Name: the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

Bu çalışmanın bir kısmı NIH hibesi HL090630 (ISK) tarafından desteklenmiştir.

1. Peel-blot tekniği için hazırlık adımları
NOT: Hazırlık, aşağıdaki öğelerin birbirine bitişik olarak yerleştirilmesini gerektirir.
<ol><li>İki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin (bkz.</li>
	<li>Filtre kağıdının bitişiğine, kağıt yukarı bakacak şekilde ~8 cm x 10 cm uzunluğunda bir parafin film yerleştirin.</li>
	<li>İki adet #4 filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı y...

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.
<p class=...

Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir1. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z'deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.
Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi2'yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z'de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.
Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.
Soyma-leke tekniği ("soyma-leke"), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>600-mesh grids</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2060-C-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-capillary forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon to coat mica</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.&#160; High-resolution data is collected at 300 kV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumpont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid box for cryo-EM storage</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>160-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>56</td>
			<td>The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.&#160; The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.&#160; Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submicron filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>DAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 4% trehalose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #4 filter paper</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA1004150</td>
			<td>This corresponds to the 20-25 &#956;m pore size filter paper in the protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the peel-blot technique: a cryo-em sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples

Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.

Başarılı bir soyma lekesi deneyi, genellikle yüksek konsantrasyonlarda tek bir numune katmanı ile sonuçlanacaktır. Çoğu ızgara karesindeki bazı bölgelerin, özellikle soyulma lekesi adımlarının daha az sayıda yinelemesinde, hala birden fazla katman içermesi beklenir. Bununla birlikte, ızgara karelerinin çoğunluğu, insan lökotrienC4 sentazının (Şekil 2) ve lipozomların (adım 3.2, Şekil 3'te eklenmiştir) 2D kristalleri için...

Watch this Scientific Journal Video about The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples at JoVE.com

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Soyma lekesi tekniği, kalınlığı azaltmak, konsantrasyonu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik kriyo-EM numunelerinin tek katmanlara ayrılmasını sağlar. Izgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonları arttırılabilir ve soyma lekesi, yüksek verimli veri toplama için tek katmanlı numunelerin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabilir. Başlamak için, iki parça 20-25 mikrometre gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin ve kağıt yukarı bakacak şekilde bitişik uzun bir parafin film yerleştirin.İki ek filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin. Kılcal olmayan forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın ve pürüzsüz veya parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 örgülü bir ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları çekin. Pipet iki 150 mikrolitre düşer, böylece parafin filmin kısa bir tarafından yaklaşık bir ila iki santimetrede% 4 trehaloz çözeltisi. İki damla yaklaşık bir santimetre uzakta olmalıdır.Daha sonra, ayrı bir tezgahta veya zeminde, sıvı azotu küçük bir polistiren köpük kaba dökün ve sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin. Polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün. Karbon filmi mikadan yüzdürmek için, Dumont 5 Forseps kullanın ve mikanın bir tarafına, trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde aşağı doğru hafif bir açıyla dokunun.Su geriliminin karbon filmini yavaşça kaldırmasına izin vermek için mikayı aşağı doğru hareket ettirin. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın. Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.Anti-kılcal forseps tarafından 20-30 derecelik bir açıyla tutulan ızgarayı, bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından ızgarayı karbon filmin altına ortalayın. Karbon filmi alın, ızgarayı aynı yönde tutun ve ızgarayı damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin. Bu, ızgaranın kenarının etrafına kaba tarafa sarılmış olabilecek gereksiz karbon filmi kaldıracaktır.Anti-kılcal forsepsleri döndürün ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Pipetten 1.3 mikrolitre numune alınarak ızgara üstü hafif trehaloz menisküs içine alınır. Daha sonra, trehalozu ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi yaklaşık 8-10 kez pipetleyin.Bir veya daha fazla 1.7 mikrolitre trehaloz çözeltisini parafin filmine damlatarak, numune trehaloz çözeltisini ızgarada bir dakika boyunca inkübe edin. Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün ve kılcal önleyici forsepsleri kullanarak ızgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırın. Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 mikrolitrelik trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce üç saniye bekleyin.Bu adımlar, örneğe bağlı olarak bir ila üç yineleme veya daha fazlası arasında tekrarlanabilir. Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın. Yaklaşık 13 saniye sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.Soyma-leke yöntemine tabi tutulan insan lökotrien C4 sentazının 2D kristal örneği burada gösterilmiştir. Okun solundaki bölge, karbon film ile soyulmuş lekelenmiş ve daha sonra kaydırılmış ızgara çubuğu arasındaki bir temas bölgesinde büyük ölçüde tek katmanlı 2D kristallere indirgenmiştir. Okun sağındaki bölge soyulma lekesinden etkilenmedi.Görüntünün alt yarısı, soyulma lekesinin uygulanmasından kaynaklanan büyük, çoğunlukla tek katmanlı fosfo lipid çift katmanlı bölgeleri temsil eder. Üst yarı, ızgara çubuğu ile karbon filmi arasında bir temas bölgesinde değildi ve bu nedenle iki fosfolipid çift katmanlı tam lipozomlar içeriyordu. 400 mesh ızgaranın ızgara karesi, ızgara çubuğunun ayak izini ve bunun sonucunda ortaya çıkan soyulmuş lekelenmiş bölgelerin yanı sıra bir ızgara çubuğuyla temas etmeyen veya daha az soyulma lekesi yinelemesine maruz kalan bölgeleri gösterir.Bu görüntüler, çok ince karbon film kullanılarak mikron altı bir filtre kağıdı üzerine arka enjeksiyonla hazırlanan bir EM ızgarasının lekelenmesini gösterdi. Görüntüler, membranla ilk temasta, temastan 1.000 milisaniye sonra ve temastan 2.000 milisaniye sonra tek karelerdir. Ok, kılcal basıncın karbon filmi yırttığı ızgara karelerini gösterir.Karbon filmindeki kırılmaları önlemek ve mikron altı filtre kağıdını emişe 1,7 mikrolitrelik trehaloz damlası ile birleştirmek ve daha sonra katmanları ayırmak önemli adımlardır. Soyulmuş lekelenmiş numuneler, yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri toplama için kullanılır, ardından yapı belirleme için görüntü işleme yapılır. Soyulma lekesi, daha önce kriyo-EM için çok kalın olan tek katmanlı protein 2D kristallerinin yapısal olarak belirlenmesine izin verir.Ayrıca, çeşitli numuneleri karbon film üzerinde tek katmanlara yoğunlaştırabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...