL090630 (ISK) unterstützt.

1. Vorbereitungsschritte für die Peel-Blot-Technik
HINWEIS: Zur Vorbereitung müssen die folgenden Elemente nebeneinander platziert werden.
<ol><li>Stapeln Sie zwei Stück Filterpapier im Porenformat 20-25 μm (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie eine ~8 cm x 10 cm lange Paraffinfolie mit dem Papier nach oben neben das Filterpapier.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier #4 (A...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sei...

Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern1. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.
Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das die Rückinjektionsmethode2 wesentlich erweitert und modifiziert. Ein erster Löschschritt führt zu einem dichten Sandwiching und einer Haftung auf dem Kohlenstofffilm und einem Gitterstab auf beiden Seiten der mehrschichtigen Probe während des Blottings auf Submikron anstelle der Porengröße von 20-25 μm Filterpapier bei der Rückinjektionsmethode. Die Trennung oder das Ablösen einer einzelnen Schicht erfolgt, wenn die Trennung der Sandwichschichten erzwungen wird, sobald das Gitter vertikal auf einen Trehalose-Tropfen gedrückt wird, wodurch der Kohlenstofffilm vom Gitterstab weggedrückt wird (Abbildung 1). Die Neupositionierung der Kohlenstofffolie weg von der ursprünglichen Kontaktstelle mit der Gitterstange erfolgt im nächsten Schritt, wenn das Gitter erneut auf Submikron-Filterpapier abgetupft wird. Die Anzahl der Iterationen dieser Schritte kann für bestimmte Proben optimiert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen und gleichzeitig eine Aggregation in Z zu vermeiden. Aufgrund der Abhängigkeit von der Haftung an Gitterstab und Kohlenstofffilm sowie der kraftvollen Trennung ist dieser Ansatz möglicherweise nicht für hochzerbrechliche Moleküle wie bestimmte empfindliche und/oder instabile Proteine und Proteinkomplexe geeignet.
Die Peel-Blot-Technik erfordert weder spezielle Ausrüstung noch teure Vorräte. Die Anwendbarkeit auf bestimmte Proben erfordert jedoch eine sorgfältige Berücksichtigung biologischer Parameter. Die Entscheidung ist für 2D-Kristalle einfacher, da Kohlenstofffilm erforderlich ist, um die Ebenheit zu gewährleisten, aber die Manipulation über die Peel-Blot-Technik kann die biologische Integrität der Probe oder die kristalline Ordnung beeinträchtigen. Die Eignung der Peel-Blot-Technik für einzelne Partikel ist auf diejenigen beschränkt und kann für diejenigen getestet werden, die Kohlenstofffilm benötigen und stabil gegen Manipulation sind. Proben mit kritischen biologischen Wechselwirkungen zwischen Schichten sind aufgrund der Störung solcher Wechselwirkungen möglicherweise nicht für die Charakterisierung mit Hilfe der Peel-Blot-Technik geeignet.
Die Peel-Blot-Technik ("Peel-Blot") wird am schnellsten durch Testen und Screening mit negativen Flecken oder ungefärbten Proben durch TEM bei Raumtemperatur optimiert. Sobald die optimale Anzahl von Peel-Blot-Iterationen identifiziert wurde, kann die Zeit bis zur Kontrolle der Dicke vor der Vitrifikation bestimmt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.

Ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment führt zu einzelnen Probenschichten mit oft hohen Konzentrationen. Es ist zu erwarten, dass einige Regionen in den meisten Rasterquadraten immer noch mehrere Schichten enthalten, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Iterationen der Peel-Blot-Schritte. Die Mehrheit der Gitterquadrate wird jedoch ausgedehnte Regionen von Einzelschichten enthalten, wie sie für 2D-Kristalle der menschlichen Leukotrien-C4-Synthase (Abbildung 2) und Liposomen (hinzugefügt in Schritt 3.2,</s...

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The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.

Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Kryo-EM-Proben in einzelne Schichten, um die Dicke zu reduzieren, die Konzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Probenkonzentrationen können vor der Gittervorbereitung erhöht werden, und der Peel-Blot kann so eingestellt werden, dass eine dichte Verteilung von einschichtigen Proben für eine hocheffiziente Datenerfassung entsteht. Um zu beginnen, stapeln Sie zwei Stücke 20-25 Mikrometer porengroßes Filterpapier und legen Sie eine lange Paraffinfolie daneben mit dem Papier nach oben.Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier. Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten und wählen Sie ein 600-Mesh-Gitter mit der glatten oder glänzenden Seite nach oben. Legen Sie die Pinzette auf eine Petrischale oder eine andere erhöhte Oberfläche, um den Kontakt des sauberen Gitters mit anderen Gegenständen zu vermeiden.Entfernen Sie das Papier von der Paraffinfolie und ziehen Sie an den Seiten, um einen kleinen Rand zu erzeugen. Pipetten zwei 150 Mikroliter Tropfen also 4%Trehalose-Lösung bei etwa ein bis zwei Zentimetern von einer kurzen Seite der Paraffinfolie. Die beiden Tropfen sollten etwa einen Zentimeter voneinander entfernt sein.Als nächstes gießen Sie auf einer separaten Bank oder auf dem Boden flüssigen Stickstoff in einen kleinen Polystyrolschaumbehälter und legen Sie einen kleinen Kryo-EM-Gitterbehälter in den flüssigen Stickstoff. Decken Sie den Polystyrolschaumbehälter mit fusselfreien Tüchern ab. Um den Kohlenstofffilm aus dem Glimmer zu schwimmen, verwenden Sie Dumont 5 Pinzette und berühren Sie eine Seite des Glimmers in einem leichten Winkel nach unten auf einem der Tropfen Trehaloselösung.Bewegen Sie den Glimmer nach unten, damit sich die Wasserspannung langsam vom Kohlenstofffilm abhebt. Geben Sie den Glimmer frei, sobald der Kohlenstofffilm auf der Oberfläche des Tröpfchens schwimmt. Untersuchen Sie den Kohlenstofffilm visuell, um die Verwendung von Kohlenstoff mit Schäden in Form von Brüchen zu vermeiden.Führen Sie das von der Antikapillarzange gehaltene Gitter in einem Winkel von 20-30 Grad in einen Trehalose-Tropfen an einer benachbarten Position ein und zentrieren Sie dann das Gitter unter dem Kohlenstofffilm. Nehmen Sie den Kohlenstofffilm auf, halten Sie das Gitter in der gleichen Ausrichtung und senken Sie das Gitter langsam auf die Oberfläche des zweiten Tropfens Trehalose, ohne die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen. Dadurch wird unnötiger Kohlenstofffilm entfernt, der sich möglicherweise um den Rand des Gitters auf die raue Seite gewickelt hat.Drehen Sie die Antikapillarzange und legen Sie sie auf eine Petrischale mit der Kohlenstoffseite des Gitters nach unten. Pipettieren Sie 1,3 Mikroliter der Probe in den leichten Trehalose-Meniskus oben auf dem Gitter. Dann pipettieren Sie die Lösung ungefähr 8-10 mal, um die Trehalose und die Probe auf beiden Seiten des Gitters zu mischen und zu verteilen.Pipettieren Sie einen oder mehrere 1,7-Mikroliter-Tropfen Trehalose-Lösung auf die Paraffinfolie, während Sie die Trehalose-Probenlösung eine Minute lang auf dem Gitter inkubieren. Drehen Sie das Gitter mit dem Kohlenstofffilm nach oben zurück in seine ursprüngliche Position und drücken Sie das Gitter mit der Antikapillarzange auf das Submikron-Filterpapier. Sobald die Lösung vom Filterpapier absorbiert wurde und der Kohlenstofffilm flach liegt, warten Sie drei Sekunden, bevor Sie das Gitter anheben und senkrecht auf den 1,7 Mikroliter Tropfen Trehalose-Lösung bewegen.Diese Schritte können je nach Probe zwischen ein und drei Wiederholungen oder mehr wiederholt werden. Tupfen Sie das Raster auf den beiden Filterpapierstücken ab und heben Sie dann das Raster vom Filterpapier ab. Nach ca. 13 Sekunden, abhängig von Feuchtigkeit und Probenpuffer, tauchen Sie das Gitter in den flüssigen Stickstoff im kleinen Styroporbehälter und legen Sie es in den Kryo-EM-Gitterbehälter oder übertragen Sie es direkt zum Kryo-EM-Screening oder zur Datenerfassung.Eine 2D-Kristallprobe der humanen Leukotrien-C4-Synthase, die der Peel-Blot-Methode unterzogen wurde, ist hier gezeigt. Der Bereich links vom Pfeil wurde weitgehend auf einschichtige 2D-Kristalle in einem Kontaktbereich zwischen dem Kohlenstofffilm und dem Gitterbalken reduziert, der abgezogen und dann verschoben wurde. Der Bereich rechts vom Pfeil wurde vom Peel-Blot nicht beeinflusst.Die untere Bildhälfte stellt die Regionen mit großen, meist einschichtigen Phospho-Lipid-Doppelschichten dar, die aus der Anwendung des Peel-Blots resultieren. Die obere Hälfte befand sich nicht in einer Kontaktzone zwischen dem Gitterbalken und dem Kohlenstofffilm und enthielt somit vollständige Liposomen mit zwei Phospholipiddoppelschichten. Das Rasterquadrat eines Rasters mit 400 Maschen zeigt die Grundfläche des Rasterbalkens und die resultierenden Peel-Blotted-Bereiche sowie die Bereiche, die nicht mit einem Gitterbalken in Kontakt standen oder weniger Peel-Blot-Iterationen unterzogen wurden.Diese Bilder zeigten das Blotting eines EM-Gitters, das durch die Rückinjektion auf einem Submikron-Filterpapier unter Verwendung eines sehr dünnen Kohlenstofffilms hergestellt wurde. Die Bilder sind Einzelbilder beim ersten Kontakt mit der Membran, 1.000 Millisekunden nach dem Kontakt und 2.000 Millisekunden nach dem Kontakt. Der Pfeil zeigt Gitterquadrate, in denen der Kapillardruck den Kohlenstofffilm zerrissen hat.Die Vermeidung von Brüchen im Kohlenstofffilm und die Kombination von Submikron-Filterpapier mit einem 1,7-Mikroliter-Trehalose-Tropfen zum Absaugen und anschließenden Trennen der Schichten sind wichtige Schritte. Die geschälten Proben werden für die hochauflösende Kryo-EM-Datenerfassung verwendet, gefolgt von der Bildverarbeitung für die Strukturbestimmung. Der Peel-Blot ermöglicht die strukturierte Bestimmung von einschichtigen Protein-2D-Kristallen, die bisher zu dick für Kryo-EM waren.Darüber hinaus kann es verschiedene Proben zu einzelnen Schichten auf Kohlenstofffolie konzentrieren.

Research

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