Name: fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis
Uploaded: 2022-06-16T14:15:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis at JoVE.com

התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופים המתוחזקים על ידי ליבת ההדמיה של התא והביולוגיה המולקולרית בבית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד. זני עכברים התקבלו מ-JAX. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R35GM122546 של המכונים הלאומיים לבריאות (SKO) ועל ידי ALSAC של בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד.

פרוטוקול זה תואם את ההנחיות המאושרות לטיפול בבעלי חיים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ובית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד. כל הזנים הוחזרו חמישה דורות לזן C57BL/6J.
1. בידוד העוברים וכתמי הרכבה שלמה
<ol><li>לגדל נקבות בנות 6 שבועות ולפקח על נוכחות של תקע הנרתיק.</li>
	<li>הרדמה את הסכר ההרה על ידי שאיפת CO2 בתא CO2 ואחריה פריקה צוואר הרחם על פי הנחיות AVMA18. בצע חתך Y לחלל הצפק באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים. הבלו על הרחם המכיל את עוברי E9.5 בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות.</li>
	<li>נתחו את העוברים במדיום גדילה מלא (מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco, בתוספת חומצות אמינו לא חיוניות, Na-pyruvate, L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי). השתמשו במלקחיים כדי להסיר את שק החלמון, השליה והממברנות הסובבות אותה. הערה: בעת הצורך, שמור כל שק חלמון לגנוטיפ עוברי.</li>
	<li>שטפו את העוברים המבודדים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר כל רקמת מי שפיר ודם שיורית.</li>
	<li>הכן את הקיבוע. הוסף paraformaldehyde (PFA) ל- HBSS לריכוז עבודה סופי של 4% PFA. אזהרה: PFA הוא כימיקל רעיל, ולכן יש להימנע משאיפה או מחשיפה ישירה לעור. הכנת הפתרון המקבע מתבצעת תחת מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים של כפפות ומעיל מעבדה.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של קיבוע לכל באר של צלחת בת 24 בארות והניחו כל עובר בבאר בודדת. דגירו את העוברים באופן קבוע במשך 45 דקות עם תסיסה עדינה על נדנדה. הערה: קריטי: כל השטיפות והדגירות חייבות להיעשות בתסיסה עדינה (מקסימום 20 סל"ד) על נדנדה או שייקר עגול, שכן טיפול פתאומי או תנועה של העוברים יהרסו את הציטונמות הקבועות. השתמש בפיפטה כדי להסיר בעדינות את כל הפתרונות.</li>
	<li>הסר את הקיבוע ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) עם Ca2+ ו- Mg2+ עם תוספת של 0.1% טריטון.</li>
	<li>לאחר הכביסה, דגירו את העוברים בתמיסת חסימה (PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% טריטון ו-5% סרום עיזים) עם תסיסה עדינה. בלוק 2 x 1 שעות. לאחר הדגירה השנייה לחסימה, יש לבצע שטיפה מהירה אחת של העוברים באמצעות תמיסת חסימה טרייה.</li>
	<li>במהלך שלב החסימה השני, להכין את פתרון הנוגדן העיקרי11. דיללו את הנוגדנים לריכוז הממוטב ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים. הערה: להדמיה משופרת של GFP ממברנה, ניתן להשתמש באנטי-GFP של עוף (1:250).</li>
	<li>הסר את תמיסת החסימה והוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 3 ימים.</li>
	<li>לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שטפו את העוברים 5x1 שעות ב-20 סל"ד על נדנדה ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.</li>
	<li>הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית באמצעות מקטעים משניים של F(ab')2 בדילול של 1:1,000 ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים. הערה: שימוש בשברי F(ab')2 משפר מאוד את חדירת הנוגדנים לדגימה.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית לכל באר. דגירה עם נדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 3 ימים. הערה: חשוב: מנקודה זו ואילך, צמצם את חשיפת העוברים לאור ישיר. אופציונלי: כדי למנוע צמיחה של חיידקים, יש להוסיף 0.2% נתרן אזיד לתמיסת הנוגדנים המשנית.</li>
	<li>הסירו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים. אם לא מבצעים צביעת אקטין עם פאלואידין או צבעי אקטין אחרים, לאחר הכביסה הראשונה, יש להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ל-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20, ו-5% סרום עיזים ודגירה למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטיפות של 3x30 דקות כמתואר לעיל. הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב- PBS או HBSS בחושך עד לשלב ההטבעה למחרת. עם זאת, מומלץ להטמיע את העוברים ולחלקם באופן מיידי.</li>
</ol>2. הטמעה, חתך והרכבה של עוברים
<ol><li>הכינו תמיסת אגרוז של 4% עם נקודת התכה נמוכה (LMP) המומסת ב-HBSS או ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ לנפח סופי של כ-3 מ"ל לעובר. הוסיפו את המשקל המתאים של אגרוז LMP ל-HBSS או ל-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ ומיקרוגל עד שהאגרוז LMP מומס. הערה: לאחר התמוססות האגרוז LMP, אחסנו את התמיסה באמבט חרוזים, אינקובטור או אמבט מים המוגדרים ל-55 מעלות צלזיוס כדי למנוע את התמצקות האגרוז של LMP.</li>
	<li>השתמשו בצלחת של 12 קידוחים כתבנית ההטבעה לעוברים. הניחו את הצלחת בת 12 הבאר באמבט החרוזים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הוסיפו 2.5-3 מ"ל של 4% אגרוז LMP לכל באר שתחזיק עובר. הערה: למרות שניתן להשתמש בתבניות אחרות, נפחי צלחת של 12 בארות הם אופטימליים להכנת בלוק האגרוז בשלבים מאוחרים יותר לצורך חתך.</li>
	<li>באמצעות כפית מחוררת, העבירו את העוברים לבארות בודדות המכילות תמיסת אגרוז LMP של 4% (איור 1A).<ol>
<li>העבירו את הצלחת בת 12 הבאר מאמבט החרוזים לספסל. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שיהיה ממורכז בתוך התמיסה. לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מהירה של הבלוק. קריטי: ודא שהעובר ממוקם במרכז הבלוק. עוברים ששוקעים לתחתית או קרובים מדי לקצה העובש ככל הנראה יסולקו מגוש האגרוס תוך כדי חתך.</li>
	</ol></li>
	<li>מוציאים את כל גוש האגרוס מהבאר באמצעות אזמל וחותכים גוש מלבני סביב העובר ומשאירים כ-0.3 ס"מ של בלוק בכל צד. אפשרו אורך נוסף לאורך הקצה הקאודאלי של העובר. כאשר הוא מותקן על הוויברטום, כוון את העובר למיקום זקוף בחלק העליון של הבלוק (איור 1B).</li>
	<li>מרחו רצועת סרט על מחזיק הדגימה של הוויברטום והעבירו את גוש האגרוס לקלטת, בכיוון שהלהב ייצור חלקים ציריים של העובר ברצף קדמי (גולגולתי) עד אחורי.</li>
	<li>מלאו את תא הוויברטום ב-HBSS קר כדי לוודא שהדגימה שקועה במלואה, ולאחר מכן הקיפו את התא בקרח.</li>
	<li>הגדר את מהירות הרטט ל - 0.2 מ"מ לשנייה ותדר בין 5 ל - 7 (50-70 הרץ) כאשר עובי החתך מוגדר ל - 100 מיקרומטר. בצע חתך צירי סדרתי של העובר. הערה: השתמש במהירות איטית לצורך חתך. אם מהירות החיתוך מוגברת מעל 0.25 מ"מ לשנייה, החתך עלול לקרוע את העובר או לעקור את העובר מהגוש.<ol>
<li>במהלך סדרת החתכים, השתמש במלקחיים כדי להעביר בעדינות מקטעים בודדים לצלחת נפרדת של 60 מ"מ במילוי HBSS. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הבלוק, לא את הרקמה, כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים. הערה: מקטעי רקמות צריכים להישאר בתוך גוש האגרוז. אם הרקמה נופלת מהגוש לתוך תא הוויברטום, מעבירים בעדינות על ידי הרמת הקטע החוצה. אין לתפוס או לצבוט את הרקמה. קריטי: כל קיפול של חלקי רקמות או טיפול פתאומי יהרוס ציטונמים קבועים בחתכי הרקמה.</li>
	</ol></li>
	<li>אם לא מבצעים צביעת F-אקטין, המשיכו לשלב 2.10.<ol>
<li>כדי לבצע צביעת F-אקטין, יש להסיר את מקטעי ה-HBSS והדגירה למשך 40 דקות עם תמיסת אקטין-אדום ו-DAPI המדוללת ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>שטפו מקטעים 3 x 20 דקות ב- PBS עם Ca2+ ו- Mg2+ ו- 0.1% Tween-20.</li>
	<li>באמצעות עט סמן הידרופובי, ציירו מחסום הידרופובי סביב הקצוות של מגלשת מיקרוסקופ טעונה והוסיפו נפח קטן של HBSS כדי למלא את האזור.</li>
	<li>השתמש במלקחיים או בכפית מחוררת כדי להעביר חלקים לשקופית. הערה: ניתן להעביר את כל חלקי הרקמות שאינם עטופים באגרוז באמצעות פיפטת העברה.</li>
	<li>הסר עודף בלוק אגרוז באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>לאחר שכל החלקים הועברו למגלשה, הסר עודפי נוזלים באמצעות צנרת ופינת מגבת סופגת, ולאחר מכן הוסיפו מספר טיפות של מדיום הרכבה למגלשה. השתמש במדיום הרכבה מספיק כדי לכסות את כל אזור הכיסוי כאשר הוא נרפא. הרכיבו את הכיסוי על ידי הצבתו בעדינות על המגלשה. הערה: הימנעו מהפעלת לחץ או כיסויים מטרידים עד שמדיום ההרכבה יירפא.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>בצע הדמיה של מקטעי רקמות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי או ברזולוציה גבוהה יותר11. לנתח מינימום של שלושה עוברים לכל גנוטיפ. הערה: תמונות של מקטעי רקמות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP8 STED 3x, ואחריו פירוק LIGHTNING.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+embryogenesis.">Diffusion in embryogenesis.</a> Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freely+diffusible+form+of+Sonic+hedgehog+mediates+long-range+signalling.">A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling.</a> Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).</li><li>Yu, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules.">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+extracellular+diffusion+creates+the+Dpp+morphogen+gradient+of+the+Drosophila+wing+disc.">Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc.</a> Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).</li><li>Ribes, V., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+and+interpreting+graded+Sonic+Hedgehog+signaling+during+vertebrate+neural+tube+patterning:+the+role+of+negative+feedback.">Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).</li><li>Le Dr&#233;au, G., Mart&#237;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).</li><li>Kornberg, T. B., Guha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+morphogen+gradients:+a+problem+of+dispersion+and+containment.">Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (4), 264-271 (2007).</li><li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes:+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs.">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li><li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning.">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li><li>Bischoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+are+required+for+the+establishment+of+a+normal+Hedgehog+morphogen+gradient+in+Drosophila+epithelia.">Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia.</a> Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).</li><li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme+delivery+of+sonic+hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+dispatched-BOC/CDON+co-receptor+complex.">Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> eLife. 10, 61432 (2021).</li><li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+must+express+components+of+the+planar+cell+polarity+system+and+extracellular+matrix+to+support+cytonemes.">Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes.</a> eLife. 5, 18979 (2016).</li><li>Brunt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vangl2+promotes+the+formation+of+long+cytonemes+to+enable+distant+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Mattes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/PCP+controls+spreading+of+Wnt/&#946;-catenin+signals+by+cytonemes+in+vertebrates.">Wnt/PCP controls spreading of Wnt/&#946;-catenin signals by cytonemes in vertebrates.</a> eLife. 7, 36953 (2018).</li><li>Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixation+method+to+preserve+cultured+cell+cytonemes+facilitates+mechanistic+interrogation+of+morphogen+transport.">A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport.</a> Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).</li><li>Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserve+cultured+cell+cytonemes+through+a+modified+electron+microscopy+fixation.">Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation.</a> Bio-protocol. 8 (13), (2018).</li><li>American Veterinary Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals.</a> American Veterinary Medical Association. , (2020).</li><li>Harfe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning.">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 368-380 (2006).</li><li>Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+glutaraldehyde+fixation.+A+new+procedure+based+on+the+Schiff-quenching+method.">Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method.</a> Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+fluorescent+imaging+in+scattering+specimens+using+confocal+microscopy.">Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

פרוטוקול זה פותח לשימור ציטונמים עדינים בחתכי רקמות עובריות לצורך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. עד כה, הדמיה של ציטונמים ברקמות על פני אורגניזמים שונים במודלים שונים הסתמכה במידה רבה על ביטוי חוץ רחמי של חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות הדמיה של רקמות חיות. למרבה הצער, השימוש בהדמיה חיה המסומנת באופן פלואורסצנטי תורם רק לעתים רחוקות לניתוח של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני, יכול להכניס אילוצי זמן ודורש שלבי הדמיה מיוחדים ומיקרוסקופים. שיטת ההכתמה והחתך המתוארת כאן משמרת ציטונמים והרחבות תאיות אחרות כדי לאפשר אימונוהיסטוכימיה לגילוי בסופו של דבר של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני. טכנולוגיה זו תאפשר תובנות חדשות על האופן שבו מורפוגנים מועברים על פני רקמות שונות in vivo ותרחיב את היקף מערכות המודל שבהן ניתן לחקור ציטונמות.
פרוטוקול זה משתמש בצביעה בהרכבה מלאה ובחתך עבה של ויברטום, אשר נמנע משימוש בתמיסת שיווי משקל כגון גליצרול או תמיסות מגן על ההקפאה כגון סוכרוז. מטרתו למזער את הטיפול ברקמות החתוכות כדי לאפשר שימור מקסימלי של הרחבות תאיות. טיפול מופחת ברקמה לאחר הניתוק סיפק באופן עקבי תוצאות טובות יותר בשימור הכולל של הציטונמות. לפיכך, חיתוך העובר הוא אחד השלבים האחרונים לפני ההדמיה.
MEM-fix, טכניקת קיבוע שפותחה לשימור ציטונמים של תאים בתרבית, מורכבת משילוב של גלוטארלדהיד ו-PFA המאפשר שימור תלת-ממדי משופר של ארכיטקטורת התא המולדת הדומה לממדים החיים שלהם16,17. למרבה הצער, MEM-fix לא היה שימושי לקיבוע עוברים מכיוון שגלוטרלדהיד יכול לבצע פלואורסציה אוטומטית ומגביל מאוד את חדירת הנוגדנים ואת קשירת האפיטופים בתאים עקב פעילות גבוהה של קישור צולב חלבוני22,23. לפיכך, פרוטוקולי חתך לאחר תנאי קיבוע PFA הותאמו כדי לאפשר שימור של הרחבות תאיות ברקמה עוברית. למרות ש-PFA יכול לשמר הרחבות דמויות ציטונמה ברקמה עוברית, יש לבצע ניתוח תמונה בזהירות. PFA יכול לגרום להתייבשות חלקית של תאים ורקמות בודדים, מה שמוביל להקטנת נפח קלה ולהיווצרות חללים חוץ-תאיים קטנים בתוך הרקמה הקבועה.
פרוטוקול זה מונע את השלבים הנוספים של resaturation סוכרוז עבור הגנה על ההקפאה וניקוי רקמות כי תמיסות סוכרוז או גליצרול יכול לגרום resaturation קל של הרקמה24. הנפיחות הקלה שנוצרת כתוצאה מכך יכולה להרוס שלוחות תאיות קבועות וציטונומים הנודדים בין תאים ובין רקמות. הדבר ניכר כאשר השווים בין ויברטום עבה-חתך לקטעי קריוסטאט. אף על פי שעלייה בעובי הרקמה שיפרה את שימורם של ציטונים שלמים, מקטעי הקריוסטט הרוויים של סוכרוז היו באופן עקבי בשכיחות נמוכה יותר של ציטונמים הניתנים לזיהוי.
אופטימיזציה של פרוטוקול זה גילתה כי מקטעים בעובי 100 מיקרומטר היו הטובים ביותר להבטחת שימור של ציטונומים שלמים. מקטעים דקים יותר משמשים בדרך כלל להדמיה מכיוון שרוב המיקרוסקופים הקונפוקליים מסוגלים רק להדמיה ברזולוציה מספקת כדי לדמיין הרחבות תאיות לעומק של כ-20-40 מיקרומטר מבלי לנקות25. עם זאת, הכוחות המכניים והעיוות המופעלים על תאים עובריים מהלהב תוך חיתוך חלקים דקים הורסים ציטונמים. מקטעים עבים יותר מאפשרים שטח עומק גדול יותר בתוך המקטע תוך שמירה על הרחבות שלמות בתוך הרקמה. בנוסף, השימוש בחתכים עבים יותר מאפשר טיפול קל כדי למנוע קיפול או אבזם מוגזמים של חלקי הרקמה.
פרוטוקול זה הותאם לשימור מרבי של ציטונמים ברקמה של עוברי עכבר E8-10.5. מניפולציה מינימלית של הרקמה לאחר הניתוק סיפקה שיפור עקבי בשימור הכולל של הציטונים. סביר להניח שתידרש אופטימיזציה נוספת כדי להתאים את הטכניקה לשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר ולחתכי רקמות בוגרים בשל גודל מוגבר ומורכבות הרקמה. זה ידרוש חתך ואחריו צביעה חיסונית. רקמה כזו עשויה לדרוש שלבי ניקוי נוספים והתאמה של הטיפול ברקמות במהלך החתך כדי לשמר הרחבות דמויות ציטונמה. יהיה צורך לשקול שלבים נוספים אלה ולטפל בהם עבור יישומים עתידיים של פרוטוקול זה.

ההתפתחות העוברית מתוזמרת באמצעות הפעלה מתואמת של מסלולי איתות מורפוגן. מורפוג'נים הם חלבונים קטנים ומופרשים המסווגים לקיפוד סוניק (SHH), מה שהופך את גורם הגדילה β (TGF-β)/חלבון מורפוגני עצם (BMP), אתר אינטגרציה ללא כנפיים (WNT) ומשפחות פיברובלסטים וגורמי גדילה אפידרמליים (FGF/EGF). מורפוגנים מיוצרים ומשתחררים ממרכזי התארגנות תאית במהלך התפתחות הרקמות ויוצרים שיפועי איתות על פני שדות מארגנים של תאים כדי ליידע את מורפוגנזה של רקמות 1,2,3,4,5. ייצוג אחד של גרדיאנטים של מורפוגן נמצא במערכת העצבים המתפתחת, שם מערכת העצבים המרכזית המשוערת מעוצבת באמצעות הפעלת מסלול מורפוגן. רקמה זו, המכונה הצינור העצבי, מורכבת משיפועים מנוגדים של SHH המופרשים על ידי הנוטוקורד הגחוני ביותר ולוח הרצפה, ו- WNTs / BMPs המופרשים מלוח הגג הגבי, כדי לעצב אזורי אב עצביים מובחנים6. הצינור העצבי משמש בדרך כלל לחקר שלמות השיפוע של מורפוגן במחקר התפתחותי.
היווצרות גרדיאנט מורפוגן מסתמכת על ויסות הדוק של פיזורהאותות 7. מנגנון תאי אחד שבאמצעותו זה מתרחש הוא באמצעות היווצרות של פילופודיה איתותית ארוכה הנקראת ציטונמות המאפשרות העברה ישירה של מורפוגנים מתאים המייצרים אותות לאוכלוסיות ספציפיות של תאי מטרה. ציטונמים נצפו מרחיבים מאות מיקרומטרים כדי להפקיד מורפוגנים על קרומי תאים קולטים אותות 8,9. שיבוש בהעברת מורפוגן בתיווך ציטונמה מוביל לאנומליות התפתחותיות הן בזבובים והן בבעלי חוליות, ומדגיש את חשיבותן במהלך דפוס הרקמות 10,11,12,13,14.
עד כה תועדו ציטונמים במודלים של דרוזופילה, אפרוחים ודגי זברה, אך הדמיה של המבנים בעוברי יונקים מתפתחים נותרה מאתגרת 8,9,15. מכשול להדמיה יעילה של ציטונמים ברקמות יונקים מורכבות באתרם הוא אופיים הדק והשברירי, מה שהופך אותם לרגישים לנזק בשיטות קיבוע קונבנציונליות8. בעבר פיתחנו ועשינו אופטימיזציה של פרוטוקולים למיקרוסקופיית אלקטרונים מתוקנת (MEM-fix) כדי לשמר ציטונים בתאים בתרבית ולאפשר את המחקר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית16,17.
השימוש בטכניקת MEM-fix אפשר זיהוי של חלק מהמולקולות המעורבות ביצירת ציטונמות המושרות על-ידי SHHותפקודן 11,16,17. עם זאת, אישור הממצאים הללו בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של דפוס הצינורות העצביים הצריך פיתוח של טכניקות חדשניות לתיקון ותמונה של רקמה עוברית של עכבר. כאן מתואר פרוטוקול לתיקון עוברי עכברים באופן שישמור על שלמות הציטונמה ויאפשר חיסון וחיתוך לאחר מכן של רקמה עוברית לצורך ניתוח קונפוקלי. פרוטוקול זה פותח באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הקשור לממברנה (GFP) כדי לתייג הרחבות ממברנה מהתאים המייצרים SHH בתעלה העצבית המתפתחת. יישום פרוטוקול זה יעסוק בשאלות שלא נענו הנוגעות לשכיחותם ומשמעותם של ציטונמים בפיתוח מערכות יונקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628 (Fisher Scientific 12-565-321)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate, Round Nunc</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>353004 (Fisher Scientific 08772F)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark KIMTECH</td>
			<td>34155 (Fisher Scientific 06666A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin Red 555 ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Lab Inc</td>
			<td>703-546-155</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bath 6L 230V</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706)</td>
			<td>set to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>SKU GFP-1020</td>
			<td>1:250 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>model: Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (Vannas Scissors)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel #10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>Catalog No.NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose- UltraPure</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC 17 BIS Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>1037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>P36961&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:008466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:005622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J (B6)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:007576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2+ + Mg2+&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, polyethylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-047-113Q</td>
			<td>set to 20 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosytems</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis

דפוס רקמה התפתחותית והומאוסטזיס של רקמות לאחר התפתחות תלויים בהעברה מבוקרת של אותות תאיים הנקראים מורפוגנס. מורפוגנים פועלים באופן תלוי ריכוז וזמן כדי לציין תוכניות שעתוק נפרדות המנחות ומחזקות את גורל התא. מנגנון אחד שבאמצעותו מובטחים ספי איתות מורפוגן מתאימים הוא באמצעות אספקת חלבוני האיתות על ידי פילופודיה מיוחדת הנקראת ציטונמות. ציטונמים הם דקים מאוד (בקוטר ≤200 ננומטר) ויכולים לגדול לאורכים של כמה מאות מיקרונים, מה שהופך את שימורם לניתוח תמונה קבועה למאתגר. מאמר זה מתאר שיטה מעודנת לטיפול עדין בעוברי עכברים לצורך קיבוע, חיסון וחתך עבה כדי לאפשר הדמיה של ציטונומים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לדמיין ציטונים המחברים תאי איתות תאיים מובחנים במהלך פיתוח תעלה עצבית של עכבר. ניתן גם להתאים את הטכניקה לזיהוי ציטונמים על פני סוגי רקמות כדי להקל על חקירת איתות התפתחותי ברזולוציה חסרת תקדים.

השימוש בתבנית גדולה יותר של צלחת בעלת 12 בארות עם תמיסת אגרוז בגודל 2.5-3 מ"ל לבאר היה אידיאלי להטבעה ולהשעיה של מספר עוברים בפרק זמן קצר (איור 1A). השטח העודף מאפשר כיוון נכון בעת חיתוך גוש האגרוז לצורך חתך. בעת חיתוך גוש האגרוס, חשוב לשמור על עודף אגרוז לאורך החלק התחתון של הבלוק שבו הוא יודבק לסרט על מחזיק האובייקט. העובר צריך להיות בחצי העליון של הבלוק (איור 1B). עם זאת, החלק התחתון לא צריך להיות גדול מדי מכיוון שעודף בלוק מגדיל את הסיכויים לשנות את זווית החיתוך כאשר הלהב דוחף לתוך הבלוק בזמן החתך. מוצגות דוגמאות למקטעים בעלי אוריינטציה נכונה (איור 1C,D).
בעת פיתוח פרוטוקול זה, חתך הוויברטום הושווה לחתך קריוסטאט. חתך קריוסטאט של הרקמה כמעט ולא השתמר על הרחבות תאיות (איור 2 קריוסטאט ואיור 3A,B ויברטום). מקטעי Cryostat אפשרו זיהוי של כמה מקטעי ממברנה חיוביים ל-GFP בין תאי הנוטוקורד והתעלה העצבית (איור 2A ראש חץ) ובין תאי הצינור העצבי הסמוכים (ראשי חץ איור 2B,B). עם זאת, צביעת F-אקטין של שלוחות תאיות בתאים המזנכימליים בעלי החוטים הגבוהים המקיפים את הצינור העצבי נפגעה בקטעי קריוסטאט (איור 2C,C' arrow, לעומת איור 3C,D). תוצאות קריוסטאט אלה מצביעות על כך שרק כמה עקבות של שלוחות תאיות שבורות נותרו בשיטה זו. לפיכך, חתך ויברטום עדיף לשמר ביעילות את ההרחבות העדינות הללו לניתוח הבא.
הפרעה מינימלית של מקטעי עובר שלמים ורקמות בודדות חיונית להדמיה באיכות גבוהה של שלוחות תאיות. מקטעי רקמה שעברו קיפול או אבזם כלשהם יהיו ניכרים בהיעדר הנוטוקורד או בהפרדה גדולה (>30 מיקרומטר) בין הנוטוקורד ללוח הרצפה הגחונית של הצינור העצבי (איור 3B). זה בדרך כלל מלווה באובדן של תאים מזנכימליים שבדרך כלל מקיפים את הצינור העצבי (איור 3A, חץ). מקטעים פגומים גם יגרמו לאובדן של הרחבות ממברנות תאיות נראות לעין הנודדות בין תאי אפיתל (איור 3B בהשוואה לאיור 3A, ראשי חץ). אפילו עיוותים קלים בחתכים עלולים לגרום לפיצול של הרחבות מבוססות אקטין ולמרווחים גדולים להיווצרות בין התאים (איור 3D, ראשי חץ, בהשוואה לאיור 3C שהשתמר היטב), מה שמדגיש את הצורך בטיפול עדין בכל השלבים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig01.jpg"> איור 1: דוגמה של E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG מוכתם, מוטבע ומחותוך עובר. (A) עובר יחיד בצלחת של 12 בארות, משובץ באגרוז 4% LMP. (B) דוגמה לעובר בעל אוריינטציה נכונה בתוך גוש האגרוז שנחתך לגודלו לצורך הרכבה על ויברטום. עודף גוש אגרוז קיים לאורך החלק התחתון. (C) תמונת שדה בהיר של חתך עובר בעובי 100 מיקרומטר המוטבע באגרוז LMP. (D) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מקטע לאחר הסרת אגרוז. mGFP מוכתם נגד GFP (ירוק) מייצג תאים המבטאים Shh ברקמה, כאשר שושלות תאים אחרות מבטאות את הממברנה עגבנייה (אדום), DAPI בכחול. הצינור העצבי (סוגריים) ונוטוקורד חיובי mGFP (חץ) נראים בבירור. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (A), 5 מ"מ (B) ו- 100 מיקרומטר (C, D). קיצורים: LMP = נקודת התכה נמוכה; mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig02.jpg"> איור 2: דוגמה לצלחת רצפת הצינור העצבית בחתך קריוסטאט ולנוטוכורד עם הרחבות ממברנה מקוטעות. Rosa26 mTmG 19,20,21 קטע מוכתם עבור GFP (ירוק), F-אקטין (אדום) ו- DAPI (כחול). mGFP puncta נראים בין הנוטוקורד לבין לוח הרצפה (ראש החץ) ו-(B,B') הנודדים בין תאים סמוכים של הצינור העצבי. (ג,ג') צביעת F-actin אינה מצליחה לזהות ציטונומים ברורים על תאים מזנכימליים המקיפים את הצינור העצבי (חץ). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות למקטעי רקמת ויברטום אופטימליים ולא אופטימליים ולכתמים של צלחת רצפת הצינור העצבי, הנוטוקורד והתאים הסובבים אותה. דוגמאות למקטעים שטופלו בעדינות (A,C), בהשוואה ל-(B) מקטע רקמה מקופלת ו-(D) מקטע שטופל בצורה גרועה מ-Shh-Cre; Rosa26 mTmG ועובר ShhGFP/+ 19,20,21. מקטעים המטופלים בצורה אופטימלית מאפשרים זיהוי של ציטונמות בין תאי אפיתל עצביים של לוחות רצפה סמוכים (A, ראשי חץ). יש לראות את הנוטוקורד הסמוך לצינור העצבי (A, מבטא mGFP) ותאים מזנכימליים (A, חץ). (ג,ד) מקטעים מוכתמים ב-F-אקטין וב-DAPI צריכים לכלול ריווח עקבי של תאים מזנכימליים וציטונמים מבוססי F-אקטין (חצים) המקיפים את הצינור העצבי ואת נוטוכורד (C). כל קיפול או הפרעה קלים של החלקים עלולים לגרום למרווחים ולשברי F-אקטין שבורים (D, ראשי חץ). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis at JoVE.com

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לקיבוע, חיסון וחתך של עוברים כדי לזהות פילופודיה איתותית מיוחדת הנקראת ציטונמות ברקמות עכבר מתפתחות.

קיבוע רקמת עכבר עוברית לניתוח ציטונמה

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

לכן, באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים לדמיין ציטונמות ברקמת עכבר קבועה לאורך כל העובר באמצעות מיקרוסקופיית אור סטנדרטית. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לחקור חלבוני איתות אנדוגניים הנעים לאורך ציטונמות, במקום להסתמך על מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית המשתמשים בחלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לטפל בעדינות בחתכי רקמות לשימור אופטימלי של ציטונמות.מי שידגימו את ההליך הזה יהיו מרים דילארד, חוקרת ראשית בקבוצה שלי, וכריסטינה דאלי, סטודנטית לתואר שני בסנט ג'וד. כדי להתחיל, השתמש במספריים ומלקחיים לנתח כדי לבצע חתך Y לחלל הצפק. לבלות את הרחם המכיל עובר E 9.5.לנתח את העוברים במדיום גדילה DMEM מלא. השתמש במלקחיים כדי להסיר את החלמון SAC, השליה, ואת הממברנות הסובבות. יש לשטוף את העוברים המבודדים ב-HBSS כדי להסיר כל רקמת מי שפיר ודם שיורית.לאחר מכן, הכן את הקיבוע על ידי הוספת paraformaldehyde ל- HBSS עבור ריכוז עובד של 4% paraformaldehyde. הוסף מיליליטר אחד של פתרון זה לכל באר של צלחת 24 באר. מכניסים את העוברים לבארות בודדות.לדגום את העוברים במשך 45 דקות עם תסיסה עדינה על נדנדה. לאחר הדגירה, מוציאים את הקיבוע ושוטפים את העוברים שלוש פעמים, למשך 30 דקות ב-PBS עם תוספת סידן, מגנזיום ו-0.1% טריטון. לאחר מכן דגירו את העוברים בתמיסת חסימה עם תסיסה עדינה פעמיים, במשך שעה כל אחד.לאחר הדגירה השנייה, יש לשטוף את העוברים באמצעות תמיסת חסימה טרייה. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול הנוגדנים בתוסף PBS. לאחר השלמת השטיפה, יש להסיר את תמיסת החסימה ולהוסיף מיליליטר אחד של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר.דוגרים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך שלושה ימים. לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו את העוברים בתוסף PBS חמש פעמים במשך שעה אחת על נדנדה ב-20 סל"ד. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת נוגדנים משנית לכל באר.דוגרים את הצלחת עם נדנדה עדינה בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את העוברים שלוש פעמים במשך 30 דקות בתוסף PBS. מכינים תמיסה של 4% לפי משקל של אגרוז נקודת התכה נמוכה ב-PBS עם סידן ומגנזיום.במקביל, הניחו צלחת של 12 בארות באמבט החרוזים של 55 מעלות צלזיוס והוסיפו שלושה מיליליטרים של אגרוז לכל באר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על ספסל והעבירו את העוברים לבארות בודדות באמצעות כפית מחוררת. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שהוא יהיה מרוכז בתוך התמיסה.לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת על מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לצורך התמצקות. לאחר מכן באמצעות אזמל, להסיר את כל בלוק agarose מן הבאר. חותכים גוש מלבני סביב העובר, ומשאירים כ-0.3 סנטימטרים של הבלוק בכל צד.השאירו אורך נוסף של הבלוק לאורך הקצה הקאודאלי של העובר. כדי להרכיב את העובר על הוויברטום, תחילה להחיל רצועת סרט על מחזיק הדגימה. כיוונו את העובר במיקום זקוף בחלק העליון של הבלוק והדביקו את גוש האגרוז לקלטת, כך שהלהב יפיק מקטעים ציריים ברצף קדמי עד אחורי.לאחר מכן, מלאו את תא הוויברטום ב-HBSS קר כדי לטבול את הדגימה במלואה ואז הקיפו את התא בקרח. הגדר את הפרמטרים על הוויברטום ובצע חתך צירי סדרתי של העובר. השתמש במלקחיים כדי להעביר חלקים בודדים למנה נפרדת מלאה ב- HBSS.זכרו להשתמש במלקחיים להחזקת האגרוז בלבד כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים. כדי לבצע צביעת F-actin, הסר HBSS ודגרר את החלקים למשך 40 דקות עם תמיסת ActinRed ו- DAPI בתוספת PBS. לאחר הדגירה, לשטוף קטעים שלוש פעמים במשך 20 דקות בתוספת PBS.בעזרת עט סמן הידרופובי, ציירו מחסום סביב הקצוות של שקופית מיקרוסקופ טעונה והוסיפו נפח קטן של HBSS לאזור המילוי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להעביר מקטעים לשקופית. הסר אגרוז עודף באמצעות מלקחיים.לאחר שכל החלקים הועברו למגלשה, הסר עודפי נוזלים על ידי צנרת ושימוש בפינה של מגבת סופגת. לאחר מכן הוסף מספר טיפות של מדיום הרכבה לשקופית. הרכיבו את החלקת הכיסוי על ידי הנחתו בעדינות על המגלשה.לצורך ניתוח, בצע הדמיה של חלקי הרקמה עבור מינימום של שלושה עוברים לכל גנוטיפ על קונפוקל או כל מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. מקטעים מכוונים כהלכה שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצגים כאן. בהשוואה לחתך ויברטום, חתך קריוסטאט של הרקמה לא שימר את השלוחות התאית.כמה מקטעי ממברנה חיוביים ל-GFP זוהו בין תאים של הנוטוכורד והתעלה העצבית, ובין תאי צינור עצביים סמוכים בקטעי קריוסטאט. עם זאת, צביעת F-אקטין של שלוחות תאיות בתאים המזנכימליים המקיפים את הצינור העצבי נפגעה בקטעי קריוסטאט. חתך הוויברטום הבטיח הפרעה מינימלית של חתכי עוברים שלמים ורקמות בודדות.מקטעים שטופלו בצורה אופטימלית אפשרו זיהוי של ctyonemes בין תאי אפיתל עצביים של לוחות רצפה מקומיים סמוכים לבין תאים מזנכימליים. חלקים מקופלים או חבושים ניכרו בהפרדה גדולה בין הנוטוקורד לבין לוח הרצפה הגחונית של הצינור העצבי. ואובדן של הרחבות של קרום התא הנודדות בין תאי אפיתל.למקטעים המוכתמים ב-F-אקטין וב-DAPI היה ריווח עקבי של תאים מזנכימליים וקטיונמים המקיפים את הצינור העצבי ואת הנוטוקורד. ייתכן שעיוותים קלים בחתכים גרמו לפיצול של הרחבות מבוססות אקטין ולפערים גדולים להיווצרות בין התאים, מה שמדגיש את הצורך בטיפול עדין. לאחר חתך העוברים, חובה למזער כל כיפוף או קיפול של חלקי רקמות.כדי למנוע שבירת ציטונמים. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לדמיין באופן ישיר כיצד מולקולות איתות, כמו מורפוג'נים, מתפשטות על פני רקמות. זה נותן לנו תובנות חדשות על האופן שבו רקמות ואיברים מעוצבים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...