Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
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इस काम का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान एचएल090630 (आईएसके) द्वारा समर्थित था।

1. पील-ब्लोट तकनीक के लिए तैयारी चरण
नोट: तैयारी के लिए निम्नलिखित वस्तुओं को एक दूसरे से सटे रखने की आवश्यकता होती है।
<ol><li>20-25 μm छिद्र आकार फ़िल्टर पेपर के दो टुकड़ों को ढेर करें ( सामग्...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
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	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण के लिए बहु-स्तरित 2 डी क्रिस्टल और इसी तरह के नमूनों के स्टैकिंग और मोटाई को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। पील-ब्लॉट के उपयोग पर निर्णय नमूने क?...

पील-ब्लॉट तकनीक को क्रायो-ईएम 2 डी और 3 डी डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त रूप से पतले नमूने प्राप्त करने और छवि प्रसंस्करण 1 की सुविधा के लिए झिल्ली प्रोटीन के स्टैक्ड दो-आयामी क्रिस्टल को एकल परतों में अलग करने के लिए विकसितकिया गया था। प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के मल्टीलैमेलर नमूनों के साथ-साथ जेड में मोटाई बढ़ाए बिना ग्रिड पर नमूना प्रकार की उच्च नमूना सांद्रता प्राप्त करने के लिए समान रूप से उपयुक्त है।
नमूना परतों को एक परत तक कम करना एक प्रोटोकॉल में केशिका दबाव और कतरन बलों के संयोजन को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो बैक-इंजेक्शन विधि2 पर काफी हद तक फैला हुआ है और संशोधित करता है। पहले ब्लोटिंग चरण के परिणामस्वरूप बैक-इंजेक्शन विधि में 20-25 μm फिल्टर पेपर पोर आकार के बजाय सबमाइक्रोन पर ब्लोटिंग के दौरान कार्बन फिल्म और बहु-स्तरीय नमूने के दोनों ओर एक ग्रिड बार होता है। एक अलग परत का पृथक्करण, या छीलना, सैंडविच परतों के पृथक्करण को मजबूर करने पर होता है जब ग्रिड को ट्रेहलोस ड्रॉप पर लंबवत रूप से दबाया जाता है, जिससे कार्बन फिल्म को ग्रिड बार से दूर कर दिया जाता है (चित्रा 1)। ग्रिड बार के साथ मूल संपर्क बिंदु से दूर कार्बन फिल्म की पुनर्स्थापना अगले चरण में होती है, जब ग्रिड को एक बार फिर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर धब्बा लगाया जाता है। इन चरणों के पुनरावृत्तियों की संख्या को विशिष्ट नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग जेड में एकत्रीकरण से बचने के दौरान नमूना सांद्रता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के पालन के साथ-साथ बलपूर्वक पृथक्करण पर निर्भरता के कारण, यह दृष्टिकोण अत्यधिक नाजुक अणुओं जैसे कि कुछ नाजुक और / या अस्थिर प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।
पील-ब्लॉट तकनीक को न तो विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और न ही महंगी आपूर्ति की। हालांकि, विशिष्ट नमूनों के लिए प्रयोज्यता को जैविक मापदंडों के सावधानीपूर्वक विचार की आवश्यकता होगी। 2 डी क्रिस्टल के लिए निर्णय आसान है क्योंकि फ्लैटनेस सुनिश्चित करने के लिए कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है, फिर भी पील-ब्लॉट तकनीक के माध्यम से हेरफेर नमूने या क्रिस्टलीय क्रम की जैविक अखंडता को प्रभावित कर सकता है। एकल कणों के लिए पील-ब्लॉट तकनीक की उपयुक्तता उन लोगों तक सीमित है और परीक्षण किया जा सकता है जिन्हें कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है और हेरफेर के लिए स्थिर होते हैं। परतों के बीच महत्वपूर्ण जैविक बातचीत वाले नमूने इस तरह के इंटरैक्शन के व्यवधान के कारण पील-ब्लॉट तकनीक की मदद से लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।
पील-ब्लॉट तकनीक ("पील-ब्लोट") को कमरे के तापमान पर टीईएम द्वारा नकारात्मक दाग या बिना दाग वाले नमूनों के साथ परीक्षण और स्क्रीनिंग द्वारा सबसे जल्दी अनुकूलित किया जाता है। एक बार जब पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों की इष्टतम संख्या की पहचान हो जाती है, तो विट्रीफिकेशन से पहले मोटाई को नियंत्रित करने का समय निर्धारित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने की तकनीक बहु-स्तरीय नमूनों की परतों में कमी प्राप्त करने के उद्देश्य से एक महत्वपूर्ण रूप से संशोधित बैक-इंजेक्शन विधि है। ठंड से पहले परतों को हटाने से नमूना मोटाई को क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त स्तर तक कम करने, नमूना फ्लैटनेस में सुधार करने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा में सहायता मिल सकती है। पील-ब्लॉट तकनीक मल्टीलैमेलर झिल्ली को एकल परतों में, स्तरित 2 डी क्रिस्टल को अलग-अलग क्रिस्टल में विभाजित करने की अनुमति देती है, और घुलनशील प्रोटीन की स्टैक्ड, शीट जैसी संरचनाओं को एकल परतों में भी अलग किया जा सकता है। इस प्रकार के नमूनों की उच्च नमूना मोटाई अक्सर क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए दुर्गम समस्याएं पैदा करती है, खासकर जब माइक्रोस्कोप चरण को डेटा संग्रह के लिए झुका होना चाहिए। इसके अलावा, इनमें से किसी भी नमूने की उच्च सांद्रता के ग्रिड को कुशल डेटा संग्रह के लिए तैयार किया जा सकता है क्योंकि ग्रिड तैयारी से पहले नमूना एकाग्रता बढ़ाई जा सकती है और पील-ब्लॉट तकनीक को एकल-स्तरित नमूने के घने वितरण के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है।

एक सफल पील-ब्लॉट प्रयोग के परिणामस्वरूप अक्सर उच्च सांद्रता पर नमूनों की एकल परतें होंगी। यह उम्मीद की जानी चाहिए कि अधिकांश ग्रिड वर्गों में कुछ क्षेत्रों में अभी भी कई परतें होंगी, खासकर पील-ब्लॉट च?...

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The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

पील-ब्लॉट तकनीक एक क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी विधि है जो मोटाई को कम करने, नमूना एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहुस्तरीय और केंद्रित जैविक नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है।

पील-ब्लोट तकनीक: बहु-स्तरित या केंद्रित जैविक नमूनों से एकल परतों को अलग करने के लिए एक क्रायो-ईएम नमूना तैयारी विधि

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

पील-ब्लॉट तकनीक मोटाई को कम करने, एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहु-स्तरित और केंद्रित जैविक क्रायो-ईएम नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है। ग्रिड तैयारी से पहले नमूना सांद्रता बढ़ाई जा सकती है, और पील-ब्लॉट को अत्यधिक कुशल डेटा संग्रह के लिए एकल-स्तरित नमूनों के घने वितरण के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, 20-25 माइक्रोमीटर छिद्र आकार के फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों को ढेर करें और कागज के सामने एक लंबी पैराफिन फिल्म रखें।फिल्टर पेपर के दो अतिरिक्त टुकड़ों के शीर्ष पर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें। एंटी-केशिका बल को मुड़े हुए पैर के साथ रखें और सीधे पैर को नीचे की ओर रखें और चिकनी या चमकदार साइड के साथ 600 जाल ग्रिड का चयन करें। अन्य वस्तुओं के साथ स्वच्छ ग्रिड के संपर्क से बचने के लिए पेट्री डिश या अन्य उभरी हुई सतह पर फोर्सप्स रखें।पैराफिन फिल्म से पेपर निकालें और एक छोटा रिम बनाने के लिए पक्षों को खींचें। पिपेट दो 150 माइक्रोलीटर गिराते हैं जो पैराफिन फिल्म के एक छोटे से हिस्से से लगभग एक से दो सेंटीमीटर पर 4% ट्रेहलोस समाधान है। दो बूंदें लगभग एक सेंटीमीटर अलग होनी चाहिए।इसके बाद, एक अलग बेंच पर या फर्श पर, एक छोटे पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन डालें और तरल नाइट्रोजन में एक छोटा क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर रखें। लिंट-फ्री वाइप्स के साथ पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर को कवर करें। अभ्रक से कार्बन फिल्म को तैरने के लिए, ड्यूमोंट 5 फोर्सप्स का उपयोग करें और ट्रेहलोस घोल की बूंदों में से एक पर नीचे की ओर मामूली कोण पर अभ्रक के एक तरफ स्पर्श करें।अभ्रक को नीचे की ओर ले जाएं ताकि पानी का तनाव धीरे-धीरे कार्बन फिल्म से ऊपर उठ सके। बूंद की सतह पर कार्बन फिल्म तैरने के बाद अभ्रक जारी करें। फ्रैक्चर के रूप में क्षति के साथ कार्बन का उपयोग करने से बचने के लिए कार्बन फिल्म का नेत्रहीन निरीक्षण करें।एंटी-केशिका बल द्वारा पकड़े गए ग्रिड को 20-30 डिग्री कोण पर ट्रेहलोस ड्रॉप में बगल की स्थिति में डालें, और फिर कार्बन फिल्म के नीचे ग्रिड को केंद्रित करें। कार्बन फिल्म उठाएं, ग्रिड को उसी अभिविन्यास में रखें और धीरे-धीरे बूंद की सतह के तनाव को तोड़ने के बिना ट्रेहलोस की दूसरी बूंद की सतह पर ग्रिड को कम करें। यह अनावश्यक कार्बन फिल्म को हटा देगा जो ग्रिड के रिम के चारों ओर खुरदरी तरफ लपेटा जा सकता है।एंटी-केशिका बलों को घुमाएं और उन्हें ग्रिड के कार्बन पक्ष के साथ पेट्री डिश पर रखें। ग्रिड के शीर्ष पर मामूली ट्रेहलोस मेनिस्कस में नमूने के 1.3 माइक्रोलीटर पिपेट। फिर, ट्रेहलोस और नमूने को ग्रिड के दोनों किनारों पर मिलाने और वितरित करने के लिए समाधान को लगभग 8-10 बार पिपेट करें।एक मिनट के लिए ग्रिड पर नमूना ट्रेहलोस समाधान को इनक्यूबेट करते समय पैराफिन फिल्म पर ट्रेहलोस समाधान की एक या अधिक 1.7 माइक्रोलीटर बूंदें डालें। ग्रिड को कार्बन फिल्म के सामने अपनी मूल स्थिति में वापस घुमाएं और एंटी-केशिका बल का उपयोग करके ग्रिड को सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर दबाएं। एक बार जब समाधान फिल्टर पेपर द्वारा अवशोषित हो जाता है और कार्बन फिल्म सपाट पड़ी होती है, तो ग्रिड को उठाने से पहले तीन सेकंड तक प्रतीक्षा करें और इसे ट्रेहलोस समाधान की 1.7 माइक्रोलीटर बूंद पर लंबवत रूप से ले जाएं।नमूने के आधार पर इन चरणों को एक से तीन पुनरावृत्ति या अधिक के बीच दोहराया जा सकता है। फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों पर ग्रिड को ब्लोट करें और फिर फिल्टर पेपर से ग्रिड उठाएं। लगभग 13 सेकंड के बाद, आर्द्रता और नमूना बफर के आधार पर, ग्रिड को छोटे स्टायरोफोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन में डुबोएं और इसे क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर में रखें या इसे सीधे क्रायो-ईएम स्क्रीनिंग या डेटा संग्रह के लिए स्थानांतरित करें।पील-ब्लॉट विधि के अधीन मानव ल्यूकोट्रिएन सी 4 सिंथेज़ का एक 2 डी क्रिस्टल नमूना यहां दिखाया गया है। तीर के बाईं ओर का क्षेत्र काफी हद तक कार्बन फिल्म और ग्रिड बार के बीच एक संपर्क क्षेत्र में एकल-स्तरित 2 डी क्रिस्टल तक कम हो गया था जिसे छील-धब्बा किया गया था और फिर स्थानांतरित कर दिया गया था। तीर के दाईं ओर का क्षेत्र छिलके-धब्बा से प्रभावित नहीं था।छवि का निचला आधा हिस्सा पील-ब्लोट के आवेदन के परिणामस्वरूप बड़े, ज्यादातर एकल-स्तरित फॉस्फो लिपिड बाइलेयर वाले क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी आधा हिस्सा ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के बीच संपर्क क्षेत्र में नहीं था, और इस प्रकार इसमें दो फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के साथ पूर्ण लिपोसोम शामिल थे। 400 जाल ग्रिड का ग्रिड वर्ग ग्रिड बार के पदचिह्न और परिणामस्वरूप छिलके-धब्बा वाले क्षेत्रों के साथ-साथ उन क्षेत्रों को दर्शाता है जो ग्रिड बार के संपर्क में नहीं थे या कम पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों के अधीन थे।इन छवियों में बहुत पतली कार्बन फिल्म का उपयोग करके एक सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर बैक इंजेक्शन द्वारा तैयार ईएम ग्रिड के सोख्ता को दिखाया गया था। छवियां झिल्ली के साथ प्रारंभिक संपर्क में एकल फ्रेम हैं, संपर्क के 1,000 मिलीसेकंड बाद, और संपर्क के बाद 2,000 मिलीसेकंड। तीर ग्रिड वर्गों को इंगित करता है जहां केशिका दबाव ने कार्बन फिल्म को तोड़ दिया।कार्बन फिल्म में फ्रैक्चर से बचना और सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर को 1.7 माइक्रोलीटर ट्रेहलोस ड्रॉप के साथ मिलाकर सक्शन करना और फिर परतों को अलग करना महत्वपूर्ण कदम हैं। छिलके-धब्बेदार नमूनों का उपयोग उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए किया जाता है, इसके बाद संरचना निर्धारण के लिए छवि प्रसंस्करण होता है। पील-ब्लॉट एकल-स्तरित प्रोटीन 2 डी क्रिस्टल के संरचित निर्धारण की अनुमति देता है जो पहले क्रायो-ईएम के लिए बहुत मोटे थे।इसके अलावा, यह कार्बन फिल्म पर एकल परतों में विभिन्न नमूनों को केंद्रित कर सकता है।

Research

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

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