Name: fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis
Uploaded: 2022-06-16T14:15:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis at JoVE.com

Bilder förvärvades med hjälp av mikroskop som underhålls av Cell and Molecular Biology Imaging Core vid St. Jude Children's Research Hospital. Musstammar erhölls från JAX. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag R35GM122546 (SKO) och av ALSAC från St. Jude Children's Research Hospital.

Detta protokoll följer de godkända riktlinjerna för djurvård från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och St. Jude Children's Research Hospital. Alla stammar backcrossades fem generationer till C57BL /6J-stammen.
1. Embryoisolering och färgning av hela fästet
<ol><li>Ras 6 veckor gamla kvinnor och övervaka närvaron av vaginal plugg.</li>
	<li>Avliva den gravida dammen genom CO2-inandning i en CO2-kammare följt av cervikal dislokation enligt AVMA-riktlinjerna18. Gör ett Y-snitt i bukhålan med hjälp av dissekerande sax och pincett. Skär ut livmodern som innehåller E9.5-embryona enligt godkända institutionella riktlinjer.</li>
	<li>Dissekera embryona i fullständigt tillväxtmedium (Dulbeccos modified eagle medium, kompletterat med icke-essentiella aminosyror, Na-pyruvat, L-glutamin och 10% fetalt bovint serum). Använd pincett för att ta bort äggula sac, placenta, och omgivande membran. OBS: Vid behov, spara varje äggula sac för embryo genotypning.</li>
	<li>Skölj de isolerade embryona i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att avlägsna eventuell kvarvarande fostervattenvävnad och blod.</li>
	<li>Förbered fixeringsmedlet. Tillsätt paraformaldehyd (PFA) till HBSS för en slutlig arbetskoncentration på 4% PFA. VARNING: PFA är en giftig kemikalie, så inandning eller direkt hudexponering måste undvikas. Beredning av fixeringslösningen utförs under en dragskåp med rätt personlig skyddsutrustning av handskar och en labbrock.</li>
	<li>Tillsätt 1 ml fixativ till varje brunn på en 24-brunnsplatta och placera varje embryo i en enskild brunn. Inkubera embryona i fixativ i 45 min med mild agitation på en rocker. OBS: Kritisk: Alla tvättar och inkubationer måste göras med mild omrörning (maximalt 20 rpm) på en vippa eller cirkulär shaker, eftersom abrupt hantering eller rörelse av embryona kommer att förstöra de fasta cytonemerna. Använd en pipett för att försiktigt ta bort alla lösningar.</li>
	<li>Ta bort fixeringsmedlet och tvätta embryona 3 x 30 min i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Ca2+ och Mg2+ med tillsats av 0,1% Triton.</li>
	<li>Efter tvättning inkubera embryona i blockerande lösning (PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Triton och 5% getserum) med mild omrörning. Block 2 x 1 h. Efter den andra blockerande inkubationen, utför en snabb sköljning av embryon med ny blockeringslösning.</li>
	<li>Under det andra blockeringssteget, förbered den primära antikroppslösningen11. Späd antikropparna till den optimerade koncentrationen i PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Tween-20 och 5% getserum. OBS: För förbättrad visualisering av membran GFP kan kyckling anti-GFP (1:250) användas.</li>
	<li>Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 1 ml primär antikroppslösning till varje brunn. Inkubera vid 4 °C med försiktig rotation i 3 dagar.</li>
	<li>Efter den primära antikroppsinubationen, tvätta embryona 5 x 1 h vid 20 rpm på en vippa i PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Tween-20 och 5% getserum.</li>
	<li>Bered den sekundära antikroppslösningen med F(ab')2-fragmentsekunderärer vid en spädning på 1:1 000 i PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1 % Tween-20 och 5 % getserum. OBS: Användning av F (ab ') 2-fragment förbättrar kraftigt antikroppspenetrationen i provet.</li>
	<li>Tillsätt 1 ml sekundär antikroppslösning till varje brunn. Inkubera med försiktig gungning vid 4 °C i mörker i 3 dagar. OBS: Viktigt: Från och med nu, minimera embryoexponeringen för direkt ljus. Valfritt: För att förhindra bakterietillväxt, tillsätt 0,2% natriumazid till den sekundära antikroppslösningen.</li>
	<li>Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta embryona 3 x 30 min i PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Tween-20 och 5% getserum. Om du inte utför aktinfärgning med falloidin eller andra aktinfärger, tillsätt 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) efter den första tvätten till PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Tween-20 och 5% getserum och inkubera i 1 timme, följt av 3 x 30 min tvättar enligt beskrivningen ovan. OBS: Vid denna tidpunkt kan embryona förvaras över natten vid 4 °C i PBS eller HBSS i mörker fram till inbäddningssteget följande dag. Det rekommenderas dock att embryon bäddas in och sektioneras omedelbart.</li>
</ol>2. Inbäddning, sektionering och montering av embryon
<ol><li>Bered en 4% w / v LMP-agaroslösning upplöst i HBSS eller PBS med Ca2+ och Mg2+ till en slutlig volym på ~ 3 ml per embryo. Tillsätt lämplig vikt av LMP-agaros till HBSS eller PBS med Ca2+ och Mg2+ och mikrovågsugn tills LMP-agarosen är upplöst. OBS: När LMP-agarosen är upplöst, förvara lösningen i ett pärlbad, en inkubator eller ett vattenbad inställt på 55 °C för att förhindra att LMP-agaroslösningen stelnar.</li>
	<li>Använd en 12-brunnsplatta som inbäddningsform för embryon. Placera 12-brunnsplattan i 55 °C pärlbadet. Tillsätt 2,5-3 ml 4% LMP-agaros till varje brunn som kommer att hålla ett embryo. OBS: Även om andra formar kan användas, är 12-brunnsplattvolymer optimala för beredning av agarosblocket i senare skeden för sektionering.</li>
	<li>Överför embryona med en perforerad sked till enskilda brunnar som innehåller 4% LMP-agaroslösning (figur 1A).<ol>
<li>Överför 12-brunnsplattan från pärlbadet till en bänkskiva. Använd pipettspetsar för att försiktigt bädda in och orientera embryot så att det är centrerat i lösningen. När embryona är orienterade, placera plattan vid -20 °C i 10 minuter för att möjliggöra snabb stelning av blocket. KRITISK: Se till att embryot är placerat i mitten av blocket. Embryon som sjunker till botten eller är för nära formens kant kommer sannolikt att lossna från agarosblocket under sektionering.</li>
	</ol></li>
	<li>Ta bort hela agarosblocket från brunnen med en skalpell och skär ett rektangulärt block runt embryot och lämna ~ 0,3 cm block på varje sida. Tillåt extra längd längs embryonets kaudala ände. När det är monterat på vibratomet, orientera embryot i upprätt läge i blockets övre del (figur 1B).</li>
	<li>Applicera en tejpremsa på provhållaren av vibratomet och superlimma agarosblocket på tejpen, orienterad så att bladet kommer att generera axiella delar av embryot i en främre (kranial) till bakre sekvens.</li>
	<li>Fyll vibratomkammaren med kall HBSS för att säkerställa att provet är helt nedsänkt och omge sedan kammaren med is.</li>
	<li>Ställ in vibrationshastigheten på 0,2 mm/s och frekvens mellan 5 och 7 (50-70 Hz) med skärtjocklek inställd på 100 μm. Utför seriell axiell sektionering av embryot. OBS: Använd en långsam hastighet för sektionering. Om skärhastigheten ökas över 0,25 mm/s kan sektionering riva embryot eller lossa embryot från blocket.<ol>
<li>Under sektioneringsserien, använd pincett för att försiktigt överföra enskilda sektioner till en separat 60 mm skål fylld med HBSS. Använd pincett för att ta tag i blocket, inte vävnaden, för att undvika vävnadsskador och förstörelse av cytonem. OBS: Vävnadssektioner bör förbli inom agarosblocket. Om vävnaden faller ut ur blocket in i vibratomkammaren, överför försiktigt genom att lyfta ut sektionen. Ta inte tag i eller nyp i vävnaden. KRITISK: Varje vikning av vävnadssektioner eller abrupt hantering kommer att förstöra fasta cytonem i vävnadssektionerna.</li>
	</ol></li>
	<li>Om du inte utför F-aktinfärgning, fortsätt till steg 2.10.<ol>
<li>För att utföra F-aktinfärgning, ta bort HBSS och inkubera sektioner i 40 minuter med Actin-Red och DAPI-lösning utspädd i PBS med Ca2+ och Mg2+, 0,1% Tween-20 och 5% getserum vid rumstemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Tvätta sektionerna 3 x 20 min i PBS med Ca2+ och Mg2+ och 0,1% Tween-20.</li>
	<li>Använd en hydrofob markörpenna och rita en hydrofob barriär runt kanterna på ett laddat mikroskopglas och lägg till en liten volym HBSS för att fylla området.</li>
	<li>Använd pincett eller en perforerad sked för att överföra sektioner till bilden. OBS: Alla vävnadssektioner som inte är inneslutna i agaros kan överföras via en överföringspipett.</li>
	<li>Ta bort överflödigt agarosblock med pincett.</li>
	<li>När alla sektioner har överförts till bilden, ta bort överflödig vätska via pipettering och hörnet på en absorberande handduk och tillsätt sedan flera droppar monteringsmedium till bilden. Använd tillräckligt med monteringsmedium för att täcka hela täckglasområdet när det härdas. Montera täckglaset genom att försiktigt placera det på bilden. OBS: Undvik att applicera tryck eller störande täckglas tills monteringsmediet har härdat.</li>
</ol>3. Bildbehandling
<ol><li>Utför avbildning av vävnadssektioner på alla konfokala eller högre upplösningsmikroskop11. Analysera minst tre embryon per genotyp. OBS: Bilder av vävnadssektioner förvärvades med hjälp av ett TCS SP8 STED 3x konfokalmikroskop, följt av LIGHTNING-dekonvolution.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+embryogenesis.">Diffusion in embryogenesis.</a> Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freely+diffusible+form+of+Sonic+hedgehog+mediates+long-range+signalling.">A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling.</a> Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).</li><li>Yu, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules.">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+extracellular+diffusion+creates+the+Dpp+morphogen+gradient+of+the+Drosophila+wing+disc.">Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc.</a> Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).</li><li>Ribes, V., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+and+interpreting+graded+Sonic+Hedgehog+signaling+during+vertebrate+neural+tube+patterning:+the+role+of+negative+feedback.">Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).</li><li>Le Dr&#233;au, G., Mart&#237;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube:+a+tale+of+three+signals.">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).</li><li>Kornberg, T. B., Guha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+morphogen+gradients:+a+problem+of+dispersion+and+containment.">Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (4), 264-271 (2007).</li><li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes:+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs.">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li><li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning.">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li><li>Bischoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+are+required+for+the+establishment+of+a+normal+Hedgehog+morphogen+gradient+in+Drosophila+epithelia.">Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia.</a> Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).</li><li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme+delivery+of+sonic+hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+dispatched-BOC/CDON+co-receptor+complex.">Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> eLife. 10, 61432 (2021).</li><li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+must+express+components+of+the+planar+cell+polarity+system+and+extracellular+matrix+to+support+cytonemes.">Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes.</a> eLife. 5, 18979 (2016).</li><li>Brunt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vangl2+promotes+the+formation+of+long+cytonemes+to+enable+distant+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Mattes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/PCP+controls+spreading+of+Wnt/&#946;-catenin+signals+by+cytonemes+in+vertebrates.">Wnt/PCP controls spreading of Wnt/&#946;-catenin signals by cytonemes in vertebrates.</a> eLife. 7, 36953 (2018).</li><li>Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixation+method+to+preserve+cultured+cell+cytonemes+facilitates+mechanistic+interrogation+of+morphogen+transport.">A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport.</a> Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).</li><li>Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserve+cultured+cell+cytonemes+through+a+modified+electron+microscopy+fixation.">Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation.</a> Bio-protocol. 8 (13), (2018).</li><li>American Veterinary Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals.</a> American Veterinary Medical Association. , (2020).</li><li>Harfe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning.">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 368-380 (2006).</li><li>Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+glutaraldehyde+fixation.+A+new+procedure+based+on+the+Schiff-quenching+method.">Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method.</a> Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+fluorescent+imaging+in+scattering+specimens+using+confocal+microscopy.">Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).</li></ol>

Författarna har inga konkurrerande intressen att deklarera.

Detta protokoll utvecklades för bevarande av känsliga cytonem i embryonala vävnadssektioner för högupplöst fluorescensmikroskopi. Hittills har visualisering av cytonem i vävnad över olika modellorganismer till stor del förlitat sig på ektopiskt uttryck av fluorescerande märkta proteiner med hjälp av levande vävnadsavbildning. Tyvärr bidrar användningen av fluorescerande märkt levande avbildning sällan till analysen av endogent uttryckta proteiner, kan införa tidsbegränsningar och kräver specialiserade bildsteg och mikroskop. Färgnings- och sektioneringsmetoden som beskrivs här bevarar cytonem och andra cellulära förlängningar för att möjliggöra immunohistokemi för eventuell detektion av endogent uttryckta proteiner. Denna teknik kommer att underlätta nya insikter om hur morfogener transporteras över olika vävnader in vivo och utvidgar omfattningen av modellsystem där cytonem kan studeras.
Detta protokoll använder helmonterad färgning och vibratom tjocksnittning, vilket undviker användning av jämviktslösning såsom glycerol eller kryoskyddande lösningar såsom sackaros. Det syftar till att minimera hanteringen av sektionerad vävnad för att möjliggöra maximalt bevarande av cellulära förlängningar. Minskad hantering av vävnaden efter sektionering gav konsekvent bättre resultat i den totala bevarandet av cytonem. Således är sektionering av embryot ett av de sista stegen före avbildning.
MEM-fix, en fixeringsteknik utvecklad för bevarande av cytonem hos odlade celler, består av en kombination av glutaraldehyd och PFA som möjliggör förbättrad 3D-bevarande av den medfödda cellarkitekturen jämförbar med deras levande dimensioner16,17. Tyvärr var MEM-fix inte användbart för embryofixering eftersom glutaraldehyd kan autofluorescera och allvarligt begränsar antikroppspenetration och epitopbindning i celler på grund av hög proteinkorsbindningsaktivitet22,23. Således optimerades sektioneringsprotokoll efter PFA-fixeringsförhållanden för att möjliggöra bevarande av cellulära förlängningar i embryonal vävnad. Även om PFA kan bevara cytonemliknande förlängningar i embryonal vävnad, bör bildanalys utföras med försiktighet. PFA kan orsaka partiell uttorkning av enskilda celler och vävnader, vilket leder till mindre volymreduktion och bildandet av små extracellulära utrymmen i den fasta vävnaden.
Detta protokoll undviker de extra stegen av sackarosåterhämtning för kryoskydd och vävnadsrensning eftersom sackaros- eller glycerollösningar kan orsaka en mindre returation av vävnaden24. Den resulterande mindre svullnaden kan förstöra fasta cellulära förlängningar och cytonem som migrerar mellan celler och över vävnader. Detta var uppenbart när man jämförde tjocksektionerad vibratom med kryostatsektioner. Även om ökande vävnadstjocklek förbättrade bevarandet av intakta cytonem, hade de sackaros-reproterade kryostatsektionerna konsekvent en lägre förekomst av detekterbara cytonem.
Optimering av detta protokoll avslöjade att 100 μm tjocka sektioner var det bästa för att säkerställa bevarande av intakta cytonem. Tunnare sektioner används vanligtvis för avbildning eftersom de flesta konfokalmikroskop endast kan avbildas med tillräcklig upplösning för att visualisera cellulära förlängningar till ett djup av ~ 20-40 μm utan att rensa25. De mekaniska krafterna och förvrängningen som appliceras på embryonala celler från bladet medan man skär tunna sektioner förstör emellertid cytonem. Tjockare sektioner möjliggör ett större djupområde inom sektionen samtidigt som intakta förlängningar i vävnaden bevaras. Dessutom möjliggör användningen av tjockare sektioner enkel hantering för att förhindra överdriven vikning eller buckling av vävnadssektionerna.
Detta protokoll optimerades för maximal bevarande av cytonem i vävnad av E8-10,5 musembryon. Minimal manipulation av vävnaden efter sektionering gav konsekvent förbättrad övergripande bevarande av cytonem. Det är troligt att ytterligare optimering kommer att krävas för att anpassa tekniken för senare utvecklingsstadier och vuxna vävnadssektioner på grund av ökad storlek och vävnadskomplexitet. Detta kommer att kräva sektionering följt av immunofluorescensfärgning. Sådan vävnad kan kräva ytterligare clearingsteg och anpassning av vävnadshantering under sektionering för att bevara cytonemliknande förlängningar. Dessa ytterligare steg måste övervägas och åtgärdas för framtida tillämpningar av detta protokoll.

Embryonal utveckling orkestreras genom samordnad aktivering av morfogensignaleringsvägar. Morfogener är små, utsöndrade proteiner som kategoriseras i Sonic Hedgehog (SHH), som omvandlar tillväxtfaktor β (TGF-β) / benmorfogent protein (BMP), Wingless-relaterat integrationsställe (WNT) och fibroblast och epidermal tillväxtfaktor (FGF / EGF) familjer. Morfogener produceras och frigörs från cellulära organiseringscentra under vävnadsutveckling och etablerar signalgradienter över organiserande fält av celler för att informera vävnadsmorfogenes 1,2,3,4,5. En representation av morfogengradienter finns i det utvecklande nervsystemet, där det presumtiva centrala nervsystemet mönstras genom morfogenvägsaktivering. Denna vävnad, kallad neuralröret, består av motsatta gradienter av SHH som utsöndras av den ventrala mest notokord- och golvplattan, och WNTs / BMP utsöndras från dorsala takplattan, för att mönstra distinkta neurala stamfaderregioner6. Neuralröret används ofta för att förhöra morfogengradientintegritet i utvecklingsforskning.
Morfogengradientbildning är beroende av tät reglering av signaldispersion7. En cellulär mekanism genom vilken detta sker är genom bildandet av långa signalerande filofodier som kallas cytonem som underlättar direkt leverans av morfogener från signalproducerande celler till specifika målcellpopulationer. Cytonem har observerats sträcka sig hundratals mikrometer för att deponera morfogener på signalmottagande cellmembran 8,9. Störning av cytonemmedierad morfogentransport leder till utvecklingsavvikelser hos både flugor och ryggradsdjur, vilket belyser deras betydelse under vävnadsmönster 10,11,12,13,14.
Hittills har cytonem dokumenterats i Drosophila-, kyckling- och zebrafiskmodeller, men avbildning av strukturerna vid utveckling av däggdjursembryon är fortfarande utmanande 8,9,15. Ett hinder för att effektivt avbilda cytonem i komplexa däggdjursvävnader in situ är deras tunna och ömtåliga natur, vilket gör dem mottagliga för skador med konventionella fixeringsmetoder8. Vi hade tidigare utvecklat och optimerat protokoll för ett modifierat elektronmikroskopifixativ (MEM-fix) för att bevara cytonem i odlade celler och möjliggöra deras studie med konfokalmikroskopi16,17.
Användning av MEM-fix-tekniken har möjliggjort identifiering av några av de molekyler som är involverade i SHH-inducerad cytonembildning och funktion 11,16,17. Bekräftelse av dessa fynd i det fysiologiskt relevanta sammanhanget för neuralrörsmönster krävde dock utveckling av nya tekniker för att fixera och avbilda musembryonvävnad. Ett protokoll för att fixera musembryon på ett sätt som upprätthåller cytonemintegritet och tillåter immunfärgning och efterföljande sektionering av embryonal vävnad för konfokal analys beskrivs här. Detta protokoll utvecklades med hjälp av ett membranbundet grönt fluorescerande protein (GFP) för att märka membranförlängningar från de SHH-producerande cellerna i det utvecklande neuralröret. Genomförandet av detta protokoll kommer att ta itu med obesvarade frågor som rör förekomsten och betydelsen av cytonem vid utveckling av däggdjurssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628 (Fisher Scientific 12-565-321)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate, Round Nunc</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>353004 (Fisher Scientific 08772F)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark KIMTECH</td>
			<td>34155 (Fisher Scientific 06666A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin Red 555 ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Lab Inc</td>
			<td>703-546-155</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bath 6L 230V</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706)</td>
			<td>set to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>SKU GFP-1020</td>
			<td>1:250 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>model: Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (Vannas Scissors)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel #10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>Catalog No.NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose- UltraPure</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC 17 BIS Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>1037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>P36961&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:008466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:005622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J (B6)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:007576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + Ca2+ + Mg2+&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 &#181;L</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, polyethylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z135003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-047-113Q</td>
			<td>set to 20 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosytems</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fixation of embryonic mouse tissue for cytoneme analysis

Utvecklingsvävnadsmönster och postdevelopmental vävnadshomeostas beror på kontrollerad leverans av cellulära signaler som kallas morfogener. Morfogener verkar på ett koncentrations- och tidsberoende sätt för att specificera distinkta transkriptionsprogram som instruerar och förstärker cellens öde. En mekanism genom vilken lämpliga morfogensignaltrösklar säkerställs är genom leverans av signalproteinerna med specialiserade filofodier som kallas cytonem. Cytonem är mycket tunna (≤200 nm i diameter) och kan växa till längder på flera hundra mikron, vilket gör deras bevarande för fast bildanalys utmanande. Denna artikel beskriver en förfinad metod för känslig hantering av musembryon för fixering, immunfärgning och tjock sektionering för att möjliggöra visualisering av cytoniner med hjälp av standard konfokalmikroskopi. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att visualisera cytonem som ansluter distinkta cellulära signalfack under utveckling av neuralrör hos mus. Tekniken kan också anpassas för att detektera cytonem över vävnadstyper för att underlätta förhör av utvecklingssignalering med oöverträffad upplösning.

Användning av en större form av en 12-brunnsplatta med 2,5-3 ml agaroslösning per brunn var idealisk för inbäddning och suspension av flera embryon under en kort tidsperiod (figur 1A). Överskottsområdet möjliggör korrekt orientering vid skärning av agarosblocket för sektionering. Vid skärning av agarosblocket är det viktigt att bibehålla överskott av agaros längs botten av blocket där det kommer att limmas på tejpen på objekthållaren. Embryot ska vara i den övre halvan av blocket (Figur 1B). Den nedre delen bör dock inte vara för stor eftersom överflödigt block ökar chansen att ändra skärvinkeln när bladet skjuter in i blocket under sektionering. Exempel på korrekt orienterade sektioner visas (figur 1C,D).
Under utvecklingen av detta protokoll jämfördes vibratomsektionering med kryostatsektionering. Kryostatsnittning av vävnaden bevarade sällan cellulära förlängningar (figur 2 kryostat och figur 3A, B vibratom). Kryostatsektioner möjliggjorde detektion av vissa GFP-positiva membranfragment mellan celler i notokordet och neuralröret (figur 2A pilspets) och mellan intilliggande neuralrörsceller (figur 2B, B ' pilspetsar). F-aktinfärgning av cellulära förlängningar i de mycket trådformiga mesenkymala cellerna som omger nervröret försämrades emellertid i kryostatsektioner (figur 2C, C ' pil, vs figur 3C, D). Dessa kryostatresultat indikerar att endast vissa spår av trasiga cellulära förlängningar kvarstår efter denna metod. Således föredras vibratomsektionering för att effektivt bevara dessa känsliga förlängningar för efterföljande analys.
Minimal störning av hela embryot och enskilda vävnadssektioner är avgörande för högkvalitativ avbildning av cellulära förlängningar. Vävnadssektioner som har genomgått någon vikning eller buckling kommer att framgå av frånvaron av notokordet eller en stor separation (>30 μm) mellan notokordet och det ventrala golvplattan i nervröret (figur 3B). Detta åtföljs vanligtvis av förlust av mesenkymala celler som normalt omger nervröret (figur 3A, pil). Skadade sektioner kommer också att resultera i en förlust av synliga cellulära membranförlängningar som migrerar mellan epitelceller (figur 3B jämfört med figur 3A, pilspetsar). Även mindre snedvridningar av sektionerna kan orsaka fragmentering av aktinbaserade förlängningar och stora luckor bildas mellan celler (figur 3D, pilspetsar, jämfört med välbevarad figur 3C), vilket understryker behovet av känslig hantering i alla steg.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig01.jpg"> Figur 1: Exempel på E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG färgat, inbäddat och snittat embryo. (A) Ett enda embryo i en 12-brunnsplatta, inbäddad i 4% LMP-agaros. (B) Exempel på ett korrekt orienterat embryo i agarosblocket som skurits ner till storlek för vibratommontering. Överskott av agarosblock finns längs botten. (C) Ljusfältsbild av 100 μm tjock embryosektion inbäddad i LMP-agaros. D) Immunofluorescensavbildning av en sektion efter avlägsnande av agaros. Anti-GFP-färgad mGFP (grön) representerar Shh-uttryckande celler i vävnaden, med andra cellinjer som uttrycker membran Tomat (röd), DAPI i blått. Neuralrör (konsol) och mGFP-positiv notochord (pil) är tydligt synliga. Skalstänger = 1 cm (A), 5 mm (B) och 100 μm (C,D). Förkortningar: LMP = låg smältpunkt; mGFP = membrangrönt fluorescerande protein; Shh = Sonisk igelkott; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig02.jpg"> Figur 2: Exempel på kryostatsnittad neuralrörsgolvplatta och notokord med fragmenterade membranförlängningar. Rosa26 mTmG 19,20,21 sektion färgad för GFP (grön), F-aktin (röd) och DAPI (blå). mGFP puncta är synliga mellan notokordet och golvplattan (pilspets) och (B, B ') migrerar mellan intilliggande celler i neuralröret. (C,C') F-aktinfärgning misslyckas med att upptäcka några tydliga cytonem på mesenkymala celler som omger nervröret (pilen). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: mGFP = membrangrönt fluorescerande protein; Shh = Sonisk igelkott; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig03.jpg"> Figur 3: Exempel på optimala och suboptimala vibrationsvävnadssektioner och färgning av neuralrörets golvplatta, notochord och omgivande celler. Exempel på delikat hanterade sektioner (A,C), jämfört med (B) en vikt vävnadssektion och (D) en dåligt hanterad sektion från en Shh-Cre; Rosa26 mTmG och ett ShhGFP/+ embryo 19,20,21. Optimalt hanterade sektioner möjliggör detektering av cytonem mellan intilliggande lokaliserade neurala epitelceller på golvplattan (A, pilspetsar). Neuralrör intill notochord (A, mGFP-uttryckande) och mesenkymala celler (A, pil) ska vara synliga. (C,D) F-aktin- och DAPI-färgade sektioner bör ha konsekvent avstånd mellan mesenkymala celler och F-aktinbaserade cytonem (pilar) som omger nervröret och notokord (C). Varje mindre vikning eller störning av sektionerna kan orsaka luckor och trasiga F-aktinfragment (D, pilspetsar). Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: mGFP = membrangrönt fluorescerande protein; Shh = Sonisk igelkott; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis at JoVE.com

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

Här tillhandahålls ett optimerat steg-för-steg-protokoll för fixering, immunfärgning och sektionering av embryon för att detektera specialiserad signalfilopodi som kallas cytonem vid utveckling av musvävnader.

Fixering av embryonal musvävnad för cytonemanalys

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

Så med hjälp av detta protokoll kan vi visualisera cytonem i fast musvävnad genom hela embryot med standardljusmikroskopi. Med hjälp av denna teknik kan vi söka efter endogena signalproteiner som färdas längs cytonem, snarare än att förlita oss på genetiskt manipulerade musmodeller som använder fluorescerande märkta proteiner. När du försöker detta protokoll är det viktigt att försiktigt hantera vävnadssektioner för optimal bevarande av cytonem.Att demonstrera detta förfarande kommer att vara Miriam Dillard, en ledande forskare i min grupp, och Christina Daly, en doktorand i St.Jude. Börja med att dissekera sax och pincett för att göra ett Y-snitt till bukhålan. Skär livmodern som innehåller E 9,5 embryo.Dissekera embryona i fullständigt DMEM-tillväxtmedium. Använd pincett för att ta bort äggula SAC, placenta och omgivande membran. Skölj de isolerade embryona i HBSS för att avlägsna eventuell kvarvarande fostervattenvävnad och blod.Förbered sedan fixeringsmedlet genom att tillsätta paraformaldehyd till HBSS för en arbetskoncentration av 4% paraformaldehyd. Tillsätt en milliliter av denna lösning till varje brunn på en 24-brunnsplatta. Placera embryona i enskilda brunnar.Inkubera embryona i 45 minuter med mild agitation på en rocker. Efter inkubation, ta bort fixeringsmedlet och tvätta embryona tre gånger, i 30 minuter i PBS med tillsatt kalcium, magnesium och 0,1% Triton. Inkubera sedan embryona i blockerande lösning med mild agitation två gånger, i en timme vardera.Skölj embryona efter den andra inkubationen med ny blockeringslösning. Under tiden beredde du den primära antikroppslösningen genom att späda ut antikropparna i kompletterad PBS. När sköljningen är klar, ta bort blockeringslösningen och tillsätt en milliliter primär antikroppslösning till varje brunn.Inkubera plattan vid fyra grader Celsius med mild rotation i tre dagar. Efter den primära antikroppsinkuationen, tvätta embryona med kompletterad PBS fem gånger i en timme på en vippa vid 20 rpm. Tillsätt sedan en milliliter sekundär antikroppslösning till varje brunn.Inkubera plattan med mild gungning vid fyra grader Celsius i mörkret i tre dagar. Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta embryona tre gånger i 30 minuter i kompletterad PBS. Förbered en 4 viktprocent lösning av agaros med låg smältpunkt i PBS med kalcium och magnesium.Placera samtidigt en 12-brunnsplatta i 55 grader Celsius pärlbad och tillsätt tre milliliter agaros till varje brunn. Placera sedan plattan på en bänkskiva och överför embryona till enskilda brunnar med en perforerad sked. Använd pipettspetsar för att försiktigt bädda in och orientera embryot så att det är centrerat i lösningen.När embryona är orienterade, placera plattan vid minus 20 grader Celsius i 10 minuter för stelning. Använd sedan en skalpell och ta bort hela agarosblocket från brunnen. Skär ett rektangulärt block runt embryot och lämna cirka 0,3 centimeter av blocket på varje sida.Lämna en extra längd av blocket längs embryonets kaudala ände. För att montera embryot på vibratomet, applicera först en tejpremsa på provhållaren. Orientera embryot i upprätt läge i blockets övre del och superlimma agarosblocket på tejpen, så att bladet genererar axiella sektioner i en främre till bakre sekvens.Fyll sedan vibratomkammaren med kall HBSS för att helt fördjupa provet och omge sedan kammaren med is. Ställ in parametrarna på vibratomet och utför seriell axiell sektionering av embryot. Använd pincett för att överföra enskilda sektioner till en separat skål fylld med HBSS.Kom ihåg att använda pincett för att bara hålla agarosen för att undvika vävnadsskador och förstörelse av cytonem. För att utföra F-aktinfärgning, ta bort HBSS och inkubera sektionerna i 40 minuter med ActinRed och DAPI-lösning i kompletterad PBS. Efter inkubation, tvätta sektionerna tre gånger i 20 minuter i kompletterad PBS.Med en hydrofob markörpenna ritar du en barriär runt kanterna på ett laddat mikroskopglas och lägger till en liten volym HBSS i fyllningsområdet. Använd sedan pincett för att överföra sektioner till bilden. Ta bort överskott av agaros med pincett.När alla sektioner har överförts till bilden, ta bort överflödig vätska genom att pipettera och använda hörnet på en absorberande handduk. Lägg sedan till flera droppar monteringsmedium i bilden. Montera locket genom att försiktigt placera det på bilden.För analys, utför avbildning av vävnadssektionerna för minst tre embryon per genotyp på ett konfokalt eller något högupplöst mikroskop. Korrekt orienterade sektioner förberedda med detta protokoll visas här. Jämfört med vibratomsektionering bevarade kryostatsektionering av vävnaden inte cellulära förlängningar.Några GFP-positiva membranfragment detekterades mellan celler i notokordet och neuralröret och mellan intilliggande neuralrörsceller i kryostatsektioner. F-aktinfärgning av cellulära förlängningar i mesenkymala celler som omger nervröret försämrades emellertid i kryostatsektioner. Vibratomsektionering säkerställde minimal störning av hela embryot och enskilda vävnadssektioner.Optimalt hanterade sektioner möjliggjorde detektering av ctyonemer mellan intilliggande lokaliserade neurala epitelceller på golvplattan och mesenkymala celler. Vikta eller spända sektioner syntes av en stor separation mellan nookordet och neuralrörets ventrala golvplatta. Och en förlust av cellulära membranförlängningar som migrerar mellan epitelceller.F-aktin- och DAPI-färgade sektioner hade ett konsekvent avstånd mellan mesenkymala celler och ctyonemer som omger neuralröret och notokord. Mindre snedvridningar av sektionerna kan ha orsakat fragmentering av aktinbaserade förlängningar och stora luckor att bildas mellan celler, vilket understryker behovet av känslig hantering. Efter embryosektionering är det absolut nödvändigt att minimera böjning eller vikning av vävnadssektioner.för att förhindra brytning av cytonem. Med hjälp av denna teknik kan vi direkt visualisera hur signalmolekyler, som morfogener, sprids över vävnader. Detta ger oss nya insikter i hur vävnader och organ mönstras.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskalig Zebrafish Embryonala Hjärta Dissection för Transkriptionell Analys

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analys av kranskärlen i clearade embryonala hjärtan

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-funktionsstudier i mus embryonala stamceller Använda Recombinase-medierad kassett Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissektion och kultur av mus embryonisk njure

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...