Name: rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids
Uploaded: 2022-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids at JoVE.com

Denne undersøkelsen ble utført ved Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI støttes av et tilskudd fra den australske regjeringen. Vi takker Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-byen, Japan, for å gi FUCCI konstruksjoner, Prof. Meenhard Herlyn og Ms Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, for å gi cellen linjer. Vi takker Dr Loredana Spoerri for å gi C8161 cryosection bilder.
Dette arbeidet ble støttet av prosjektstipendier til N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) og Meehan Project Grant (021174 2017002565).

Protokollen beskriver fremstillingen av en tilstrekkelig mengde tumorsfæroider til å montere en 24-brønns plate (ca. 240-360 sfæroider eller 10-15 sfæroider/brønn) ved 200 μL agarosegel per brønn og 500 μL clearingoppløsning per brønn. Hele prosedyren er illustrert i figur 1.
1. 2% agarose-PBS gelpreparat
<ol><li>Vei 0,5 g lavsmeltende agarose (se materialtabell) i en glassflaske og tilsett 25 ml fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Smelt agarose ved å koke løsningen i en mikrobølgeovn i 30-60 s med lokket lukket, men ikke forseglet og med konstant virvling. Sørg for at agarose er fullstendig oppløst og løsningen koker ikke over. MERK: Gel kan lagres ved romtemperatur; kontroller volumet før bruk for å ta hensyn til fordampning. Bring til flytende tilstand (mikrobølgeovn; 20-60 s med virvling) før bruk.</li>
</ol>2. Klargjøring av clearingløsningen
<ol><li>Vei 9 g N, N, N′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) etylendiamin, 22 g urea, 44 g sukrose, 0,1 g Triton X-100 og 24,9 g avionisert vann (se materialtabell). MERK: Det er lettere å veie den omtrentlige mengden N, N, N′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) etylendiamin og justere vekten av andre komponenter for å oppnå ønsket konsentrasjon.</li>
	<li>Varm løsningen i et 56 °C vannbad med konstant blanding og fortsett til alle krystallene er oppløst.</li>
	<li>Hvil løsningen ved romtemperatur slik at boblene som dannes under blanding stiger til overflaten. Løsningen er stabil ved romtemperatur i opptil 2 måneder.</li>
</ol>3. Sfæroid forberedelse
<ol><li>Generer sfæroider ved hjelp av agaroseoverleggsmetoden som tidligere beskrevet 1,3,14. MERK: Sfæroider generert av andre metoder er også kompatible med denne bildeprotokollen.</li>
	<li>Skjær spissen av en 1 ml pipettespiss med en skalpell for å forstørre åpningen. MERK: Alle sfæroider ble håndtert med 1 ml eller 200 μL pipetter med kuttspisser.</li>
	<li>Bruk pipetten til å aspirere sfæroidene fra brønnene og overføre dem til et klart konisk rør på 1,5 ml. Flere sfæroider fra de samme forholdene kan kombineres i samme rør. MERK: La alltid sfæroidene sette seg til bunnen av røret for å aspirere mediet.</li>
	<li>Vask sfæroidene i 1 ml PBS to ganger, tilsett nøytral 4 % forvarmet paraformaldehyd (PFA)-løsning og inkuber sfæroidene ved 37 °C i 20 minutter.</li>
	<li>Fjern PFA-oppløsningen og vask sfæroidene to ganger med 1 ml PBS.</li>
</ol>4. Sfæroid farging
<ol><li>Bruk en pipette til å overføre opptil 15 sfæroider til et 200 μL PCR-rør. MERK: For skjøre sfæroider, monter sfæroidene i gel (trinn 5.1-5.4) før du fortsetter.</li>
	<li>Permeabiliserer cellene ved hjelp av 200 μL på 0,5% Triton X-100 i PBS. Plasser PCR-rør inne i 50 ml skrukorkrør og inkuber sfæroidene i 2 timer ved romtemperatur med mild omrøring. MERK: Alle inkubasjoner gjøres med omrøring på en rotor, rulle eller shaker (se materialtabell) med mindre annet er spesifisert. Dette er viktig for å oppnå jevn farging. Faste sfæroider i PBS kan noen ganger feste seg til sidene av pipettespissen. Skylling av spissen i 0,5% Triton X-100 minimerer sfæroidene fra å feste seg til spissene.</li>
	<li>Erstatt oppløsningen (trinn 4.2) med 200 μL antistofffortynningsbuffer (ABDIL)15 og inkuber over natten ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern ABDIL, tilsett 75 μL primært antistoff i ABDIL, og inkuber ved 4 °C i 2,5 dager.</li>
	<li>Fjern supernatanten og vask med 200 μL PBS med 0,1 % tween og 0,1 % Triton X-100 (PBS-TT) to ganger og inkuber med 200 μl PBS-TT i 4 timer ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern PBS-TT, tilsett 100 μL sekundært antistoff i ABDIL, og inkuber ved 4 °C i 2,5 dager. MERK: DAPI eller annet nukleært fargestoff kan tilsettes på dette stadiet. De fleste fargestoffer krever mindre inkubasjonstid enn antistoffer.</li>
	<li>Fjern supernatanten og vask med 200 μL PBS-TT to ganger og inkuber med 200 μL PBS-TT i 4 timer. Sfæroidene er klare til montering.</li>
</ol>5. Montering
<ol><li>Ved hjelp av en 200 μL pipette, overfør faste og fargede sfæroider til 500 μL PCR-rør ved ett rør per tilstand (ca. 10-15 sfæroider).</li>
	<li>Erstatt oppløsningen med 200 μL av 2 % (w/v) flytende agarosegel og sentrifuge på hurtigspinn (ved fast maksimal hastighet, se materialtabell) ved romtemperatur i 30 s. MERK: Med mindre det monteres umiddelbart, plasser i en varmeblokk ved 50 °C for å unngå gelherding.</li>
	<li>Aspirer sfæroidene i ~ 50 μL flytende agarosegel og dispenser i brønn av en 24-brønns glassbunnplate.</li>
	<li>Før gelen herdes, separer sfæroidene ved hjelp av en pipettespiss i den omkringliggende gelen, og sørg for at sfæroidene er dekket med gel. Legg eventuelt platen på is for å sette gelen raskt. MERK: Antall sfæroider per brønn avhenger av størrelsen på sfæroidene. Sfæroider er plassert langt borte fra hverandre slik at bare en sfæroid kommer inn i synsfeltet mens du avbilder. Dette er viktig for automatisert bildebehandling.</li>
	<li>Tilsett 500 μL ryddeoppløsning (trinn 2) per brønn, slik at gelen er nedsenket. Inkuber ved RT i minst 24 timer og avbild sfæroidene i clearingløsningen. Sfæroider er stabile i denne løsningen i opptil en måned ved romtemperatur og når de er beskyttet mot fordampning.</li>
</ol>6. Bildebehandling
<ol><li>Velg et mål med en arbeidsavstand som er lang nok til å omfatte hele sfæroiden, inkludert monteringshøyden til sfæroiden i fartøyet. MERK: Mål med en arbeidsavstand på 3 mm eller lenger er nødvendig for å avbilde ekvatorialplanet til sfæroidene. Høyere forstørrelsesmål med høyere NA kan gi bedre oppløsning, men vil begrense den maksimale dybden som sfæroidene kan avbildes på.</li>
	<li>For å identifisere ekvatorialplanet, juster fokuset til det største overflatearealet er nådd i XY-planet og bildet med den nødvendige lasereffektprosenten, detektorspenningen, forsterkningen og offset-innstillingene. MERK: Lasereffektprosenten, detektorspenningen, forsterkningen og forskyvningen vil variere sterkt avhengig av fluorofor, fargeintensitet, laserintensitet, detektorfølsomhet osv.</li>
	<li>For 3D-bilder angir du start og slutt på sfæroidene, og velger passende signalintensitet ved forskjellige z-dybder ved hjelp av z-intensitetskorreksjonsinnstillinger før avbildning. MERK: For best bildeoppløsning, bruk Nyquist samplingsfrekvens for x, y og z (for detaljer, se referanse16).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids.">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery.">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).</li><li>Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+quantitative+and+spatial+analysis+of+tumour+spheroids:+A+proposed+tool+to+predict+patient-specific+therapy+response.">Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response.</a> Frontiers in Digital Health. 3, 668390 (2021).</li><li>N&#252;rnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures:+Simplicity+forward.">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20 (2020).</li><li>Kabadi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+the+depths:+Techniques+for+in+vitro+three-dimensional+microtissue+visualization.">Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization.</a> BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li><li>Spoerri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+melanoma+heterogeneity+is+regulated+through+cell-matrix+interaction-dependent+changes+in+tumor+microarchitecture.">Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth,+invasion,+and+drug+response.">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).</li><li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+spheroids+for+3D+fluorescent+microscopy:+combining+safe+and+soft+chemicals+with+deep+convolutional+neural+network.">Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network.</a> bioRxiv. , 428996 (2021).</li><li>Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+characterization+of+3-D+cell+culture+models+grown+in+spheroid+microplates.">Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates.</a> American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).</li><li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D:+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods.">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+cycle+imaging+in+a+3D+cell+culture+model+of+melanoma.">Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Dilution+Buffer+(Abdil).">Antibody Dilution Buffer (Abdil).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 20-42 (2006).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Browning, A. P., Murphy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Browning, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+tumour+spheroid+structure.">Quantitative analysis of tumour spheroid structure.</a> eLife. 10, 73020 (2021).</li><li>Klowss, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stochastic+mathematical+model+of+4D+tumour+spheroids+with+real-time+fluorescent+cell+cycle+labelling.">A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling.</a> Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).</li><li>Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+interpreting+4D+tumour+spheroid+experiments.">Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments.</a> Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).</li></ol>

Olympus bidro til kostnadene ved publisering.

En protokoll for å oppnå to- og tredimensjonale bilder av tumorsfæroider av høy kvalitet presenteres her. Eksisterende metoder, som CLARITY, See deep brain (SeeDB) og ScaleS, forårsaker ofte størrelsesforvrengning med opptil 30%, mens teknikker som benzylalkohol/ benzylbenzoat (BABB) og 3D-avbildning av løsemiddelklarerte organer (3DISCO) kan slukke fluorescerende protein18. Mange av disse metodene er designet for å rydde vev med strukturell integritet og forvrenge størrelsen og strukturen når de brukes på sfæroider18. I motsetning til andre protokoller som bruker kommersielt tilgjengelige dyre clearingløsninger, bruker denne protokollen lett tilgjengelige forbruksvarer samtidig som den opprettholder optisk klarhet og endogen fluorescens og minimerer størrelsesforvrengning. Innebygging av sfæroider i agarose-PBS gel gir strukturell støtte til sfæroider og minimerer osmotisk støt når clearingløsningen tilsettes. Dette er avgjørende ved avbildning av skjøre sfæroider etter medikamentell behandling. Det antas at denne optiske clearingmetoden er egnet for sfæroider dannet ved en hvilken som helst metode siden denne protokollen er tilpasset fra helvevsrydding. Antagelsen er basert på likheten i sfæroider oppnådd ved forskjellige sfæroidformasjonsmetoder. Valget av fikseringsmiddel kan påvirke sfæroidstørrelsen så vel som endogen fluorescens. Denne clearingmetoden er egnet for sfæroider festet med nøytral 4% PFA-løsning. Ytterligere testing er nødvendig for å kontrollere kompatibiliteten med andre fikseringsmidler.
Gitt at denne teknikken gjør det mulig å montere flere sfæroider samtidig i en flerbrønnsplate, er den godt egnet til kvantitative analyserørledninger som krever sfæroidstrukturinformasjon fra opptil 360 sfæroider per 24-brønns plate. Mikroskoper med automatiserte scene- og platekartleggingsfunksjoner kan gjøre bildebehandling mindre manuell. Selv om denne metoden er raskere og enklere enn seksjonering, er den for tiden uegnet for fullstendig automatisering. Imidlertid er bilder oppnådd ved denne metoden egnet for automatisert bildebehandling 4,19, og hastigheten som sfæroider kan monteres ved hjelp av denne protokollen, gir kvantitativ analyse av sfæroid indre struktur 20,21,22.
For farging av hele sfæroider må antistoffkonsentrasjonen, volumet og inkubasjonstiden optimaliseres for hvert antistoff. Som en veiledning, bruk 2,5x av den anbefalte 2D immunfluorescens antistoffkonsentrasjonen og 100-200 μL antistoff, avhengig av antall sfæroider per rør. Sørg for at alle sfæroider er dekket av fargeløsning når de er på rotoren. Inkubasjonstiden avhenger av mange faktorer, inkludert størrelsen og tettheten av sfæroider og antistoffet, og kan variere fra 16-72 timer. Til tross for at metoden tillater signaldeteksjon dypere i sfæroiden, forårsaker fluoroforer begeistret av UV betydelig lysspredning, noe som fører til et lavt signal-til-støy-forhold. Det må utvises forsiktighet ved valg av fluoroforer for å visualisere målproteinet. For eksempel vil farging av mindre rikelige og strukturelle proteiner med lengre bølgelengdefluoroforer og mer rikelig protein- eller kjerneflekker med kortere bølgelengdefluoroforer oppnå det beste resultatet. Til slutt viser ryddede sfæroider fortsatt lystap på grunn av spredning i den nekrotiske kjernen, tydelig i y / z-dimensjonen av bilder oppnådd av 600 μm sfæroider (figur 2C).
Høyere forstørrelsesavbildning med høyere NA-mål er mulig med sfæroider montert og ryddet ved hjelp av denne protokollen, men målets arbeidsavstand begrenser bildedybden. For en olje nedsenking linse, er det viktig å bruke olje som har en RI på 1,51 for best resultat.
For å oppsummere, tillater agarose-PBS gel innebygd clearing metode for visualisering av celler dypt inne i sfæroider ved hjelp av allment tilgjengelige forbruksvarer. Sfæroider montert og ryddet ved hjelp av denne metoden gjennomgår minimal størrelsesforvrengning og opprettholder sin strukturelle integritet, noe som gjør det mulig å samle inn data av høy kvalitet knyttet til den indre sfæroidstrukturen og påfølgende automatisert kvantifisering.

Tredimensjonale (3D) cellekulturer, som sfæroider, gir biologisk realistiske og reproduserbare modeller av samlet cellevekst 1,2. Disse modellene er raskt blitt vanlig i både grunnforskning og legemiddelutvikling, hvor forskjeller i sfæroid størrelse og struktur undersøkes mellom behandlinger for å fastslå legemiddeleffektivitet 3,4. I disse sammenhengene er evnen til å samle detaljert informasjon fra et stort antall sfæroider svært fordelaktig, både fra et statistisk kraftperspektiv og for å tillate rask vurdering av celleadferd på tvers av flere behandlinger.
Vanlige teknikker for å skaffe detaljerte mikroskopibilder av sfæroidstruktur er enten tidkrevende, dyre eller produserer bilder av dårlig kvalitet som ikke beholder viktige kvantitative trekk som sfæroidstørrelse 4,5. For eksempel kan histologiske teknikker basert på kryoseksjon gi bilder av høy kvalitet, men er ofte tidkrevende, krever faglært arbeidskraft og lager ofte seksjonsartefakter 6,7, mens elegante teknologier, som enkeltplansbelysningsmikroskopi (SPIM)8 og multifotonmikroskopi9 krever spesialiserte mikroskoper som ikke er lett tilgjengelige. Moderne mikroskopiteknologier har nylig muliggjort den såkalte optiske snittingen, der sfæroider plasseres i en brytningsindeksmatchet ryddeløsning og bilder oppnås ved hjelp av konfokal mikroskopi 4,5. Selv om disse teknikkene har potensial til å produsere et høyt utbytte, inkluderer vanlige problemer sfæroidbevegelse under avbildning, størrelsesforvrengning under rydding og høye utgifter til proprietære clearingløsninger. Videre gjelder mange eksisterende protokoller bare for relativt små sfæroider på mindre enn 300 μm i diameter eller dybde opp til 100 μm, og begrenser teknologien til de tidlige stadiene av tumorvekst 5,10,11.
Den nåværende protokollen tillater semi-high-throughput, high-yield samling av detaljerte sfæroidbilder ved hjelp av en billig brytningsindeks-matchet clearing løsning avledet fra hele organ clearing prosedyrer 12,13. For å forhindre sfæroidbevegelse under avbildning og gi strukturell støtte for å redusere størrelsesforvrengning, er sfæroidene montert i agarose-PBS gel i en 24-brønn #1.5 glassbunnplate. Siden denne teknikken gjør det mulig å montere flere sfæroider i hver brønn i en 24-brønns plate, kan opptil 360 sfæroider (15 sfæroider / brønn) raskt monteres og avbildes over ulike eksperimentelle forhold. En brytningsindeksmatchet ryddeløsning konstruert av lett tilgjengelige forbruksvarer brukes til å fjerne monterte sfæroider og den omkringliggende gelen optisk. Etter en sedimenteringsperiode på 24 timer gir denne protokollen høykvalitets 2D- og 3D-bilder av sfæroidstruktur, selv for relativt store sfæroider (ca. 700 μm i diameter), med mindre enn 2% størrelsesforvrengning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass bottom 24-well plate</td>
			<td>Celvis</td>
			<td>P24-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L clear PCR tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HS4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno research</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Final concentration 2% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>MILLI Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ7</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D15106</td>
			<td>Dilution used 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>DBH10</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe Kits</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP1-1000Kit</td>
			<td>Antibody dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Final concentration 2% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Sharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>122262</td>
			<td>Final concentration 9% w/w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Final concentration 150 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Final concentration 0.10% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p27 Kip1 (D69C12) XP</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>3686S</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>C004</td>
			<td>Final concentration 4% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickspin minifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>BTR10-12V</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>EOM5</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Final concentration 44% w/w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Final concentration 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Final concentration 0.10% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Final concentration 0.1% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Final concentration 0.1% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5379</td>
			<td>Final concentration 22% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids

Tumor sfæroider er raskt blitt vanlig i grunnleggende kreftforskning og narkotika utvikling. Innhenting av data om proteinuttrykk i sfæroiden på mobilnivå er viktig for analyse, men eksisterende teknikker er ofte dyre, arbeidskrevende, bruker ikke-standardutstyr, forårsaker betydelig størrelsesforvrengning eller er begrenset til relativt små sfæroider. Denne protokollen presenterer en ny metode for montering og rydding av sfæroider som adresserer disse problemene, samtidig som det muliggjør konfokal analyse av den indre strukturen til sfæroider. I motsetning til eksisterende tilnærminger sørger denne protokollen for rask montering og rydding av et stort antall sfæroider ved bruk av standardutstyr og laboratorieforsyninger. Montering av sfæroider i en pH-nøytral agarose-PBS gelløsning før innføring av en brytningsindeksmatchet clearingløsning minimerer størrelsesforvrengning som er vanlig for andre lignende teknikker. Dette muliggjør detaljert kvantitativ og statistisk analyse der nøyaktigheten av størrelsesmålinger er avgjørende. Videre, sammenlignet med væskeryddingsløsninger, holder agarosegelteknikken sfæroider fast på plass, noe som muliggjør innsamling av tredimensjonale (3D) konfokale bilder. Denne artikkelen utdyper hvordan metoden gir to- og 3D-bilder av høy kvalitet som gir informasjon om intercellevariabilitet og indre sfæroidstruktur.

For å demonstrere evnen til denne clearingmetoden til å gi to- og tredimensjonale bilder av høy kvalitet, ble sfæroider med diametre på 300-600 μm dyrket fra Fluorescent Ubiquitination-baserte Cell Cycle Indicator (FUCCI) transducerte melanomcellelinjer FUCCI-WM164 og FUCCI-WM983b 9,17 , som uttrykker monomert Kusabira Orange2 (mKO2) og monomert Azami Green (mAG) protein når det er i Gap1, og henholdsvis tidlig S-fase/Gap2/mitosefase i cellesyklusen i henhold til prosedyrer gitt i trinn 3 1,3,14. Sfæroidene ble deretter festet med 4% formaldehydoppløsning ved 37 ° C, permeabilisert og farget med anti-p27kip1 / antikanin Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol / anti-mus Alexa Fluor 647, DAPI eller DRAQ7 (se materialtabell) (figur 2). Alle mikroskopifiler lastes opp til GitHub-repositoriet (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Sammenlignet med PBS-monterte sfæroider gir ryddeløsningen bilder med høy klarhet og minimal størrelsesforvrengning (figur 2A). Protokollen tillater høyoppløselig avbildning av cellenivådetaljer dypere inn i sfæroidene uten histologisk snitting, og tverrsnittsbildet ble hentet fra et 20x luftmål (0,7 NA) med en oppløsning på 4096 x 4096 px uten søm (figur 2B). Ved å bruke et lavere forstørrelses- og lavere numerisk blenderåpningsmål med lengre arbeidsavstand, kan man få 3D-konfokale bilder som gir detaljer på cellenivå på en dybde på minst 200 μm (figur 2C). Sfæroider ble også kryoseksjonert og farget i henhold til protokollen av Spoerri et al.4 og sammenlignet med hele sfæroidfarging (figur 2D, E). Figur 2D viser den hypoksiske regionen av sfæroiden farget av pimonidazol, og figur 2E viser p27kip1-farging som markerer cellesyklusarrest (gul) og DAPI-kjerneflekk (grå). Proteinlokalisering og fargemønster er likt mellom kryoseksjonering og rydding og er derfor upåvirket av denne rensemetoden.
Signalintensitetskorreksjon i z tillater avbildning av hele sfæroiden. Lysspredning på grunn av den nekrotiske kjernen begrenser imidlertid evnen til å avbilde den fjerne siden av sfæroiden. Dypere penetrasjon og mindre spredning av en langt rød fluorofor, som DRAQ7 kjerneflekk, muliggjør enda bedre 3D sfæroidstrukturrepresentasjon (figur 3). Film 1 viser 3D-gjengivelsen av FUCCI-sfæroidene farget med DRAQ7. En tynnere z-skive kan gi bedre z-oppløsning, men dette øker bildetiden og fotoblekingen av fluoroforene betydelig.
For å avgjøre om clearingløsningen forårsaker størrelsesforvrengning, ble tolv sfæroider i 2% agarose-PBS gel avbildet ved 6 timer, 12 timer, 24 timer, 72 timer og 168 timer etter innføring av clearingløsningen. Bildene ble oppsummert ved å bestemme diameteren på sfæroiden, definert ut fra en kule med samme tverrsnittsareal som sfæroiden (figur 4A). Mens sfæroidene observeres å øke litt i størrelse i løpet av de første 6 timene, indikert ved en diameterfoldendring på mellom 2% og 6% (figur 4B), etter 24 timer til 72 timer, går sfæroidene tilbake til en størrelse omtrent lik den tilsvarende størrelsen i PBS etter PFA-fiksering (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig01.jpg"> Figur 1: Illustrasjon av sfæroidmonterings- og clearingprotokollen. Faste og fargede sfæroider overføres til et 500 μL rør; overflødig væske erstattes av 200 μL agarose-PBS gel og sentrifugert. Sfæroider overføres deretter til en glassbunnsbrønn i en 24-brønns plate. Etter at gelen får størkne, tilsettes 500 μL clearingoppløsning, og sfæroider får lov til å likevekte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning av klarerte og uklarerte FUCCI humane melanomsfæroider. Farging indikerer cellekjerner positive for mKO2 (rød), som indikerer celler i gap 1; og cellekjerner positive for mAG (grønn), som indikerer celler i gap 2. (A) Sfæroider dyrket fra 5000 FUCCI-WM983b-celler, høstet på dag 10 og avbildet i agarose-PBS gel og 24 timer etter at clearingoppløsningen er tilsatt. Sammenligning av brightfield og confocal bilder før og etter clearing løsning viser minimal størrelse forvrengning og en stor gevinst i klarhet. Bilder oppnås ved hjelp av et 10x mål. (B) Sfæroider dyrket fra FUCCI-WM164-celler permeabilisert ved bruk av Triton X-100 og farget med DRAQ7, og flekker alle cellekjerner. Bildet er oppnådd ved hjelp av et 20x objektiv (0,75 NA), som demonstrerer clearingløsningen tillater høyoppløselig avbildning av cellenivådetaljer. (C) 3D-bilder (10x, 0,4 NA) ble oppnådd av FUCCI-WM164 sfæroider i PBS, og 24 timer etter at clearingløsningen ble tilsatt. Justering av lasereffekt, spenning og forskyvning ved forskjellige z-plan gjør det mulig å avbilde dypere inne i sfæroiden. (D,E) Sammenligning mellom kryoseksjon og ryddet hel sfæroid farget for pimonidazol og p27kip1. (D) Pimonidazolfarging i magenta viser den hypoksiske regionen i sfæroidene. Rødt og grønt indikerer FUCCI. (E) Kryoseksjoner og ryddet sfæroid som viser DAPI (grå) og p27kip1 (gul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig03.jpg"> Figur 3: Clearing gjør det mulig å avbilde dypere inn i sfæroiden med minimalt lystap. Konfokale mikroskopibilder av en FUCCI human melanom sfæroid ved 10x forstørrelse og lavere NA (0,4), noe som tillater avbildning ved høyere z-dybde med minimalt signaltap. (A) 3,88 μm skiver av sfæroidkjerner farget med DRAQ7. (B-D) y / z-oppløsning i henholdsvis 488 (mAG), 568 (mKO2) og 647 nm (DRAQ7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig04.jpg"> Figur 4: Clearingoppløsning har minimal innvirkning på sfæroidstørrelsen. (A) Fordeling av innledende sfæroidstørrelse (ekvivalent diameter) i PBS gel (n = 12 sfæroider). (B) Diameter foldeendring over tid siden tilsetning av clearingoppløsning. Ved 0 timer er sfæroider kun i PBS gel. (C) Fordeling av diameter foldeendringer ved 12 timer, 24 timer og 72 timer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Film 1: 3D-gjengivelse av en FUCCI sfæroid farget med DRAQ7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/Movie%20S1.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids at JoVE.com

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumorsfæroider blir stadig mer brukt til å vurdere tumorcelle-mikromiljøinteraksjoner og terapirespons. Den nåværende protokollen beskriver en robust, men enkel metode for semi-high-throughput avbildning av 3D tumor sfæroider ved hjelp av rask optisk clearing.

Rask optisk clearing for semi-high-throughput analyse av tumor sfæroider

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Laboratoriet mitt spesialiserer seg på tre- og firedimensjonal tumormodellering. Tumor sfæroid modeller er mye brukt gjennom biologi og narkotika funn. Eksisterende protokoller for innsamling av data fra disse eksperimentene er imidlertid dyre, vanskelige og begrensede.Denne protokollen krever lett tilgjengelige kjemikalier og utstyr, og er lite arbeidskrevende sammenlignet med dagens metoder som gir lignende resultater. Denne protokollen ble utviklet for å være relativt enkel å implementere for nybegynnere og robust for små feil, da mange av trinnene er reversible. Begynn med å veie 0,5 gram lavsmeltende agarose i en glassflaske.Og legg til 25 milliliter PBS. Smelt agarosen ved å koke løsningen i en mikrobølgeovn i 30 til 60 sekunder med lokket lukket og konstant virvling. Vei ni gram N, N, N'N'Tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamin, 22 gram urea, 44 gram sukrose, 0,1 gram Triton X-100 og 24,9 gram avionisert vann.Varm løsningen i et 56 grader Celsius vannbad med konstant blanding. Etter at krystallene er oppløst, hviler løsningen ved romtemperatur for å la boblene dannet under blanding stige til overflaten. Generer sfæroider ved hjelp av agaroseoverleggsmetoden beskrevet i tekstmanuskriptet.Skjær spissen av en milliliter pipettespiss med en skalpell for å forstørre åpningen. Ved hjelp av pipetten aspirerer du sfæroidene fra brønnene og overfører dem til et klart 1,5 milliliter konisk rør. Flere sfæroider fra de samme forholdene kan kombineres i samme rør.Vask sfæroidene to ganger i en milliliter PBS, tilsett deretter nøytral 4% forvarmet paraformaldehydløsning og inkuber sfæroidene ved 37 grader Celsius. Etter 20 minutter, fjern paraformaldehydoppløsningen og vask sfæroidene to ganger med en milliliter PBS. Deretter overfører du opptil 15 sfæroider til et 200 mikroliter PCR-rør ved hjelp av en pipette.Permeabiliser cellene ved hjelp av 200 mikroliter 0, 5% Triton X-100 i PBS. Plasser PCR-rørene inne i 50 milliliter, skrukorkrør og dekk røret med aluminiumsfolie og inkuber sfæroidene ved romtemperatur med mild omrøring. Etter to timer, erstatt løsningen med 200 mikroliter antistofffortynningsbuffer og inkuber over natten ved romtemperatur.Neste dag, fjern antistofffortynningsbuffer før du tilsetter 75 mikroliter primært antistoff og inkuberer ved fire grader Celsius i to og en halv dag. Etter inkubering, fjern supernatanten og vask sfæroidene to ganger med 200 mikroliter PBS, som inneholder 0,1% Tween og 0,1% Triton X-100 eller PBS-TT. Inkuber deretter med 200 mikroliter PBS-TT i fire timer ved romtemperatur.Fjern deretter PBS-TT før du legger til 100 mikroliter av det sekundære antistoffet og inkuberer ved fire grader Celsius i to og en halv dag. Etter inkubasjon, fjern supernatanten og vask to ganger med PBS-TT, før du inkuberer med 200 mikroliter PBS-TT i fire timer. For montering, bruk en 200 mikroliter pipette, overfør faste og fargede sfæroider til 500 mikroliter PCR-rør, ved ett rør per tilstand.Bytt ut løsningen med 200 mikroliter 2% flytende agarosegel, og sentrifuger på hurtigspinn, ved fast maksimal hastighet, ved romtemperatur, i 30 sekunder. Aspirer sfæroidene i 50 mikroliter flytende agarosegel og dispenser i brønnen til en 24-brønns glassbunnplate. Før gelen herdes, skill sfæroidene ved hjelp av en pipettespiss i den omkringliggende gelen, og sørg for at sfæroidene er dekket med gel.Senk deretter gelen ved å tilsette 500 mikroliter ryddeløsning per brønn, og inkubere ved romtemperatur, i mørket, i 24 timer før avbildning. For avbildning, velg et mål med en arbeidsavstand som er lang nok til å omfatte hele sfæroiden, inkludert monteringshøyden til sfæroiden i fartøyet. For å identifisere ekvatorialplanet, juster fokuset til det største overflatearealet er nådd i XY-planet, og bilde med den nødvendige lasereffektprosenten, detektorspenningen, forsterkningen og forskyvningsinnstillingene.For tredimensjonale bilder, still inn starten og slutten av sfæroidene og velg riktig signalintensitet på forskjellige Z-dybder ved hjelp av Z-intensitetskorreksjonsinnstillinger. Denne studien viser en sammenligning av klarerte og uklarerte FUCCI humane melanomsfæroider, sammenlignet med PBS-monterte sfæroider. Clearingløsningen gir bilder med høy klarhet og minimal størrelsesforvrengning.Clearing-løsningen muliggjør videre høyoppløselig avbildning av detaljer på cellenivå dypere inn i sfæroidene uten histologisk seksjonering. Med tredimensjonale konfokale bilder kan detaljer på mobilnivå på en dybde på 200 mikron oppnås. Videre vises en sammenligning mellom kryoseksjonert og ryddet hullsfæroid, farget for pimonidazol og p27kip1.Pimonidazolfarging viser den hypoksiske regionen av sfæroiden, og p27kip1-farging, markerer cellesyklusarrest og DAPI-kjernefysisk flekk. Dypere penetrasjon og mindre spredning, tillater forbedret tredimensjonal sfæroid struktur representasjon med minimalt lystap. Den tredimensjonale gjengivelsen av FUCCI-sfæroidene, farget med DRAQ7, er vist.Clearingløsning har minimal innvirkning på sfæroidstørrelsen. Diameteren til sfæroiden ble definert basert på en kule med samme tverrsnittsareal som sfæroiden. Sfæroidene ble observert å øke noe i størrelse i løpet av de første seks timene, som indikert ved en diameter foldeendring på mellom 2% og 6% I kontrast, etter 24 til 72 timer, returnerte sfæroidene til en størrelse omtrent lik den tilsvarende størrelsen i PBS post-paraformaldehydfiksering.Det er viktig å vente minst 24 timer før avbildning, for å la clearingløsningen balansere med sfæroider og gelen. Denne protokollen gjør det mulig for utøvere å raskt samle inn data fra et stort antall sfæroider, noe som muliggjør detaljert kvantitativ matematisk og statistisk analyse som gir detaljert innsikt i biologien.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Generasjon av sebrafisk Larval Xenografts og tumor atferdsanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Utforske mitokondriell energimetabolisme av enkelt 3D microtissue sfæroider ved hjelp av ekstracellulær fluksanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...