Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

Часть этой работы была поддержана грантом NIH HL090630 (ISK).

1. Этапы подготовки к технике пилинг-блоттинг
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка требует размещения следующих предметов рядом друг с другом.
<ol><li>Сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Поместите парафиновую пленку д...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки по?...

Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений1. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.
Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции2. Первая стадия промокшивания приводит к плотному сэндвичингу и сцеплению с углеродной пленкой и сетчатой полосой по обе стороны многослойного образца во время промокания на субмикроне, а не к размеру пор фильтровальной бумаги 20-25 мкм в методе обратного впрыска. Разделение или отслаивание отдельного слоя происходит при принудительном разделении зажатых слоев после того, как сетка прижимается вертикально к трегалозной капле, выталкивая углеродную пленку от стержня сетки (рисунок 1). Перемещение углеродной пленки в сторону от исходной точки контакта с стержнем сетки происходит на следующем этапе, когда сетка снова смачивается на субмикронной фильтровальной бумаге. Количество итераций этих шагов может быть оптимизировано для конкретных образцов. Кроме того, протокол может быть использован для увеличения концентраций образцов, избегая при этом агрегации в Z. Из-за зависимости от сцепления с сетчатого стержня и углеродной пленки, а также принудительного разделения, этот подход может не подходить для очень хрупких молекул, таких как определенные деликатные и/или нестабильные белки и белковые комплексы.
Техника пилинга не требует ни специализированного оборудования, ни дорогостоящих расходных материалов. Однако применимость к конкретным образцам потребует тщательного рассмотрения биологических параметров. Решение проще для 2D-кристаллов, поскольку для обеспечения плоскостности требуется углеродная пленка, но манипуляции с помощью метода пилинга могут повлиять на биологическую целостность образца или кристаллический порядок. Пригодность метода пилинга-блоттинга к одиночным частицам ограничена и может быть проверена на те, которые требуют углеродной пленки и устойчивы к манипуляциям. Образцы с критическими биологическими взаимодействиями между слоями могут не подходить для характеристики с помощью метода пилинга-блоттинга из-за нарушения таких взаимодействий.
Метод пилинга-блоттинга («пилинг-блотт») наиболее быстро оптимизируется путем тестирования и скрининга с отрицательным пятном или неокрашенными образцами ТЭМ при комнатной температуре. После того, как оптимальное количество итераций шелушения-пятна было определено, можно определить время для контроля толщины до витрификации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.

Успешный эксперимент с шелушением приведет к созданию отдельных слоев образцов в часто высоких концентрациях. Следует ожидать, что некоторые области в большинстве квадратов сетки по-прежнему будут содержать несколько слоев, особенно при меньшем количестве итераций шагов отслаивания...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.

Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Метод пилинга позволяет разделить многослойные и концентрированные биологические крио-ЭМ-образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации и облегчения обработки изображений. Концентрации образцов могут быть увеличены до подготовки сетки, а отшелушивание может быть скорректировано таким образом, чтобы получить плотное распределение однослойных образцов для высокоэффективного сбора данных. Для начала сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 микрометров и поместите рядом с ней длинную парафиновую пленку бумагой, обращенной вверх.Поместите кусочек субмикронной фильтровальной бумаги поверх двух дополнительных кусочков фильтровальной бумаги. Расположите антикапиллярные щипцы с согнутой ногой вверх и прямой ногой вниз и выберите сетку из 600 сеток гладкой или блестящей стороной вверх. Поместите щипцы на чашку Петри или другую приподнятую поверхность, чтобы избежать контакта чистой сетки с другими предметами.Снимите бумагу с парафиновой пленки и потяните по бокам, чтобы создать небольшой ободок. Пипетка две капли по 150 микролитров, так что 4% раствор трегалозы на расстоянии от одного до двух сантиметров с одной короткой стороны парафиновой пленки. Две капли должны находиться на расстоянии около одного сантиметра друг от друга.Затем на отдельной скамейке или на полу налейте жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите небольшой контейнер с крио-ЭМ-сеткой в жидкий азот. Накройте контейнер из пенополистирола безворсовыми салфетками. Чтобы вытащить углеродную пленку из слюды, используйте щипцы Дюмона 5 и коснитесь одной стороны слюды под небольшим углом вниз на одной из капель раствора трегалозы.Переместите слюду вниз, чтобы натяжение воды медленно отрывало углеродную пленку. Выпустите слюду, как только углеродная пленка всплывет на поверхности капли. Визуально осмотрите углеродную пленку, чтобы избежать использования углерода с повреждениями в виде трещин.Вставьте сетку, удерживаемую антикапиллярными щипцами под углом 20-30 градусов, в трегалозную каплю в положении, прилегающем к углеродной пленке, а затем центрируйте сетку под углеродной пленкой. Возьмите углеродную пленку, держите сетку в той же ориентации и медленно опустите сетку на поверхность второй капли трегалозы, не нарушая поверхностного натяжения капли. Это удалит ненужную углеродную пленку, которая, возможно, обернута вокруг края сетки в шероховатую сторону.Поверните антикапиллярные щипцы и поместите их на чашку Петри углеродной стороной сетки лицом вниз. Пипетка 1,3 микролитра образца в легкий трегалозный мениск поверх сетки. Затем пипеткой раствор примерно 8-10 раз перемешать и распределить трегалозу и образец по обеим сторонам сетки.Пипетка одной или более 1,7 микролитровых капель раствора трегалозы на парафиновую пленку при инкубации образца раствора трегалозы на сетке в течение одной минуты. Поверните сетку обратно в исходное положение с помощью углеродной пленки, обращенной вверх, и прижмите сетку к субмикронной фильтровальной бумаге с помощью антикапиллярных щипцов. После того, как раствор был поглощен фильтровальной бумагой и углеродная пленка лежит ровно, подождите три секунды, прежде чем поднять сетку и переместить ее вертикально на 1,7 микролитр капли раствора трегалозы.Эти шаги могут быть повторены от одного до трех повторений или более, в зависимости от образца. Промокните сетку на двух листах фильтровальной бумаги, а затем снимите сетку с фильтровальной бумаги. Примерно через 13 секунд, в зависимости от влажности и буфера образца, погрузите сетку в жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите его в контейнер для крио-ЭМ сетки или передайте его непосредственно для крио-ЭМ скрининга или сбора данных.Здесь показан 2D образец кристалла человеческой лейкотриен-С4-синтазы, подвергнутой методу пилинга-блоттинга. Область слева от стрелки была в значительной степени уменьшена до однослойных 2D-кристаллов в области контакта между углеродной пленкой и полосой сетки, которая была очищена, а затем смещена. Область справа от стрелки не была затронута шелушением-пятном.Нижняя половина изображения представляет собой области с большими, в основном однослойными фосфолипидными бислоями, возникающими в результате нанесения пилинга-блоттинга. Верхняя половина не находилась в зоне контакта между стержнем сетки и углеродной пленкой и, таким образом, содержала полные липосомы с двумя фосфолипидными бислоями. Квадрат сетки сетки из 400 ячеек показывает площадь полосы сетки и результирующие отслаивающиеся области, а также области, которые не контактировали с полосой сетки или подвергались меньшему количеству итераций шелушения.Эти изображения показали промокание ЭМ-сетки, подготовленной обратной инъекцией на субмикронной фильтровальной бумаге с использованием очень тонкой углеродной пленки. Изображения представляют собой одиночные кадры при первоначальном контакте с мембраной, 1 000 миллисекунд после контакта и 2 000 миллисекунд после контакта. Стрелка указывает квадраты сетки, где капиллярное давление разорвало углеродную пленку.Предотвращение трещин в углеродной пленке и объединение субмикронной фильтровальной бумаги с 1,7 микролитром трегалозной капли для всасывания, а затем разделения слоев являются ключевыми шагами. Отслаивающиеся образцы используются для сбора крио-ЭМ данных высокого разрешения с последующей обработкой изображений для определения структуры. Шелушение-пятно позволяет структурированно определять однослойные белковые 2D-кристаллы, которые ранее были слишком толстыми для крио-ЭМ.Кроме того, он может концентрировать различные образцы в отдельные слои на углеродной пленке.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq in Bacteria: коллекция образцов и протокол подготовки библиотеки для секвенирования NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...