Fixatie van embryonaal muisweefsel voor cytoneme-analyse

Dus met behulp van dit protocol kunnen we cytonemen in vast muizenweefsel in het hele embryo visualiseren met standaard lichtmicroscopie. Met behulp van deze techniek kunnen we onderzoeken op endogene signaaleiwitten die langs cytonemen reizen, in plaats van te vertrouwen op genetisch gemanipuleerde muismodellen die fluorescerend getagde eiwitten gebruiken. Tijdens het proberen van dit protocol is het belangrijk om voorzichtig met weefselsecties om te gaan voor het optimale behoud van cytonemen.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Miriam Dillard, een hoofdonderzoeker in mijn groep, en Christina Daly, een afgestudeerde student uit St.Jude. Gebruik om te beginnen een ontleedschaar en tang om een Y-incisie naar de peritoneale holte te maken. Snijd de baarmoeder met E 9,5 embryo.

Ontleed de embryo's in volledig DMEM groeimedium. Gebruik een tang om de dooier SAC, placenta en omliggende membranen te verwijderen. Spoel de geïsoleerde embryo's in HBSS om eventueel achtergebleven vruchtwater en bloed te verwijderen.

Bereid vervolgens het fixatiemiddel voor door paraformaldehyde toe te voegen aan HBSS voor een werkconcentratie van 4% paraformaldehyde. Voeg een milliliter van deze oplossing toe aan elke put van een 24-well plaat. Plaats de embryo's in individuele putten.

Incubeer de embryo's gedurende 45 minuten met zachte agitatie op een rocker. Verwijder na incubatie het fixatiemiddel en was de embryo's driemaal, gedurende 30 minuten in PBS met toegevoegd calcium, magnesium en 0,1% Triton. Incubeer vervolgens de embryo's in blokkerende oplossing met zachte agitatie tweemaal, gedurende elk een uur.

Spoel na de tweede incubatie de embryo's af met verse blokkeeroplossing. Bereid in de tussentijd de primaire antilichaamoplossing door de antilichamen in aangevulde PBS te verdunnen. Nadat de spoeling is voltooid, verwijdert u de blokkerende oplossing en voegt u één milliliter primaire antilichaamoplossing toe aan elk putje.

Incubeer de plaat op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende drie dagen. Na de primaire antilichaamincubatie wast u de embryo's vijf keer met aangevulde PBS gedurende een uur op een rocker met 20 RPM. Voeg vervolgens een milliliter secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put.

Incubeer de plaat met zacht schommelen bij vier graden Celsius in het donker gedurende drie dagen. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was de embryo's driemaal gedurende 30 minuten in aangevuld PBS. Bereid een 4%-gewichtsoplossing van laag smeltpunt agarose in PBS met calcium en magnesium.

Plaats tegelijkertijd een 12-well plaat in het 55 graden Celsius kralenbad en voeg drie milliliter agarose toe aan elke put. Plaats vervolgens de plaat op een bank en breng de embryo's in individuele putten met behulp van een geperforeerde lepel. Gebruik pipetpunten om het embryo voorzichtig in te bedden en te oriënteren, zodat het gecentreerd is in de oplossing.

Zodra de embryo's zijn georiënteerd, plaatst u de plaat gedurende 10 minuten op min 20 graden Celsius voor stolling. Verwijder vervolgens met behulp van een scalpel het hele agaroseblok uit de put. Snijd een rechthoekig blok rond het embryo en laat ongeveer 0,3 centimeter van het blok aan elke kant achter.

Laat een extra lengte van het blok langs het caudale uiteinde van het embryo. Om het embryo op het vibratoom te monteren, brengt u eerst een strook tape aan op de monsterhouder. Oriënteer het embryo in een rechtopstaande positie in het bovenste gedeelte van het blok en lijm het agaroseblok super op de tape, zodat het blad axiale secties in een voorste tot achterste sequentie zal genereren.

Vul vervolgens de vibratomaire kamer met koude HBSS om het monster volledig onder te dompelen en omring de kamer vervolgens met ijs. Stel de parameters op het vibratoom in en voer seriële axiale secties van het embryo uit. Gebruik een tang om afzonderlijke secties over te brengen naar een aparte schaal gevuld met HBSS.

Vergeet niet om een tang te gebruiken om alleen de agarose vast te houden om weefselschade en vernietiging van cytonemen te voorkomen. Om F-actinekleuring uit te voeren, verwijdert u HBSS en incubeert u de secties gedurende 40 minuten met ActinRed en DAPI-oplossing in aangevulde PBS. Na incubatie, was secties driemaal gedurende 20 minuten in aangevulde PBS.

Teken met een hydrofobe markeerpen een barrière rond de randen van een geladen microscoopglaasje en voeg een klein volume HBSS toe aan het vulgebied. Gebruik vervolgens een tang om secties over te brengen naar de dia. Verwijder overtollige agarose met behulp van een tang.

Zodra alle secties naar de dia zijn overgebracht, verwijdert u overtollige vloeistof door te pipetteren en de hoek van een absorberende handdoek te gebruiken. Voeg vervolgens enkele druppels montagemedium toe aan de dia. Monteer de afdekslip door deze voorzichtig op de glijbaan te plaatsen.

Voer voor analyse beeldvorming van de weefselsecties uit voor minimaal drie embryo's per genotype op een confocale of een microscoop met hoge resolutie. Correct georiënteerde secties die zijn voorbereid met behulp van dit protocol worden hier weergegeven. In vergelijking met vibratome-secties heeft cryostaatsectie van het weefsel geen cellulaire extensies behouden.

Een paar GFP-positieve membraanfragmenten werden gedetecteerd tussen cellen van het notochord en de neurale buis, en tussen aangrenzende neurale buiscellen in cryostaatsecties. F-actinekleuring van cellulaire extensies in de mesenchymale cellen rond de neurale buis was echter aangetast in cryostaatsecties. Vibratome secties zorgden voor minimale verstoring van hele embryo- en individuele weefselsecties.

Optimaal behandelde secties maakten de detectie van ctyonemen mogelijk tussen aangrenzend gelokaliseerde vloerplaat neurale epitheelcellen en mesenchymale cellen. Gevouwen of geknikte delen waren zichtbaar door een grote scheiding tussen het notochord en de ventrale vloerplaat van de neurale buis. En een verlies van cellulaire membraanuitbreidingen die migreren tussen epitheelcellen.

F-actine en DAPI-gekleurde secties hadden een consistente afstand van mesenchymale cellen en ctyonemen rond de neurale buis en notochord. Kleine vervormingen in de secties kunnen hebben geleid tot fragmentatie van op actine gebaseerde extensies en grote openingen tussen cellen, wat de noodzaak van delicate behandeling onderstreept. Na embryosectie is het noodzakelijk om het buigen of vouwen van weefselsecties te minimaliseren.

om het breken van cytonemen te voorkomen. Met behulp van deze techniek kunnen we direct visualiseren hoe signaalmoleculen, zoals morfogenen, over weefsels worden verspreid. Dit geeft ons nieuwe inzichten in hoe weefsels en organen zijn gemodelleerd.