Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

חלק מעבודה זו נתמך על ידי מענק NIH HL090630 (ISK).

1. שלבי הכנה לטכניקת כתם הקליפה
הערה: ההכנה דורשת שהפריטים הבאים יוצבו בצמוד זה לזה.
<ol><li>ערמו שתי חתיכות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>מניחים סרט פרפין באורך ~8X10 ס"מ בצמוד לנייר הסינון כשהנייר פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>הניחו פי?...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

כתם הקליפה הוא שיטה רבת עוצמה להתגבר על ערימה ועובי של גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים ודגימות דומות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה. החלטה על השימוש בכתם הקליפה תתבסס על פרמטרים ביולוגיים של הדגימה ותדרוש גם הערכה ברגע שיהיה מודל קריו-EM תלת-ממדי זמין. החשיבות הביולוגית של מגעים וגמישות פוטנצ?...

טכניקת ה-peel-blot פותחה על מנת להפריד גבישים דו-ממדיים מוערמים של חלבוני ממברנה לשכבות בודדות כדי לקבל דגימות דקות מתאימות לאיסוף נתונים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של cryo-EM ולהקל על עיבוד תמונה1. הפרוטוקול מתאים באופן דומה לסוגים אחרים של דגימות מולטי-לאמלר וכן להשגת ריכוזי דגימה גבוהים של כל אחד מסוגי הדגימה ברשת מבלי להגדיל את העובי ב-Z.
הפחתת שכבות הדגימה לשכבה אחת מושגת על ידי הפעלת שילוב של לחץ נימי וכוחות גזירה בפרוטוקול המרחיב באופן משמעותי את שיטת ההזרקה האחורית2 ומשנה אותה. שלב ראשון של הכתמה גורם לכריכה הדוקה ולהיצמדות לסרט הפחמן ולפס רשת משני צדי הדגימה הרב-שכבתית במהלך הכתם על תת-מיקרון במקום גודל הנקבובית של נייר הסינון 20-25 מיקרומטר בשיטת ההזרקה האחורית. ההפרדה, או הקילוף, של שכבה בודדת מתרחש כאשר מכריחים את הפרדת השכבות הדחוקות ברגע שהרשת נלחצת אנכית על טיפת טרהלוז, מה שמאלץ את סרט הפחמן להתרחק מפס הרשת (איור 1). מיקום מחדש של סרט הפחמן הרחק מנקודת המגע המקורית עם סרגל הרשת מתרחש בשלב הבא, כאשר הרשת מוכתמת שוב על נייר סינון תת-מיקרוני. ניתן למטב את מספר האיטרציות של שלבים אלה עבור דוגמאות ספציפיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להגדיל את ריכוזי הדגימה תוך הימנעות מצבירה ב- Z. בשל ההסתמכות על הדבקות במוט הרשת וביריעת הפחמן, כמו גם הפרדה כוחנית, גישה זו עשויה שלא להתאים למולקולות שבריריות מאוד כגון חלבונים עדינים ו/או לא יציבים וקומפלקסים של חלבונים.
טכניקת הקליפה אינה דורשת ציוד מיוחד או אספקה יקרה. עם זאת, תחולת דגימות ספציפיות תדרוש שיקולים זהירים של פרמטרים ביולוגיים. ההחלטה קלה יותר עבור גבישים דו-ממדיים מכיוון שסרט פחמן נדרש כדי להבטיח שטוחות, אך מניפולציה באמצעות טכניקת הקליפה-כתם עשויה להשפיע על השלמות הביולוגית של הדגימה או הסדר הגבישי. התאמת טכניקת הקילוף-כתם לחלקיקים בודדים מוגבלת וניתן לבחון אותה עבור אלה הזקוקים לסרט פחמן ויציבים למניפולציה. דגימות עם אינטראקציות ביולוגיות קריטיות בין שכבות עשויות שלא להתאים לאפיון בעזרת טכניקת הקילוף-כתם בשל השיבוש של אינטראקציות כאלה.
טכניקת הקלף-כתם ("peel-blot") ממוטבת במהירות הרבה ביותר על ידי בדיקה וסינון עם כתם שלילי או דגימות לא מוכתמות על ידי TEM בטמפרטורת החדר. לאחר זיהוי המספר האופטימלי של איטרציות כתמי קליפה, ניתן לקבוע את הזמן לשליטה בעובי לפני הוויטריפיקציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

טכניקת הכנת רשת קריו-EM עם כתם קליפה היא שיטת הזרקה אחורית ששונתה באופן משמעותי במטרה להשיג הפחתה בשכבות של דגימות רב שכבתיות. הסרה זו של שכבות לפני הקפאת הדגימה יכולה לסייע בהפחתת עובי הדגימה לרמה המתאימה לאיסוף נתוני cryo-EM, שיפור שטוחות הדגימה והקלה על עיבוד התמונה. טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של ממברנות מולטי-למלריות לשכבות בודדות, של גבישים דו-ממדיים שכבתיים לגבישים בודדים, ושל מבנים מוערמים דמויי יריעות של חלבונים מסיסים כדי שגם אותם ניתן להפריד לשכבות בודדות. עובי הדגימה הגבוה של דגימות מסוג זה מהווה לעתים קרובות בעיות בלתי עבירות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה cryo-EM, במיוחד כאשר יש להטות את שלב המיקרוסקופ לצורך איסוף נתונים. יתר על כן, רשתות של ריכוזים גבוהים של כל אחת מהדגימות הללו יכולות להיות מוכנות לאיסוף נתונים יעיל מכיוון שניתן להגדיל את ריכוז הדגימות לפני הכנת הרשת ולהתאים את טכניקת הקילוף-כתם כדי לגרום לפיזור צפוף של דגימה חד-שכבתית.

ניסוי מוצלח של כתמי קילוף יביא לשכבות בודדות של דגימות בריכוזים גבוהים לעתים קרובות. יש לצפות כי אזורים מסוימים ברוב ריבועי הרשת עדיין יכילו שכבות מרובות, במיוחד במספר קטן יותר של איטרציות של מדרגות הכתמים. עם זאת, רוב ריבועי הרשת יכילו אזורים נרחבים של שכבות בודדות כפי שנצפה עבור גבישים ד...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של דגימות קריו-EM ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגביר את הריכוז ולהקל על עיבוד התמונה. ניתן להגדיל את ריכוזי הדגימה לפני הכנת הרשת, וניתן להתאים את כתם הקליפה כך שיגרום לפיזור צפוף של דגימות חד-שכבתיות לאיסוף נתונים יעיל ביותר. כדי להתחיל, ערמו שתי חתיכות של נייר סינון נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר והניחו סרט פרפין ארוך בצמוד אליו כשהנייר פונה כלפי מעלה.הניחו פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על גבי שתי פיסות נוספות של נייר סינון. מקמו את המלקחיים נגד נימים כאשר הרגל הכפופה פונה כלפי מעלה והרגל הישרה פונה כלפי מטה ובחרו רשת של 600 רשתות עם הצד החלק או המבריק כלפי מעלה. מניחים את המלקחיים על צלחת פטרי או משטח מוגבה אחר כדי למנוע מגע של הרשת הנקייה עם פריטים אחרים.מוציאים את הנייר מסרט הפרפין ומושכים את הצדדים ליצירת שפה קטנה. פיפטה שתי טיפות של 150 מיקרוליטר כך שתמיסת טרהלוז של 4% בערך סנטימטר עד שני סנטימטרים מצד קצר אחד של סרט הפרפין. שתי הטיפות צריכות להיות במרחק של כסנטימטר אחת זו מזו.לאחר מכן, על ספסל נפרד או על הרצפה, לשפוך חנקן נוזלי לתוך מיכל קצף פוליסטירן קטן ומניחים מיכל רשת cryo-EM קטן בחנקן הנוזלי. כסו את מיכל קצף הפוליסטירן במגבונים נטולי מוך. כדי להציף את סרט הפחמן מהנציץ, השתמשו ב-Dumont 5 Ragps וגעו בצד אחד של הנציץ בזווית קלה כלפי מטה על אחת מטיפות תמיסת הטרהלוז.הזיזו את הנציץ כלפי מטה כדי לאפשר למתח המים להתרומם מסרט הפחמן באיטיות. שחררו את הנציץ ברגע שסרט הפחמן צף על פני השטח של הטיפה. בדוק חזותית את סרט הפחמן כדי למנוע שימוש בפחמן עם נזק בצורה של שברים.הכנס את הרשת המוחזקת על ידי מלקחיים אנטי נימים בזווית של 20-30 מעלות לתוך טיפת טרהלוז במיקום סמוך, ולאחר מכן מרכז את הרשת מתחת לסרט הפחמן. הרימו את סרט הפחמן, שמרו על הרשת באותו כיוון והורידו לאט את הרשת על פני השטח של טיפת הטרהלוז השנייה מבלי לשבור את מתח הפנים של הטיפה. פעולה זו תסיר סרט פחמן מיותר שאולי עטף את שפת הרשת לצד המחוספס.סובבו את המלקחיים האנטי-נימים והניחו אותם על צלחת פטרי כשצד הפחמן של הרשת פונה כלפי מטה. פיפטה 1.3 מיקרוליטר של הדגימה לתוך מניסקוס טרהלוז קל על גבי הרשת. לאחר מכן, פיפטה את הפתרון כ 8-10 פעמים לערבב ולהפיץ את trehalose ואת הדגימה משני צידי הרשת.פיפטה אחת או יותר 1.7 טיפות מיקרוליטר של תמיסת טרהלוז על סרט הפרפין תוך כדי דגירה של תמיסת הטרהלוז לדוגמה על הרשת למשך דקה אחת. סובבו את הרשת בחזרה למקומה המקורי כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה ולחצו את הרשת על נייר הסינון התת-מיקרוני באמצעות מלקחיים אנטי-נימיים. לאחר שהתמיסה נספגה על ידי נייר הסינון וסרט הפחמן שוכב שטוח, המתן שלוש שניות לפני הרמת הרשת והזזתה אנכית על טיפת 1.7 מיקרוליטר של תמיסת טרהלוז.ניתן לחזור על שלבים אלה בין אחת לשלוש חזרות או יותר, בהתאם למדגם. הכתים את הרשת על שתי פיסות נייר הסינון ולאחר מכן הרם את הרשת מנייר הסינון. לאחר כ-13 שניות, בהתאם ללחות ולמאגר הדגימה, צללו את הרשת לתוך החנקן הנוזלי במיכל הקלקר הקטן והניחו אותו במיכל הרשת cryo-EM או העבירו אותו ישירות לסינון קריו-EM או לאיסוף נתונים.דגימת גביש דו-ממדית של לויקוטרין C4 סינתאז אנושי הנתון לשיטת כתמי הקליפה מוצגת כאן. האזור שמשמאל לחץ צומצם במידה רבה לגבישים דו-ממדיים חד-שכבתיים באזור מגע בין סרט הפחמן לפס הרשת שהוכתם בקליפה ולאחר מכן הוזז. האזור שמימין לחץ לא הושפע מכתם הקליפה.החצי התחתון של התמונה מייצג את האזורים עם דו-שכבתיות גדולות, בעיקר חד-שכבתיות של ליפידי פוספו, כתוצאה מיישום של כתם הקליפה. החצי העליון לא היה באזור מגע בין מוט הרשת לבין סרט הפחמן, ולכן הכיל ליפוזומים שלמים עם שני דו-שכבתיים פוספוליפידים. ריבוע הרשת של רשת של 400 רשתות שינוי מציג את טביעת הרגל של סרגל הרשת ואת האזורים המוכתמים בקילוף שהתקבלו כתוצאה מכך, כמו גם את האזורים שלא היו במגע עם סרגל רשת או שהיו נתונים לפחות איטרציות של כתמי קילוף.תמונות אלה הראו את הכתם של רשת EM שהוכנה על ידי הזרקה אחורית על נייר סינון תת-מיקרוני באמצעות סרט פחמן דק מאוד. התמונות הן מסגרות בודדות במגע ראשוני עם הממברנה, 1, 000 אלפיות השנייה לאחר מגע, ו -2, 000 אלפיות השנייה לאחר מגע. החץ מציין ריבועי רשת שבהם לחץ נימי קרע את סרט הפחמן.הימנעות משברים בסרט הפחמן ושילוב נייר סינון תת-מיקרוני עם טיפת טרהלוז של 1.7 מיקרוליטר ליניקה ולאחר מכן הפרדת השכבות הם שלבים מרכזיים. הדגימות המוכתמות בקליפה משמשות לאיסוף נתוני cryo-EM ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן לעיבוד תמונה לקביעת המבנה. כתם הקליפה מאפשר קביעה מובנית של גבישי חלבון דו-ממדיים חד-שכבתיים שהיו בעבר עבים מדי עבור cryo-EM.יתר על כן, הוא יכול לרכז דגימות שונות לשכבות בודדות על סרט פחמן.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...