Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

En del av dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend HL090630 (ISK).

1. Forberedelsestrinn for peel-blot-teknikken
MERK: Forberedelse krever at følgende elementer plasseres ved siden av hverandre.
<ol><li>Stable to stykker av 20-25 μm pore størrelse filter papir (se tabell over materialer).</li>
	<li>Plasser en ~8 cm x 10 cm lang parafinfilm ved siden av filterpapiret med papiret vendt opp.</li>
	<li>Legg et stykke submikronfilterpapir på toppen av to ekstra stykker # 4 filterpapir (figur <st...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Peel-blot er en kraftig metode for å overvinne stabling og tykkelse av flerlags 2D-krystaller og lignende prøver for kryo-EM-datainnsamling og bildebehandling. En beslutning om bruk av peel-blot vil være basert på biologiske parametere i prøven og vil også kreve vurdering når en 3D cryo-EM-modell er tilgjengelig. Den biologiske betydningen av kontakter og potensiell fleksibilitet i kontaktregioner vil være særlig viktig i denne vurderingen.
Antallet peel-blots vil i utgangspunktet bli...

Peel-blot-teknikken ble utviklet for å skille stablede todimensjonale krystaller av membranproteiner i enkeltlag for å oppnå passende tynne prøver for kryo-EM 2D- og 3D-datainnsamling og lette bildebehandling1. Protokollen er tilsvarende egnet for andre typer multilamellære prøver, samt for å oppnå høye prøvekonsentrasjoner av begge prøvetyper på rutenettet uten å øke tykkelsen i Z.
Reduksjon av prøvelag til ett lag oppnås ved å påføre en kombinasjon av kapillærtrykk og skjærkrefter i en protokoll som vesentlig strekker seg på og endrer tilbakeinjeksjonsmetoden2. Et første blotting-trinn resulterer i tett sandwiching og overholdelse av karbonfilmen og en gitterstang på hver side av flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25μm filterpapirporestørrelse i tilbakeinjeksjonsmetoden. Separasjonen, eller peeling, av et enkelt lag skjer ved å tvinge separasjonen av de sammenklemte lagene når rutenettet presses vertikalt på en trehalosefall, og tvinger karbonfilmen bort fra rutenettstangen (figur 1). Flytting av karbonfilmen bort fra det opprinnelige kontaktpunktet med rutenettet skjer i neste trinn, når rutenettet igjen er blottet på submikronfilterpapir. Antall gjentakelser av disse trinnene kan optimaliseres for bestemte prøver. Videre kan protokollen brukes til å øke prøvekonsentrasjonene samtidig som aggregering i Z. På grunn av avhengigheten av overholdelse av gitterstangen og karbonfilmen, samt kraftig separasjon, kan denne tilnærmingen ikke være egnet for svært skjøre molekyler som visse delikate og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.
Peel-blot-teknikken krever verken spesialutstyr eller dyre forsyninger. Anvendelse på spesifikke prøver vil imidlertid kreve nøye vurderinger av biologiske parametere. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da karbonfilm er nødvendig for å sikre flathet, men manipulering via peel-blot-teknikken kan påvirke den biologiske integriteten til prøven eller krystallinsk rekkefølge. Egnetheten til peel-blot-teknikken til enkeltpartikler er begrenset til og kan testes for de som krever karbonfilm og er stabile for manipulering. Prøver med kritiske biologiske interaksjoner mellom lag kan ikke være egnet for karakterisering ved hjelp av peel-blot-teknikken på grunn av forstyrrelsen av slike interaksjoner.
Peel-blot-teknikken ("peel-blot") optimaliseres raskest ved testing og screening med negativ flekk eller ufargede prøver av TEM ved romtemperatur. Når det optimale antallet peel-blot-iterasjoner er identifisert, kan tiden for å kontrollere tykkelsen før vitrifisering bestemmes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Peel-blot cryo-EM gridpreparasjonsteknikken er en betydelig modifisert tilbakeinjeksjonsmetode med sikte på å oppnå en reduksjon i lag med flerlagsprøver. Denne fjerningen av lag før dypping kan bidra til å redusere prøvetykkelsen til et nivå som er egnet for innsamling av kryo-EM-data, forbedre prøveflatheten og lette bildebehandlingen. Peel-blot-teknikken tillater separasjon av multilamellære membraner i enkeltlag, av lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller, og av stablede, arklignende strukturer av oppløselige proteiner som også skal separeres i enkeltlag. Den høye prøvetykkelsen på denne typen prøver utgjør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-datainnsamling og cryo-EM-bildebehandling, spesielt når mikroskoptrinnet må vippes for datainnsamling. Videre kan gitter med høye konsentrasjoner av noen av disse prøvene fremstilles for effektiv datainnsamling, siden prøvekonsentrasjonen før klargjøring av rutenettet kan økes og peel-blot-teknikken justeres for å resultere i en tett fordeling av enkeltlagsprøver.

Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag med prøver i ofte høye konsentrasjoner. Det er å forvente at noen regioner i de fleste rutenettfirkanter fortsatt vil inneholde flere lag, spesielt ved færre antall iterasjoner av peel-blot-trinnene. De fleste rutenettkvadrater vil imidlertid inneholde store områder av enkeltlag som observert for 2D-krystaller av human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (lagt til i trinn 3.2, figur 3).<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gridpreparasjonsmetode som gjør det mulig å skille flerlags og konsentrerte biologiske prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke prøvekonsentrasjonen og lette bildebehandlingen.

Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Peel-blot-teknikken tillater separasjon av flerlags og konsentrerte biologiske cryo-EM-prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke konsentrasjonen og lette bildebehandlingen. Prøvekonsentrasjonene kan økes før klargjøring av gitteret, og peeling-flekken kan justeres for å resultere i en tett fordeling av enkeltlagsprøver for svært effektiv datainnsamling. For å begynne, stable to stykker 20-25 mikrometer porestørrelse filterpapir og legg en lang parafinfilm ved siden av den med papiret vendt opp.Legg et stykke submikronfilterpapir på toppen av to ekstra stykker filterpapir. Plasser antikapillær tang med det bøyde benet vendt opp og det rette benet vendt ned og velg et 600 nettinggitter med den glatte eller skinnende siden opp. Plasser tangen på en petriskål eller annen hevet overflate for å unngå kontakt med det rene rutenettet med andre gjenstander.Fjern papiret fra parafinfilmen og trekk sidene for å lage en liten kant. Pipette to 150 mikroliter dråper så 4% trehalose løsning på rundt en til to centimeter fra den ene kortsiden av parafinfilmen. De to dråpene skal være rundt en centimeter fra hverandre.Deretter, på en separat benk eller på gulvet, hell flytende nitrogen i en liten polystyrenskumbeholder og legg en liten kryo-EM-gitterbeholder i flytende nitrogen. Dekk polystyrenskumbeholderen med lofrie kluter. For å flyte karbonfilmen fra glimmer, bruk Dumont 5 Tang og berør den ene siden av glimmeren i en liten vinkel nedover på en av dråpene trehaloseløsning.Beveg glimmeren nedover for å la vannspenningen løfte seg sakte av karbonfilmen. Slipp glimmeren når karbonfilmen flyter på overflaten av dråpen. Inspiser karbonfilmen visuelt for å unngå å bruke karbon med skade i form av brudd.Sett inn rutenettet som holdes av antikapillær tang i en 20-30 graders vinkel i et trehalosefall i en posisjon ved siden av, og sentrer deretter rutenettet under karbonfilmen. Plukk opp karbonfilmen, hold rutenettet i samme retning og senk rutenettet sakte ned på overflaten av den andre dråpen trehalose uten å bryte dråpens overflatespenning. Dette vil fjerne unødvendig karbonfilm som kan ha viklet seg rundt kanten av rutenettet til den grove siden.Roter antikapillærtangene og legg dem på en petriskål med karbonsiden av rutenettet vendt nedover. Pipette 1,3 mikroliter av prøven inn i den lille trehalose menisken på toppen av rutenettet. Pipetter deretter løsningen ca. 8-10 ganger for å blande og fordele trehalosen og prøven på begge sider av rutenettet.Pipetter en eller flere 1,7 mikroliter dråper trehaloseoppløsning på parafinfilmen mens du inkuberer prøven trehaloseoppløsning på rutenettet i ett minutt. Roter rutenettet tilbake til sin opprinnelige posisjon med karbonfilmen vendt opp og trykk rutenettet på submikronfilterpapiret ved hjelp av antikapillær tang. Når løsningen er absorbert av filterpapiret og karbonfilmen ligger flatt, vent i tre sekunder før du løfter rutenettet og beveger det vertikalt på 1,7 mikroliter dråpe trehaloseoppløsning.Disse trinnene kan gjentas mellom en til tre gjentakelser eller mer, avhengig av prøven. Fjern rutenettet på de to stykkene filterpapir, og løft deretter rutenettet fra filterpapiret. Etter ca. 13 sekunder, avhengig av fuktighet og prøvebuffer, dypp gitteret i det flytende nitrogenet i den lille isoporbeholderen og legg det i cryo-EM-nettbeholderen eller overfør det direkte for cryo-EM-screening eller datainnsamling.En 2D-krystallprøve av human leukotrien C4-syntase utsatt for peel-blot-metoden er vist her. Regionen til venstre for pilen ble i stor grad redusert til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellom karbonfilmen og rutenettstangen som ble skrellet og deretter forskjøvet. Området til høyre for pilen ble ikke påvirket av peeling-blot.Den nedre halvdelen av bildet representerer regionene med store, for det meste enkeltlags fosfolipid-dobbeltlag som følge av påføring av peel-blot. Den øvre halvdelen var ikke i en kontaktsone mellom gitterstangen og karbonfilmen, og inneholdt dermed komplette liposomer med to fosfolipid-dobbeltlag. Rutenettet i et rutenett med 400 nett viser fotavtrykket til rutenettet og de resulterende skrellflekkede områdene, samt områdene som ikke var i kontakt med en rutenettstang eller utsatt for færre gjentakelser av skrellflekker.Disse bildene viste blotting av et EM-rutenett utarbeidet av tilbakeinjeksjonen på et submikronfilterpapir ved bruk av veldig tynn karbonfilm. Bildene er enkeltrammer ved første kontakt med membranen, 1.000 millisekunder etter kontakt og 2.000 millisekunder etter kontakt. Pilen indikerer rutenettfirkanter der kapillærtrykket brøt karbonfilmen.Å unngå brudd i karbonfilmen og kombinere submikronfilterpapir med et 1,7 mikroliter trehalosefall til sug og deretter skille lagene er viktige trinn. De skrell-blottede prøvene brukes til høyoppløselig innsamling av kryo-EM-data, etterfulgt av bildebehandling for strukturbestemmelse. Skrellflekken muliggjør strukturert bestemmelse av enkeltlags protein 2D-krystaller som tidligere var for tykke for kryo-EM.Videre kan den konsentrere forskjellige prøver i enkeltlag på karbonfilm.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: En metode for å fange og løse protein komplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og bibliotekforberedelsesprotokoll for NGS-sekvensering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepreparering ved hjelp av en Lipid Monolayer-metode for elektronkrystallografiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...