Name: fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis
Uploaded: 2022-06-16T14:15:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis at JoVE.com

सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल में सेल और आणविक जीवविज्ञान इमेजिंग कोर द्वारा बनाए गए माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण किया गया था। माउस उपभेदों को जैक्स से प्राप्त किया गया था। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर 35 जीएम 122546 (एसकेओ) और सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल के एएलएसएसी द्वारा समर्थित किया गया था।

<ol>
	<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+embryogenesis.">Diffusion in embryogenesis.</a> Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freely+diffusible+form+of+Sonic+hedgehog+mediates+long-range+signalling.">A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling.</a> Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).</li><li>Yu, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules.">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+extracellular+diffusion+creates+the+Dpp+morphogen+gradient+of+the+Drosophila+wing+disc.">Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc.</a> Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).</li><li>Ribes, V., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+and+interpreting+graded+Sonic+Hedgehog+signaling+during+vertebrate+neural+tube+patterning:+the+role+of+negative+feedback.">Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).</li><li>Le Dr&#233;au, G., Mart&#237;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).</li><li>Kornberg, T. B., Guha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+morphogen+gradients:+a+problem+of+dispersion+and+containment.">Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (4), 264-271 (2007).</li><li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes:+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs.">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li><li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning.">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li><li>Bischoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+are+required+for+the+establishment+of+a+normal+Hedgehog+morphogen+gradient+in+Drosophila+epithelia.">Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia.</a> Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).</li><li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme+delivery+of+sonic+hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+dispatched-BOC/CDON+co-receptor+complex.">Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> eLife. 10, 61432 (2021).</li><li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+must+express+components+of+the+planar+cell+polarity+system+and+extracellular+matrix+to+support+cytonemes.">Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes.</a> eLife. 5, 18979 (2016).</li><li>Brunt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vangl2+promotes+the+formation+of+long+cytonemes+to+enable+distant+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Mattes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/PCP+controls+spreading+of+Wnt/&#946;-catenin+signals+by+cytonemes+in+vertebrates.">Wnt/PCP controls spreading of Wnt/&#946;-catenin signals by cytonemes in vertebrates.</a> eLife. 7, 36953 (2018).</li><li>Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixation+method+to+preserve+cultured+cell+cytonemes+facilitates+mechanistic+interrogation+of+morphogen+transport.">A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport.</a> Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).</li><li>Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserve+cultured+cell+cytonemes+through+a+modified+electron+microscopy+fixation.">Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation.</a> Bio-protocol. 8 (13), (2018).</li><li>American Veterinary Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals.</a> American Veterinary Medical Association. , (2020).</li><li>Harfe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning.">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C., Pawley, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+fluorescent+imaging+in+scattering+specimens+using+confocal+microscopy.">Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).</li></ol>

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए भ्रूण ऊतक वर्गों में नाजुक साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित किया गया था। आज तक, विभिन्न मॉडल जीवों में ऊतक में साइटोनेम्स का दृश्य काफी हद तक लाइव-टिशू इमेजिंग का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन की एक्टोपिक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। दुर्भाग्य से, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लाइव-इमेजिंग का उपयोग अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के विश्लेषण के लिए शायद ही कभी अनुकूल होता है, समय की कमी का परिचय दे सकता है, और विशेष इमेजिंग चरणों और माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित धुंधला और सेक्शनिंग विधि अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के अंतिम पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की अनुमति देने के लिए साइटोनेम्स और अन्य सेलुलर एक्सटेंशन को संरक्षित करती है। यह तकनीक विवो में विभिन्न ऊतकों में मॉर्फोजेन को कैसे ले जाया जाता है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करेगी और मॉडल सिस्टम के दायरे का विस्तार करेगी जहां साइटोनेम्स का अध्ययन किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल पूरे माउंट धुंधला और वाइब्रेटोम मोटी-सेक्शनिंग का उपयोग करता है, जो सुक्रोज जैसे ग्लिसरॉल या क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान जैसे संतुलन समाधान के उपयोग से बचता है। इसका उद्देश्य सेलुलर एक्सटेंशन के अधिकतम संरक्षण की अनुमति देने के लिए खंडित ऊतक हैंडलिंग को कम करना है। सेक्शनिंग के बाद ऊतक की कम हैंडलिंग साइटोनेम्स के समग्र संरक्षण में लगातार बेहतर परिणाम प्रदान करती है। इस प्रकार, भ्रूण का सेक्शनिंग इमेजिंग से पहले अंतिम चरणों में से एक है।
एमईएम-फिक्स, सुसंस्कृत कोशिकाओं के साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित एक निर्धारण तकनीक, ग्लूटाराल्डिहाइड और पीएफए का एक संयोजन होता है जो उनके जीवित आयामों16,17 की तुलना में जन्मजात सेल वास्तुकला के बेहतर 3 डी संरक्षण की अनुमति देता है। दुर्भाग्य से, एमईएम-फिक्स भ्रूण निर्धारण के लिए उपयोगी नहीं था क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड ऑटो-फ्लोरोसिस कर सकता है और उच्च प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि22,23 के कारण कोशिकाओं में एंटीबॉडी प्रवेश और एपिटोप बाइंडिंग को गंभीर रूप से सीमित कर सकता है। इस प्रकार, भ्रूण के ऊतकों में सेलुलर एक्सटेंशन के संरक्षण की अनुमति देने के लिए पीएफए निर्धारण स्थितियों के बाद सेक्शनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। यद्यपि पीएफए भ्रूण के ऊतकों में साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित कर सकता है, छवि विश्लेषण सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। पीएफए व्यक्तिगत कोशिकाओं और ऊतकों के आंशिक निर्जलीकरण का कारण बन सकता है, जिससे मामूली मात्रा में कमी और निश्चित ऊतक के भीतर छोटे बाह्य रिक्त स्थान का गठन हो सकता है।
सुक्रोज या ग्लिसरॉल समाधान ऊतक24 की एक मामूली पुनरावृत्ति का कारण बन सकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल क्रायोप्रोटेक्शन और ऊतक समाशोधन के लिए सुक्रोज पुनर्संतृप्ति के अतिरिक्त चरणों से बचा जाता है। परिणामस्वरूप मामूली सूजन कोशिकाओं के बीच और ऊतकों में पलायन करने वाले निश्चित सेलुलर एक्सटेंशन और साइटोनेम को नष्ट कर सकती है। क्रायोस्टैट वर्गों के लिए मोटी-खंडित वाइब्रेटोम की तुलना करते समय यह स्पष्ट था। यद्यपि ऊतक की मोटाई बढ़ने से बरकरार साइटोनेम के संरक्षण में सुधार हुआ, सुक्रोज-पुनर्संतृप्त क्रायोस्टैट वर्गों में लगातार पता लगाने योग्य साइटोनेम की कम घटनाएं थीं।
इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन से पता चला है कि बरकरार साइटोनेम के संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए 100 μm मोटी वर्गों सबसे अच्छा थे। पतले वर्गों का उपयोग आमतौर पर इमेजिंग के लिए किया जाता है क्योंकि अधिकांश कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप केवल25 समाशोधन के बिना ~ 20-40 μm की गहराई तक सेलुलर एक्सटेंशन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग करने में सक्षम होते हैं। हालांकि, पतले वर्गों को काटते समय ब्लेड से भ्रूण कोशिकाओं पर लागू यांत्रिक बल और विरूपण साइटोनेम को नष्ट कर देता है। मोटे वर्ग ऊतक के भीतर बरकरार एक्सटेंशन को संरक्षित करते हुए अनुभाग के भीतर गहराई के एक बड़े क्षेत्र की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, मोटे वर्गों का उपयोग ऊतक वर्गों के अत्यधिक तह या बकलिंग को रोकने के लिए हैंडलिंग में आसानी की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल ई 8-10.5 माउस भ्रूण के ऊतक में साइटोनेम्स के अधिकतम संरक्षण के लिए अनुकूलित किया गया था। सेक्शनिंग के बाद ऊतक के न्यूनतम हेरफेर ने साइटोनेम्स के लगातार बेहतर समग्र संरक्षण में सुधार किया। यह संभावना है कि आकार और ऊतक जटिलता में वृद्धि के कारण बाद के विकास चरणों और वयस्क ऊतक वर्गों के लिए तकनीक को अनुकूलित करने के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद सेक्शनिंग की आवश्यकता होगी। इस तरह के ऊतकों को साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित करने के लिए सेक्शनिंग के दौरान अतिरिक्त समाशोधन चरणों और ऊतक हैंडलिंग के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इन अतिरिक्त चरणों पर विचार करने और इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए संबोधित करने की आवश्यकता होगी।

भ्रूण के विकास को मॉर्फोजेन सिग्नलिंग मार्गों के समन्वित सक्रियण के माध्यम से ऑर्केस्ट्रेटेड किया जाता है। मॉर्फोजेन छोटे, स्रावित प्रोटीन होते हैं जिन्हें सोनिक हेजहोग (एसएचएच) में वर्गीकृत किया जाता है, जो विकास कारक β (टीजीएफ -β) / हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपी), विंगलेस से संबंधित एकीकरण साइट (डब्ल्यूएनटी), और फाइब्रोब्लास्ट और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ / मॉर्फोजेन का उत्पादन और ऊतक विकास के दौरान सेलुलर आयोजन केंद्रों से जारी किया जाता है और ऊतक मॉर्फोजेनेसिस 1,2,3,4,5 को सूचित करने के लिए कोशिकाओं के आयोजन क्षेत्रों में सिग्नलिंग ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट्स का एक प्रतिनिधित्व विकासशील तंत्रिका तंत्र में पाया जाता है, जहां अनुमानित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को मॉर्फोजेन मार्ग सक्रियण के माध्यम से पैटर्न किया जाता है। यह ऊतक, जिसे तंत्रिका ट्यूब के रूप में जाना जाता है, में उदर-सबसे नोटोकॉर्ड और फर्श प्लेट द्वारा स्रावित एसएचएच के विरोधी ढाल शामिलहैं, और पृष्ठीय छतप्लेट से स्रावित डब्ल्यूएनटी / तंत्रिका ट्यूब का उपयोग आमतौर पर विकासात्मक अनुसंधान में मॉर्फोजेन ढाल अखंडता से पूछताछ करने के लिए किया जाता है।
मॉर्फोजेन ढाल गठन सिग्नल फैलाव7 के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। एक सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा ऐसा होता है, लंबे सिग्नलिंग फिलोपोडिया के गठन के माध्यम से होता है जिसे साइटोनेम्स कहा जाता है जो सिग्नल-उत्पादक कोशिकाओं से विशिष्ट लक्ष्य सेल आबादी तक मॉर्फोजेन के प्रत्यक्ष वितरण की सुविधा प्रदान करता है। साइटोनेम्स को सिग्नल प्राप्त करने वाले सेल झिल्ली 8,9 पर मॉर्फोजेन जमा करने के लिए सैकड़ों माइक्रोमीटर का विस्तार करनेके लिए देखा गया है। साइटोनेम-मध्यस्थता वाले मॉर्फोजेन परिवहन के विघटन से मक्खियों और कशेरुकियों दोनों में विकासात्मक विसंगतियां होती हैं, जो ऊतक पैटर्निंग10,11,12,13,14 के दौरान उनके महत्व को उजागर करती हैं।
आज तक, साइटोनेम्स को ड्रोसोफिला, चिक और ज़ेब्राफिश मॉडल में प्रलेखित किया गया है, लेकिन स्तनधारी भ्रूण के विकास में संरचनाओं की इमेजिंग 8,9,15 को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। सीटू में जटिल स्तनधारी ऊतकों में साइटोनेम्स को प्रभावी ढंग से इमेजिंग करने के लिए एक बाधा उनकी पतली और नाजुक प्रकृति है, जो उन्हें पारंपरिक निर्धारण विधियों द्वारा नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है8. हमने पहले सुसंस्कृत कोशिकाओं में साइटोनेम्स को संरक्षित करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी16,17 का उपयोग करके उनके अध्ययन को सक्षम करने के लिए संशोधित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिक्सेटिव (एमईएम-फिक्स) के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया था।
एमईएम-फिक्स तकनीक के उपयोग ने एसएचएच-प्रेरित साइटोनीम गठन और फ़ंक्शन 11,16,17 में शामिल कुछ अणुओं की पहचान की अनुमति दी है। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब पैटर्निंग के शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में इन निष्कर्षों की पुष्टि ने माउस भ्रूण के ऊतकों को ठीक करने और छवि बनाने के लिए उपन्यास तकनीकों के विकास की आवश्यकता की। माउस भ्रूण को इस तरह से ठीक करने के लिए एक प्रोटोकॉल जो साइटोनेम अखंडता को बनाए रखता है और कन्फोकल विश्लेषण के लिए भ्रूण के ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग और बाद के सेक्शनिंग की अनुमति देता है, यहां उल्लिखित है। यह प्रोटोकॉल विकासशील तंत्रिका ट्यूब में एसएचएच-उत्पादक कोशिकाओं से झिल्ली एक्सटेंशन को लेबल करने के लिए झिल्ली-टेथर्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करके विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन से स्तनधारी प्रणालियों के विकास में साइटोनेम्स के प्रसार और महत्व से संबंधित अनुत्तरित प्रश्नों को संबोधित किया जाएगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628 (Fisher Scientific 12-565-321)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate, Round Nunc</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>353004 (Fisher Scientific 08772F)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark KIMTECH</td>
			<td>34155 (Fisher Scientific 06666A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin Red 555 ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Lab Inc</td>
			<td>703-546-155</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bath 6L 230V</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706)</td>
			<td>set to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>SKU GFP-1020</td>
			<td>1:250 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>model: Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (Vannas Scissors)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel #10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>Catalog No.NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose- UltraPure</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC 17 BIS Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>1037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>P36961&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:008466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:005622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J (B6)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:007576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2+ + Mg2+&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, polyethylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-047-113Q</td>
			<td>set to 20 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosytems</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis

विकासात्मक ऊतक पैटर्निंग और पोस्टडेवलपमेंटल ऊतक होमियोस्टेसिस मॉर्फोजेन नामक सेलुलर संकेतों के नियंत्रित वितरण पर निर्भर करते हैं। मॉर्फोजेन अलग-अलग ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों को निर्दिष्ट करने के लिए एक एकाग्रता- और समय-निर्भर तरीके से कार्य करते हैं जो सेल भाग्य को निर्देश और सुदृढ़ करते हैं। एक तंत्र जिसके द्वारा उपयुक्त मॉर्फोजेन सिग्नलिंग थ्रेसहोल्ड सुनिश्चित किया जाता है, साइटोनेम्स नामक विशेष फिलोपोडिया द्वारा सिग्नलिंग प्रोटीन के वितरण के माध्यम से होता है। साइटोनेम बहुत पतले होते हैं (व्यास में ≤200 एनएम) और कई सौ माइक्रोन की लंबाई तक बढ़ सकते हैं, जो निश्चित छवि विश्लेषण के लिए उनके संरक्षण को चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह पेपर मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोनेम्स के दृश्य की अनुमति देने के लिए निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और मोटी सेक्शनिंग के लिए माउस भ्रूण के नाजुक हैंडलिंग के लिए एक परिष्कृत विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग माउस तंत्रिका ट्यूब विकास के दौरान अलग-अलग सेलुलर सिग्नलिंग डिब्बों को जोड़ने वाले साइटोनेम्स की कल्पना करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। तकनीक को अभूतपूर्व संकल्प पर विकासात्मक सिग्नलिंग की पूछताछ की सुविधा के लिए ऊतक प्रकारों में साइटोनेम का पता लगाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रति अच्छी तरह से अगारोज समाधान के 2.5-3 एमएल के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक बड़े मोल्ड का उपयोग थोड़े समय में कई भ्रूणों को एम्बेड करने और निलंबित करने के लिए आदर्श था (चित्रा 1 ए)। सेक्शनिंग के लिए एगरोज़ ब्लॉक को काटते समय अतिरिक्त क्षेत्र सही अभिविन्यास की अनुमति देता है। अगारोज ब्लॉक को काटते समय, ब्लॉक के तल के साथ अतिरिक्त एगरोज़ को बनाए रखना महत्वपूर्ण है जहां इसे ऑब्जेक्ट धारक पर टेप से चिपकाया जाएगा। भ्रूण ब्लॉक (चित्रा 1 बी) के ऊपरी आधे हिस्से में होना चाहिए। हालांकि, निचला खंड बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए क्योंकि अतिरिक्त ब्लॉक कट कोण को बदलने की संभावना को बढ़ाता है क्योंकि ब्लेड सेक्शनिंग करते समय ब्लॉक में धक्का देता है। सही ढंग से उन्मुख वर्गों के उदाहरण दिखाए गए हैं (चित्रा 1 सी, डी)।
इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय, वाइब्रेटोम सेक्शनिंग की तुलना क्रायोस्टैट सेक्शनिंग से की गई थी। ऊतक के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग शायद ही कभी सेलुलर एक्सटेंशन (चित्रा 2 क्रायोस्टैट और चित्रा 3ए, बी वाइब्रेटोम) संरक्षित करते हैं। क्रायोस्टैट वर्गों नोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 2 ए तीरहेड) की कोशिकाओं के बीच और आसन्न तंत्रिका ट्यूब कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, बी 'तीरहेड्स) के बीच कुछ जीएफपी-पॉजिटिव झिल्ली टुकड़ों का पता लगाने के लिए अनुमति दी। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब के आसपास अत्यधिक फिलामेंटस मेसेनकाइमल कोशिकाओं में सेलुलर एक्सटेंशन के एफ-एक्टिन धुंधला क्रायोस्टैट वर्गों (चित्रा 2 सी, सी ' तीर, बनाम चित्रा 3 सी, डी) में बिगड़ा हुआ था। ये क्रायोस्टैट परिणाम इंगित करते हैं कि टूटे हुए सेलुलर एक्सटेंशन के केवल कुछ निशान इस विधि का पालन करते हैं। इस प्रकार, वाइब्रेटोम सेक्शनिंग को बाद के विश्लेषण के लिए इन नाजुक एक्सटेंशन को कुशलतापूर्वक संरक्षित करने के लिए पसंद किया जाता है।
सेलुलर एक्सटेंशन की उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग के लिए पूरे भ्रूण और व्यक्तिगत ऊतक वर्गों का न्यूनतम विघटन आवश्यक है। ऊतक वर्गों कि किसी भी तह या बकलिंग से गुजरना नोटोकॉर्ड की अनुपस्थिति या नोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 3 बी) के उदर मंजिल प्लेट के बीच एक बड़ा पृथक्करण (>30 μm) से स्पष्ट हो जाएगा। यह आमतौर पर मेसेनकाइमल कोशिकाओं के नुकसान के साथ होता है जो सामान्य रूप से तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 3 ए, तीर) को घेरते हैं। क्षतिग्रस्त वर्गों के परिणामस्वरूप उपकला कोशिकाओं (चित्रा 3 ए, एरोहेड्स की तुलना में चित्रा 3 बी) के बीच पलायन करने वाले दृश्यमान सेलुलर झिल्ली एक्सटेंशन का नुकसान भी होगा। यहां तक कि वर्गों के लिए मामूली विकृतियां कोशिकाओं (चित्रा 3 डी, एरोहेड्स, अच्छी तरह से संरक्षित चित्रा 3 सी की तुलना में) के बीच बनने के लिए एक्टिन-आधारित एक्सटेंशन और बड़े अंतराल के विखंडन का कारण बन सकती हैं, जो सभी चरणों में नाजुक हैंडलिंग की आवश्यकता को रेखांकित करती हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig01.jpg"> चित्र 1: ई 9.5 श-क्रे का उदाहरण; रोजा 26 एमटीएमजी दाग, एम्बेडेड और खंडित भ्रूण। (ए) 12-अच्छी तरह से प्लेट में एक एकल भ्रूण, 4% एलएमपी एगरोज़ में एम्बेडेड। (बी) एगरोज़ ब्लॉक के भीतर एक सही ढंग से उन्मुख भ्रूण का उदाहरण वाइब्रेटोम बढ़ते के लिए आकार में कटौती करता है। अतिरिक्त एगरोज़ ब्लॉक तल के साथ मौजूद है। (सी) एलएमपी एगरोज़ में एम्बेडेड 100 μm मोटी भ्रूण अनुभाग की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (डी) एगरोज को हटाने के बाद एक खंड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। एंटी-जीएफपी-दाग एमजीएफपी (हरा) ऊतक में एसएचएच-व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, अन्य सेल वंशावली झिल्ली टमाटर (लाल), नीले रंग में डीएपीआई व्यक्त करती है। तंत्रिका ट्यूब (ब्रैकेट) और एमजीएफपी-पॉजिटिव नोटोकॉर्ड (तीर) स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। स्केल बार = 1 सेमी (ए), 5 मिमी (बी), और 100 μm (सी, डी)। संक्षिप्त नाम: एलएमपी = कम पिघलने बिंदु; एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig02.jpg"> चित्रा 2: खंडित झिल्ली एक्सटेंशन के साथ क्रायोस्टैट-सेक्शनेड न्यूरल ट्यूब फ्लोर प्लेट और नोटोकॉर्ड का उदाहरण। रोजा 26 एमटीएमजी 19,20,21 खंड जीएफपी (हरा), एफ-एक्टिन (लाल), और डीएपीआई (नीला) के लिए दाग। एमजीएफपी पंक्टा न्यूरल ट्यूब की आसन्न कोशिकाओं के बीच माइग्रेटिंग नोटोकॉर्ड और फ्लोरप्लेट (एरोहेड) और (बी, बी ') के बीच दिखाई देता है। (सी, सी') एफ-एक्टिन धुंधला तंत्रिका ट्यूब (तीर) के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं पर किसी भी स्पष्ट साइटोनेम का पता लगाने में विफल रहता है। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षिप्त नाम: एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig03.jpg"> चित्रा 3: इष्टतम और सबऑप्टिमल वाइब्रेटोम ऊतक वर्गों और तंत्रिका ट्यूब फर्श प्लेट, नोटोकॉर्ड और आसपास की कोशिकाओं के धुंधला होने के उदाहरण। नाजुक रूप से संभाले गए वर्गों (ए, सी) के उदाहरण, (बी) एक मुड़ा हुआ ऊतक अनुभाग और (डी) एक श-क्रे से खराब ढंग से संभाला गया अनुभाग; रोजा 26 एमटीएमजी और एक एसएचएचजीएफपी / + भ्रूण 19,20,21। इष्टतम रूप से संभाले गए अनुभाग आसन्न स्थानीयकृत फर्श प्लेट तंत्रिका उपकला कोशिकाओं (ए, एरोहेड्स) के बीच साइटोनेम्स का पता लगाने की अनुमति देते हैं। तंत्रिका ट्यूब आसन्न नोटोकॉर्ड (ए, एमजीएफपी-एक्सप्रेसिंग) और मेसेनकाइमल कोशिकाओं (ए, तीर) को दिखाई देना चाहिए। (सी, डी) एफ-एक्टिन- और डीएपीआई-दाग वाले वर्गों में तंत्रिका ट्यूब और नोटोकॉर्ड (सी) के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं और एफ-एक्टिन-आधारित साइटोनेम्स (तीर) की लगातार रिक्ति होनी चाहिए। अनुभागों के किसी भी मामूली तह या व्यवधान से अंतराल और टूटे हुए एफ-एक्टिन टुकड़े (डी, एरोहेड्स) हो सकते हैं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

यहां, माउस ऊतकों के विकास में साइटोनेम्स नामक विशेष सिग्नलिंग फिलोपोडिया का पता लगाने के लिए भ्रूण के निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और सेक्शनिंग के लिए एक अनुकूलित चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।

साइटोनेम विश्लेषण के लिए भ्रूण माउस ऊतक का निर्धारण

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे भ्रूण में निश्चित माउस ऊतक में साइटोनेम्स की कल्पना कर सकते हैं। इस तकनीक का उपयोग करके, हम अंतर्जात सिग्नलिंग प्रोटीन के लिए जांच कर सकते हैं जो आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए माउस मॉडल पर भरोसा करने के बजाय साइटोनेम्स के साथ यात्रा करते हैं जो फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, साइटोनेम्स के इष्टतम संरक्षण के लिए ऊतक वर्गों को धीरे-धीरे संभालना महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरे समूह में एक प्रमुख शोधकर्ता मरियम डिलार्ड और सेंट जूड स्नातक छात्र क्रिस्टीना डेली होगा। शुरू करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा के लिए वाई चीरा बनाने के लिए विदारक कैंची और संदंश का उपयोग करें। ई 9.5 भ्रूण युक्त गर्भाशय का उत्पाद शुल्क।पूर्ण डीएमईएम विकास माध्यम में भ्रूण विच्छेदन। जर्दी एसएसी, नाल, और आसपास झिल्ली को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। किसी भी अवशिष्ट एमनियोटिक ऊतक और रक्त को हटाने के लिए एचबीएसएस में पृथक भ्रूण कुल्ला।अगला, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड की कामकाजी एकाग्रता के लिए एचबीएसएस में पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़कर फिक्सेटिव तैयार करें। 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें। भ्रूण को अलग-अलग कुओं में रखें।एक घुमाव पर कोमल आंदोलन के साथ 45 मिनट के लिए भ्रूण सेते हैं। इनक्यूबेशन के बाद, फिक्सेटिव को हटा दें और भ्रूण को तीन बार धो लें, अतिरिक्त कैल्शियम, मैग्नीशियम और 0.1% ट्राइटन के साथ पीबीएस में 30 मिनट के लिए। फिर एक घंटे के लिए दो बार कोमल आंदोलन के साथ समाधान को अवरुद्ध करने में भ्रूण सेते हैं।दूसरे इनक्यूबेशन के बाद, ताजा अवरुद्ध समाधान का उपयोग करके भ्रूण कुल्ला। इस बीच, पूरक पीबीएस में एंटीबॉडी को पतला करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। कुल्ला पूरा होने के बाद, अवरुद्ध समाधान को हटा दें और प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें।तीन दिनों के लिए कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, 20 आरपीएम पर घुमाव पर एक घंटे के लिए पूरक पीबीएस के साथ भ्रूण को पांच बार धो लें। फिर प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें।तीन दिनों के लिए अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर कोमल कमाल के साथ थाली सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पूरक पीबीएस में 30 मिनट के लिए तीन बार भ्रूण धो लें। कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में कम पिघलने बिंदु एगरोज के वजन से 4% समाधान तैयार करें।इसके साथ ही, 55 डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में 12-अच्छी तरह से प्लेट रखें और प्रत्येक कुएं में तीन मिलीलीटर एगरोज जोड़ें। अगला, प्लेट को एक बेंच टॉप पर रखें और छिद्रित चम्मच का उपयोग करके भ्रूण को अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करें। धीरे एम्बेड और भ्रूण उन्मुख इस तरह है कि यह समाधान के भीतर केंद्रित है करने के लिए विंदुक युक्तियों का प्रयोग करें।एक बार भ्रूण उन्मुख होने के बाद, प्लेट को जमने के लिए 10 मिनट के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर एक स्केलपेल का उपयोग करके, पूरे एगरोज़ ब्लॉक को कुएं से हटा दें। भ्रूण के चारों ओर एक आयताकार ब्लॉक काटें, प्रत्येक तरफ ब्लॉक के लगभग 0.3 सेंटीमीटर छोड़ दें।भ्रूण के पुच्छल अंत के साथ ब्लॉक की एक अतिरिक्त लंबाई छोड़ दें। वाइब्रेटोम पर भ्रूण को माउंट करने के लिए, पहले नमूना धारक को टेप की एक पट्टी लागू करें। ब्लॉक के ऊपरी भाग में एक ईमानदार स्थिति में भ्रूण को उन्मुख करें और टेप के लिए एगरोज़ ब्लॉक को सुपर गोंद करें, जैसे कि ब्लेड पूर्वकाल से पीछे के अनुक्रम में अक्षीय वर्गों को उत्पन्न करेगा।अगला, नमूने को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए ठंडे एचबीएसएस के साथ वाइब्रेटोम कक्ष भरें और फिर बर्फ के साथ कक्ष को घेर लें। वाइब्रेटोम पर पैरामीटर सेट करें और भ्रूण के सीरियल अक्षीय सेक्शनिंग का प्रदर्शन करें। एचबीएसएस से भरे एक अलग पकवान के लिए अलग-अलग वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।ऊतक क्षति और साइटोनेम्स के विनाश से बचने के लिए केवल अगारोज को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करना याद रखें। एफ-एक्टिन धुंधला करने के लिए, एचबीएसएस को हटा दें और पूरक पीबीएस में एक्टिनरेड और डीएपीआई समाधान के साथ 40 मिनट के लिए अनुभागों को सेते हैं। इनक्यूबेशन बाद, पूरक पीबीएस में 20 मिनट के लिए तीन बार अनुभागों को धो लें।हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन के साथ, एक चार्ज किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड के किनारों के चारों ओर एक बाधा खींचें और भरण क्षेत्र में एचबीएसएस की एक छोटी मात्रा जोड़ें। उसके बाद, स्लाइड करने के लिए अनुभागों को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। संदंश का उपयोग कर अतिरिक्त अगरोज़ निकालें।एक बार जब सभी वर्गों को स्लाइड में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो पाइपिंग और एक शोषक तौलिया के कोने का उपयोग करके अतिरिक्त तरल को हटा दें। फिर स्लाइड में बढ़ते माध्यम की कई बूंदें जोड़ें। स्लाइड पर धीरे-धीरे रखकर कवर स्लिप माउंट करें।विश्लेषण के लिए, एक कॉन्फोकल या किसी भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप पर जीनोटाइप प्रति न्यूनतम तीन भ्रूणों के लिए ऊतक वर्गों की इमेजिंग करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार सही ढंग से उन्मुख अनुभाग यहां दिखाए गए हैं। वाइब्रेटोम सेक्शनिंग की तुलना में, ऊतक के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग ने सेलुलर एक्सटेंशन को संरक्षित नहीं किया।नोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब की कोशिकाओं के बीच और क्रायोस्टैट वर्गों में आसन्न तंत्रिका ट्यूब कोशिकाओं के बीच कुछ जीएफपी-पॉजिटिव झिल्ली के टुकड़े पाए गए थे। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं में सेलुलर एक्सटेंशन के एफ-एक्टिन धुंधला क्रायोस्टैट वर्गों में बिगड़ा हुआ था। वाइब्रेटोम सेक्शनिंग ने पूरे भ्रूण और व्यक्तिगत ऊतक वर्गों के न्यूनतम व्यवधान को सुनिश्चित किया।इष्टतम रूप से संभाले गए वर्गों ने आसन्न स्थानीयकृत फर्श प्लेट तंत्रिका उपकला कोशिकाओं और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के बीच स्टायोनेम्स का पता लगाने की अनुमति दी। मुड़े हुए या बकसुआ वर्गनोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब के उदर फर्श प्लेट के बीच एक बड़े पृथक्करण से स्पष्ट थे। और उपकला कोशिकाओं के बीच पलायन सेलुलर झिल्ली एक्सटेंशन का नुकसान।एफ-एक्टिन और डीएपीआई-दाग वाले वर्गों में तंत्रिका ट्यूब और नोटोकॉर्ड के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं और टायोनेम्स की लगातार रिक्ति थी। वर्गों के लिए मामूली विकृतियों ने एक्टिन-आधारित एक्सटेंशन के विखंडन और कोशिकाओं के बीच बड़े अंतराल का कारण हो सकता है, जो नाजुक हैंडलिंग की आवश्यकता को रेखांकित करता है। भ्रूण सेक्शनिंग के बाद, ऊतक वर्गों के किसी भी झुकने या तह को कम करना अनिवार्य है।साइटोनेम्स के टूटने को रोकने के लिए। इस तकनीक का उपयोग करके, हम सीधे कल्पना कर सकते हैं कि सिग्नलिंग अणु, जैसे मॉर्फोजेन ऊतकों में कैसे फैले हुए हैं। यह हमें नई अंतर्दृष्टि दे रहा है कि ऊतकों और अंगों को कैसे पैटर्न किया जाता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Transcriptional विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर Zebrafish भ्रूण दिल विच्छेदन

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

भ्रूण माउस दिल में immunofluorescence का उपयोग cardiomyocyte विकास का विश्लेषण

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

भ्रूण मेकेल कार्टिलेज में Zebrabow क्लोनल सेल विश्लेषण के माध्यम से उपास्थिकोशिका अंतनिवेश और दिशात्मक प्रसार के दृश्य

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

प्रतिलेखन कारक के साथ माउस भ्रूणीय Fibroblasts Reprogramming एक Hemogenic कार्यक्रम प्रेरित करने के लिए

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

साफ भ्रूण दिल में कोरोनरी वाहिकाओं का विश्लेषण

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में संरचना-समारोह अध्ययन Recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज का उपयोग करना

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

भ्रूणीय एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिटेटिव विश्लेषण<em&gt; ज़ीनोपस ट्रॉपिकलिस</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

माउस भ्रूणीय किडनी की विच्छेदन और संस्कृति

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...