Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

En del av detta arbete stöddes av NIH-bidraget HL090630 (ISK).

1. Förberedelsesteg för peel-blot-tekniken
OBS: Förberedelse kräver att följande föremål placeras intill varandra.
<ol><li>Stapla två bitar av filterpapper i porstorlek 20-25 μm (se Materialförteckning).</li>
	<li>Placera en ~ 8 cm x 10 cm lång paraffinfilm intill filterpapperet med papperet uppåt.</li>
	<li>Lägg en bit submikronfilterpapper ovanpå ytterligare två bitar av filterpapper #4 (figur 1-1</stron...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Peel-blot är en kraftfull metod för att övervinna stapling och tjocklek på flerskiktiga 2D-kristaller och liknande prover för kryo-EM-datainsamling och bildbehandling. Ett beslut om användningen av peel-blotet kommer att baseras på biologiska parametrar i provet och kommer också att kräva bedömning när en 3D-kryo-EM-modell är tillgänglig. Kontakternas biologiska betydelse och kontaktregionernas potentiella flexibilitet kommer att vara särskilt viktiga i denna bedömning.
Antalet ...

Peel-blot-tekniken utvecklades för att separera staplade tvådimensionella kristaller av membranproteiner i enkla lager för att erhålla lämpligt tunna prover för kryo-EM 2D- och 3D-datainsamling och underlätta bildbehandling1. Protokollet är på liknande sätt lämpligt för andra typer av multilamellära prover samt för att uppnå höga provkoncentrationer av endera provtypen på gallret utan att öka tjockleken i Z.
Reduktion av provskikt till ett lager uppnås genom att applicera en kombination av kapillärtryck och skjuvkrafter i ett protokoll som väsentligt sträcker sig på och modifierar backinjektionsmetoden2. Ett första blottningssteg resulterar i tät inklämning och fastsättning på kolfilmen och en gallerstång på vardera sidan av det flerskiktade provet under blottning på submikron snarare än 20-25 μm filterpappersporstorlek i backinjektionsmetoden. Separationen, eller skalningen, av ett enskilt skikt sker när man tvingar separationen av de inklämda skikten när gallret pressas vertikalt på en trehalosdroppe, vilket tvingar kolfilmen bort från gallerstången (figur 1). Omplacering av kolfilmen bort från den ursprungliga kontaktpunkten med gallerstången sker i nästa steg, när gallret återigen blottas på submikronfilterpapper. Antalet iterationer av dessa steg kan optimeras för specifika exempel. Dessutom kan protokollet användas för att öka provkoncentrationerna samtidigt som aggregering i Z. På grund av beroendet av vidhäftning till gallerstången och kolfilmen samt kraftfull separation kanske detta tillvägagångssätt inte är lämpligt för mycket ömtåliga molekyler såsom vissa känsliga och / eller instabila proteiner och proteinkomplex.
Peel-blot-tekniken kräver varken specialutrustning eller dyra förnödenheter. Tillämplighet på specifika prover kommer dock att kräva noggranna överväganden av biologiska parametrar. Beslutet är lättare för 2D-kristaller eftersom kolfilm krävs för att säkerställa planhet, men manipulation via peel-blot-tekniken kan påverka provets biologiska integritet eller kristallin ordning. Peel-blot-teknikens lämplighet för enstaka partiklar är begränsad till och kan testas för de som kräver kolfilm och är stabila för manipulation. Prover med kritiska biologiska interaktioner mellan lager kanske inte är lämpliga för karakterisering med hjälp av peel-blot-tekniken på grund av störningen av sådana interaktioner.
Peel-blot-tekniken ("peel-blot") optimeras snabbast genom testning och screening med negativ fläck eller ostoppade prover av TEM vid rumstemperatur. När det optimala antalet peel-blot-iterationer har identifierats kan tiden för att kontrollera tjockleken före förglasning bestämmas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Peel-blot cryo-EM-gallerberedningstekniken är en signifikant modifierad back-injektionsmetod med målet att uppnå en minskning av lager av flerskiktiga prover. Detta avlägsnande av lager före doppfrysning kan hjälpa till att minska provtjockleken till en nivå som är lämplig för kryo-EM-datainsamling, förbättra provets planhet och underlätta bildbehandling. Peel-blot-tekniken gör det möjligt att separera multilamellära membran i enstaka lager, av skiktade 2D-kristaller i enskilda kristaller och av staplade, arkliknande strukturer av lösliga proteiner som också ska separeras i enstaka lager. Den höga provtjockleken hos dessa typer av prover utgör ofta oöverstigliga problem för kryo-EM-datainsamling och kryo-EM-bildbehandling, särskilt när mikroskopsteget måste lutas för datainsamling. Dessutom kan rutnät med höga koncentrationer av något av dessa prover förberedas för effektiv datainsamling eftersom provkoncentrationen före beredning av rutnät kan ökas och peel-blot-tekniken justeras för att resultera i en tät fördelning av enskiktsprov.

Ett framgångsrikt peel-blot-experiment kommer att resultera i enstaka lager av prover i ofta höga koncentrationer. Det kan förväntas att vissa regioner i de flesta rutnätsrutor fortfarande kommer att innehålla flera lager, särskilt vid färre antal iterationer av peel-blot-stegen. Majoriteten av rutnätsrutorna kommer dock att innehålla omfattande regioner med enstaka lager som observerats för 2D-kristaller av humant leukotrien C4-syntas (figur 2) och liposomer (läggs till i steg 3.2, <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-tekniken är en kryo-EM-gallerberedningsmetod som möjliggör separation av flerskiktiga och koncentrerade biologiska prover i enstaka lager för att minska tjockleken, öka provkoncentrationen och underlätta bildbehandling.

Peel-blot-tekniken: en kryo-EM-provberedningsmetod för att separera enstaka lager från flerskiktiga eller koncentrerade biologiska prover

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Peel-blot-tekniken möjliggör separering av flerskiktiga och koncentrerade biologiska kryo-EM-prover i enstaka lager för att minska tjockleken, öka koncentrationen och underlätta bildbehandling. Provkoncentrationerna kan ökas före beredning av rutnätet, och skalfläcken kan justeras för att resultera i en tät fördelning av enskiktsprover för mycket effektiv datainsamling. Börja med att stapla två bitar av 20-25 mikrometer porstorlek filterpapper och placera en lång paraffinfilm intill den med papperet uppåt.Lägg en bit submikronfilterpapper ovanpå ytterligare två bitar filterpapper. Placera de antikapillära tångarna med det böjda benet uppåt och det raka benet nedåt och välj ett 600-nätsgaller med den släta eller blanka sidan uppåt. Placera tången på en petriskål eller annan upphöjd yta för att undvika kontakt med det rena gallret med andra föremål.Ta bort papperet från paraffinfilmen och dra i sidorna för att skapa en liten kant. Pipettera två 150 mikroliter droppar så 4% trehaloslösning vid cirka en till två centimeter från en kortsida av paraffinfilmen. De två dropparna ska vara cirka en centimeter från varandra.Häll sedan flytande kväve i en liten polystyrenskumbehållare på en separat bänk eller på golvet och placera en liten kryo-EM-gallerbehållare i flytande kväve. Täck polystyrenskumbehållaren med luddfria våtservetter. För att flyta kolfilmen från glimmer, använd Dumont 5 Forceps och rör vid ena sidan av glimmer i en liten vinkel nedåt på en av dropparna trehaloslösning.Flytta glimmern nedåt för att låta vattenspänningen sakta lyfta av kolfilmen. Släpp glimmer när kolfilmen flyter på droppens yta. Inspektera kolfilmen visuellt för att undvika att använda kol med skador i form av frakturer.Sätt in gallret som hålls av antikapillärtången i en 20-30 graders vinkel i en trehalosdroppe i en position intill och centrera sedan gallret under kolfilmen. Plocka upp kolfilmen, håll gallret i samma riktning och sänk långsamt ner gallret på ytan av den andra droppen trehalos utan att bryta droppens ytspänning. Detta tar bort onödig kolfilm som kan ha lindats runt gallrets kant till den grova sidan.Rotera de antikapillära tångarna och lägg dem på en petriskål med kolsidan av gallret nedåt. Pipettera 1,3 mikroliter av provet i den lilla trehalosmenisken ovanpå gallret. Pipettera sedan lösningen ungefär 8-10 gånger för att blanda och fördela trehalos och provet på båda sidor av gallret.Pipettera en eller flera 1,7 mikroliter droppar trehaloslösning på paraffinfilmen medan provtrehaloslösningen inkuberas på gallret i en minut. Vrid tillbaka gallret till sitt ursprungliga läge med kolfilmen uppåt och tryck rutnätet på submikronfilterpapperet med hjälp av de antikapillära tångarna. När lösningen har absorberats av filterpapperet och kolfilmen ligger platt, vänta i tre sekunder innan du lyfter gallret och flyttar det vertikalt på 1,7 mikroliter droppe trehaloslösning.Dessa steg kan upprepas mellan en till tre upprepningar eller fler, beroende på provet. Torka gallret på de två bitarna av filterpapper och lyft sedan gallret från filterpapperet. Efter cirka 13 sekunder, beroende på fuktighet och provbuffert, kasta gallret i det flytande kvävet i den lilla styrofoambehållaren och placera det i kryo-EM-gallerbehållaren eller överför det direkt för kryo-EM-screening eller datainsamling.Ett 2D-kristallprov av humant leukotrien C4-syntas som utsätts för peel-blot-metoden visas här. Regionen till vänster om pilen reducerades till stor del till enskiktiga 2D-kristaller i ett kontaktområde mellan kolfilmen och gallerstången som skalblottades och sedan förskjutits. Regionen till höger om pilen påverkades inte av skalfläcken.Den nedre halvan av bilden representerar regionerna med stora, mestadels enskiktade fosfolipiddubbelskikt som härrör från appliceringen av skalfläcken. Den övre halvan befann sig inte i en kontaktzon mellan gallerstången och kolfilmen och innehöll således fullständiga liposomer med två fosfolipid-dubbelskikt. Rutnätskvadraten i ett rutnät med 400 maskor visar fotavtrycket för rutnätsstången och de resulterande skalblottade regionerna samt de regioner som inte var i kontakt med en rutnätsstång eller utsattes för färre iterationer av skalfläckar.Dessa bilder visade blottning av ett EM-rutnät som framställts genom bakinjektionen på ett submikronfilterpapper med mycket tunn kolfilm. Bilderna är enkla ramar vid initial kontakt med membranet, 1 000 millisekunder efter kontakt och 2 000 millisekunder efter kontakt. Pilen indikerar rutnätsrutor där kapillärtrycket bröt kolfilmen.Att undvika sprickor i kolfilmen och kombinera submikronfilterpapper med en 1,7 mikroliter trehalosdroppe till sug och sedan separera skikten är viktiga steg. De skalblottade proverna används för högupplöst kryo-EM-datainsamling, följt av bildbehandling för strukturbestämning. Peel-blotet möjliggör strukturerad bestämning av enskiktiga protein 2D-kristaller som tidigare var för tjocka för kryo-EM.Dessutom kan den koncentrera olika prover till enstaka lager på kolfilm.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Ett förfarande för infångning och Lösa proteinkomplex i biologiska prover

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq i bakterier: ett protokoll för insamling av prover och biblioteksförberedelser för NGS-sekvensering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Provberedning med lipidmonalayermetod för elektronkristallkroografiska studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...