Name: rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids
Uploaded: 2022-08-23T13:00:00
Duration: 8 min 12 s
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Esta pesquisa foi realizada no Instituto de Pesquisa Translacional (TRI), Woolloongabba, QLD. A TRI é apoiada por uma subvenção do Governo australiano. Agradecemos aos funcionários da instalação do núcleo de microscopia da TRI por seu excelente apoio técnico. Agradecemos ao Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japão, por fornecer as construções da FUCCI, Prof. Meenhard Herlyn e Patricia Brafford, The Wistar Institute, Filadélfia, PA, por fornecer as linhas celulares. Agradecemos à Dra Loredana Spoerri por fornecer imagens de crioseção C8161.
Este trabalho foi apoiado por subsídios de projeto para n.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) e Meehan Project Grant (021174 2017002565).

O protocolo descreve a preparação de uma quantidade suficiente de esferoides tumorais para montar uma placa de 24 poços (aproximadamente 240-360 esferoides ou 10-15 esferoides/bem) a 200 μL de gel agarose por poço e 500 μL de solução de compensação per bem. O procedimento completo é ilustrado na Figura 1.
1. 2% de preparação de gel agarose-PBS
<ol><li>Pesar 0,5 g de agarose de baixo derretimento (ver Tabela de Materiais) em uma garrafa de vidro e adicionar 25 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).</li>
	<li>Derreta a agarose fervendo a solução em um micro-ondas para 30-60 s com a tampa fechada, mas não selada e com redemoinho constante. Certifique-se de que a agarose esteja totalmente dissolvida e que a solução não ferva. NOTA: O gel pode ser armazenado à temperatura ambiente; verifique o volume antes de usar para explicar a evaporação. Leve ao estado líquido (micro-ondas; 20-60 s com redemoinho) antes de usar.</li>
</ol>2. Elaboração da solução de compensação
<ol><li>Pese 9 g de N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropyl) etilenediamina, 22 g de ureia, 44 g de sacarose, 0,1 g de Triton X-100 e 24,9 g de água desionizada (ver Tabela de Materiais). NOTA: É mais fácil pesar a quantidade aproximada de N,N,N′,N'-Tetrakis(2-Hidroxipropyl)etilenediamina e ajustar o peso de outros componentes para obter a concentração desejada.</li>
	<li>Aqueça a solução em um banho de água de 56 °C com mistura constante e continue até que todos os cristais se dissolvam.</li>
	<li>Descanse a solução à temperatura ambiente para permitir que as bolhas formadas durante a mistura subam à superfície. A solução é estável à temperatura ambiente por até 2 meses.</li>
</ol>3. Preparação esferoide
<ol><li>Gerar esferoides usando o método de sobreposição de ágarose, como descrito anteriormente 1,3,14. NOTA: Os spheroids gerados por outros métodos também são compatíveis com este protocolo de imagem.</li>
	<li>Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL usando um bisturi para ampliar o orifício. NOTA: Todos os esferoides foram manuseados com pipetas de 1 mL ou 200 μL com pontas de corte.</li>
	<li>Usando a pipeta, aspire os esferoides dos poços e transfira-os para um tubo cônico claro de 1,5 mL. Vários esferoides das mesmas condições podem ser combinados no mesmo tubo. NOTA: Sempre permita que os esferoides se acomodem na parte inferior do tubo para aspirar o meio.</li>
	<li>Lave os esferoides em 1 mL PBS duas vezes, adicione a solução de paraformaldeído pré-aquecido (PFA) neutra de 4% e incuba os esferoides a 37 °C por 20 minutos.</li>
	<li>Remova a solução PFA e lave os esferoides duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
</ol>4. Mancha sferóide
<ol><li>Usando uma pipeta, transfira até 15 esferoides em um tubo PCR de 200 μL. NOTA: Para esferoides frágeis, monte os esferoides em gel (passos 5.1-5.4) antes de prosseguir.</li>
	<li>Permeabilize as células usando 200 μL de 0,5% Triton X-100 em PBS. Coloque tubos PCR dentro de tubos de tampa de parafuso de 50 mL e incubar os esferoides por 2 h em temperatura ambiente com agitação leve. NOTA: Todas as incubações são feitas com agitação em um rotor, rolo ou shaker (ver Tabela de Materiais) a menos que especificado o contrário. Isso é importante para alcançar a coloração uniforme. Esferoides fixos em PBS às vezes podem grudar nas laterais da ponta da pipeta. Enxaguar a ponta em 0,5% Triton X-100 minimiza os esferoides de grudar nas pontas.</li>
	<li>Substitua a solução (etapa 4.2) por 200 μL de tampão de diluição de anticorpos (ABDIL)15 e incubar durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire ABDIL, adicione 75 μL de anticorpo primário em ABDIL e incubar a 4 °C por 2,5 dias.</li>
	<li>Retire o supernasal e lave com 200 μL de PBS com 0,1% Tween e 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) duas vezes e incubar com 200 μL de PBS-TT para 4h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o PBS-TT, adicione 100 μL de anticorpo secundário em ABDIL e incuba a 4 °C por 2,5 dias. NOTA: O DAPI ou outro corante nuclear pode ser adicionado nesta fase. A maioria dos corantes requer menos tempo de incubação do que anticorpos.</li>
	<li>Retire o supernaspe e lave com 200 μL de PBS-TT duas vezes e incuba com 200 μL de PBS-TT por 4 h. Os esferoides estão prontos para montagem.</li>
</ol>5. Montagem
<ol><li>Usando uma pipeta de 200 μL, transfira e spheróides fixos e manchados para tubos PCR de 500 μL a um tubo por condição (aproximadamente 10-15 esferoides).</li>
	<li>Substitua a solução por 200 μL de 2% (w/v) gel de agarose líquida e centrífuga no giro rápido (na velocidade máxima fixa, ver Tabela de Materiais) em temperatura ambiente para 30 s. NOTA: A menos que a montagem imediatamente, coloque em um bloco de aquecimento a 50 °C para evitar o endurecimento do gel.</li>
	<li>Aspire os esferoides em ~50 μL de gel líquido agarose e dispense em poço de uma placa de fundo de vidro de 24 poços.</li>
	<li>Antes que o gel endureça, separe os esferoides usando uma ponta de pipeta no gel circundante e certifique-se de que os esferoides estejam cobertos com gel. Opcionalmente, coloque a placa no gelo para definir rapidamente o gel. NOTA: O número de esferoides por poço depende do tamanho dos esferoides. Esferoides são colocados longe um do outro para que apenas um esferoide entre no campo de visão durante a imagem. Isso é importante para o processamento automatizado de imagens.</li>
	<li>Adicione 500 μL de solução de compensação (passo 2) por poço, garantindo que o gel esteja submerso. Incubar na RT por pelo menos 24 horas e imagem dos esferoides na solução de compensação. Os spheróides são estáveis nesta solução por até um mês à temperatura ambiente e quando protegidos da evaporação.</li>
</ol>6. Imagem
<ol><li>Escolha um objetivo com uma distância de trabalho tempo suficiente para abranger todo o esferoide, incluindo a altura de montagem do esferoide no vaso. NOTA: Objetivos com uma distância de trabalho de 3 mm ou mais são necessários para a imagem do plano equatorial dos esferoides. Objetivos de ampliação mais elevados com NA mais alto podem permitir uma melhor resolução, mas limitarão a profundidade máxima na qual os esferoides podem ser imagens.</li>
	<li>Para identificar o plano equatorial, ajuste o foco até que a maior área de superfície seja atingida no plano XY e na imagem com a porcentagem de energia laser necessária, tensão do detector, ganho e configurações de deslocamento. NOTA: A porcentagem de potência do laser, tensão do detector, ganho e deslocamento variam muito dependendo do fluorohore, intensidade de coloração, intensidade do laser, sensibilidade ao detector, etc.</li>
	<li>Para imagens 3D, defina o início e o fim dos esferoides e escolha a intensidade apropriada do sinal em várias profundidades z usando configurações de correção de intensidade z antes da imagem. NOTA: Para melhor resolução de imagem, use a taxa de amostragem de Nyquist para x, y e z (para detalhes, consulte referência16).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+flow+cytometry-based+analysis+of+cell+position+and+the+cell+cycle+in+3D+melanoma+spheroids.">Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery.">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).</li><li>Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+the+depths:+Techniques+for+in+vitro+three-dimensional+microtissue+visualization.">Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization.</a> BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li><li>Spoerri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+melanoma+heterogeneity+is+regulated+through+cell-matrix+interaction-dependent+changes+in+tumor+microarchitecture.">Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth,+invasion,+and+drug+response.">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).</li><li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+spheroids+for+3D+fluorescent+microscopy:+combining+safe+and+soft+chemicals+with+deep+convolutional+neural+network.">Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network.</a> bioRxiv. , 428996 (2021).</li><li>Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+characterization+of+3-D+cell+culture+models+grown+in+spheroid+microplates.">Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates.</a> American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).</li><li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D:+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods.">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+cycle+imaging+in+a+3D+cell+culture+model+of+melanoma.">Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Dilution+Buffer+(Abdil).">Antibody Dilution Buffer (Abdil).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Browning, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+tumour+spheroid+structure.">Quantitative analysis of tumour spheroid structure.</a> eLife. 10, 73020 (2021).</li><li>Klowss, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stochastic+mathematical+model+of+4D+tumour+spheroids+with+real-time+fluorescent+cell+cycle+labelling.">A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling.</a> Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).</li><li>Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+interpreting+4D+tumour+spheroid+experiments.">Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments.</a> Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).</li></ol>

O Olympus contribuiu para os custos de publicação.

Um protocolo para a obtenção de imagens bi e tridimensionais de alta qualidade de esferoides tumorais é apresentado aqui. Métodos existentes, como CLARITY, See deep brain (SeeDB) e ScaleS, muitas vezes causam distorção de tamanho em até 30%, enquanto técnicas como Benzyl Alcohol/ Benzyl Benzoate (BABB) e imagem 3D de órgãos desmatados por solventes (3DISCO) podem saciar a proteína fluorescente18. Muitos desses métodos são projetados para limpar tecidos com integridade estrutural e distorcer o tamanho e a estrutura quando aplicados aos esferoides18. Em contraste com outros protocolos que utilizam soluções de compensação caras disponíveis comercialmente, este protocolo utiliza consumíveis prontamente disponíveis, mantendo a clareza óptica e fluorescência endógena e minimizando a distorção do tamanho. A incorporação de esferoides em gel agarose-PBS fornece suporte estrutural para esferoides e minimiza o choque osmótico quando a solução de compensação é adicionada. Isso é crucial quando a imagem de esferoides frágeis pós-tratamento medicamentoso. Supõe-se que este método de compensação óptica é adequado para esferoides formados por qualquer método, uma vez que este protocolo é adaptado de toda a limpeza tecidual. A suposição baseia-se na similaridade nos esferoides obtidos por diferentes métodos de formação esferoide. A escolha da fixação pode afetar o tamanho esferoide, bem como fluorescência endógena. Este método de compensação é adequado para esferoides fixos com solução PFA neutra de 4%. Outros testes são necessários para verificar sua compatibilidade com outros fixativos.
Dado que esta técnica permite que vários esferoides sejam montados simultaneamente em uma placa multi-poço, é bem adequado para dutos de análise quantitativa que requerem informações de estrutura esferoide de até 360 esferoides por placa de 24 poços. Microscópios com funções automatizadas de mapeamento de etapas e placas podem tornar a imagem menos manual. Embora este método seja mais rápido e fácil do que a secção, ele é atualmente inadequado para automação completa. No entanto, as imagens obtidas por este método são adequadas para o processamento automatizado de imagens 4,19, e a taxa na qual os esferoides podem ser montados usando este protocolo empresta à análise quantitativa da estrutura interna esferoide 20,21,22.
Para colorar esferoides inteiros, a concentração de anticorpos, volume e tempo de incubação precisam ser otimizados para cada anticorpo. Como guia, use 2,5x da concentração recomendada de anticorpos de imunofluorescência 2D e 100-200 μL de anticorpos, dependendo do número de esferoides por tubo. Certifique-se de que todos os esferoides estão cobertos pela solução de coloração quando estiverem no rotor. O tempo de incubação depende de muitos fatores, incluindo o tamanho e a densidade dos esferoides e do anticorpo, podendo variar de 16 a 72 h. Apesar do método que permite a detecção de sinal mais profunda dentro do esferoide, fluoroforos animados por UV causam dispersão significativa de luz, levando a uma baixa relação sinal-ruído. Deve-se tomar cuidado ao escolher fluoroforos para visualizar a proteína alvo. Por exemplo, manchas de proteínas menos abundantes e estruturais com lanças de comprimento de onda mais longas e proteínas ou manchas nucleares mais abundantes com lançadores de comprimento de onda mais curtos alcançarão o melhor resultado. Finalmente, os esferoides limpos ainda apresentam perda de luz devido à dispersão no núcleo necrosado, evidente na dimensão y/z das imagens obtidas de 600 μm spheroids (Figura 2C).
Imagens de ampliação mais altas com objetivos de NA mais elevados são possíveis com esferoides montados e limpos usando este protocolo, mas a distância de trabalho do objetivo limita a profundidade de imagem. Para uma lente de imersão em óleo, é importante usar óleo que tenha uma RI de 1,51 para obter o melhor resultado.
Resumindo, o método de compensação incorporado em gel agarose-PBS permite a visualização de células no interior dos esferoides usando consumíveis comumente disponíveis. Os esferoides montados e limpos usando este método sofrem distorção de tamanho mínimo e mantêm sua integridade estrutural, permitindo a coleta de dados de alta qualidade relacionados à estrutura esferoide interna e posterior quantificação automatizada.

Culturas celulares tridimensionais (3D), como esferoides, fornecem modelos biologicamente realistas e reprodutíveis de crescimento celular agregado 1,2. Esses modelos estão se tornando rapidamente comuns tanto na pesquisa básica quanto no desenvolvimento de medicamentos, onde diferenças no tamanho e estrutura esferoides são examinadas entre os tratamentos para verificar a eficácia da droga 3,4. Nesses contextos, a capacidade de coletar informações detalhadas de um grande número de esferoides é altamente vantajosa, tanto do ponto de vista estatístico de poder quanto de permitir uma rápida avaliação do comportamento celular em vários tratamentos.
Técnicas comumente utilizadas para a obtenção de imagens detalhadas de microscopia da estrutura esferoide são demoradas, caras ou produzem imagens de má qualidade que não retêm características quantitativas importantes, como o tamanho esferoide 4,5. Por exemplo, técnicas histológicas baseadas em criosectioning podem fornecer imagens de alta qualidade, mas muitas vezes são demoradas, exigem mão-de-obra qualificada e muitas vezes criam artefatos de secção 6,7, enquanto tecnologias elegantes, como microscopia de iluminação de plano único (SPIM)8 e microscopia multifotol9 requerem microscópios especializados que não estão prontamente disponíveis. As modernas tecnologias de microscopia permitiram recentemente a chamada seção óptica, onde os esferoides são colocados dentro de uma solução de compensação compatível com índice refrativo e as imagens são obtidas usando microscopia confocal 4,5. Embora essas técnicas tenham o potencial de produzir um alto rendimento, problemas comuns incluem o movimento esferoide enquanto a imagem, a distorção de tamanho durante a compensação e o alto gasto de soluções proprietárias de compensação. Além disso, muitos protocolos existentes aplicam-se apenas a esferoides relativamente pequenos de menos de 300 μm de diâmetro ou profundidade até 100 μm, limitando a tecnologia aos estágios iniciais do crescimento do tumor 5,10,11.
O presente protocolo permite uma coleta semi-alta e de alto rendimento de imagens esferoides detalhadas usando uma solução de compensação compatível com o índice de refração de baixo custo derivada de procedimentos completos de compensação de órgãos12,13. Para evitar o movimento esferoide durante a imagem e fornecer suporte estrutural para reduzir a distorção de tamanho, os esferoides são montados em gel agarose-PBS em uma placa inferior de vidro de 24 poços #1.5. Uma vez que esta técnica permite que vários esferoides sejam montados em cada poço em uma placa de 24 poços, até 360 esferoides (15 esferoides/bem) podem ser rapidamente montados e imagens em várias condições experimentais. Uma solução de compensação refrativa combinada com o índice construído a partir de consumíveis prontamente disponíveis é usada para limpar esferoides montados e o gel circundante de forma óptica. Após um período de assentamento de 24 horas, este protocolo fornece imagens 2D e 3D de alta qualidade da estrutura esferoide, mesmo para esferoides relativamente grandes (aproximadamente 700 μm de diâmetro), com menos de 2% de distorção de tamanho.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass bottom 24-well plate</td>
			<td>Celvis</td>
			<td>P24-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L clear PCR tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HS4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno research</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Final concentration 2% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>MILLI Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ7</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D15106</td>
			<td>Dilution used 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>DBH10</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe Kits</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP1-1000Kit</td>
			<td>Antibody dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Final concentration 2% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Sharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>122262</td>
			<td>Final concentration 9% w/w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Final concentration 150 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Final concentration 0.10% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p27 Kip1 (D69C12) XP</td>
			<td>Cell Signalling technology</td>
			<td>3686S</td>
			<td>Dilution used 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>C004</td>
			<td>Final concentration 4% w/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickspin minifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>BTR10-12V</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>EOM5</td>
			<td>or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Final concentration 44% w/w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Final concentration 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Final concentration 0.10% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Final concentration 0.1% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Final concentration 0.1% v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5379</td>
			<td>Final concentration 22% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids

Os esferoides tumorais estão rapidamente se tornando comuns na pesquisa básica do câncer e no desenvolvimento de medicamentos. A obtenção de dados sobre a expressão proteica dentro do esferoide no nível celular é importante para análise, mas as técnicas existentes são muitas vezes caras, trabalhosas, usam equipamentos fora do padrão, causam distorção significativa do tamanho ou são limitadas a esferoides relativamente pequenos. Este protocolo apresenta um novo método de montagem e limpeza de esferoides que abordam essas questões, permitindo a análise confocal da estrutura interna dos esferoides. Em contraste com as abordagens existentes, este protocolo prevê a rápida montagem e limpeza de um grande número de esferoides usando equipamentos padrão e suprimentos de laboratório. A montagem de spheroids em uma solução de gel agarose-PBS neutra em pH antes de introduzir uma solução de compensação compatível com índices refrativos minimiza a distorção de tamanho comum a outras técnicas semelhantes. Isso permite uma análise quantitativa e estatística detalhada onde a precisão das medidas de tamanho é primordial. Além disso, em comparação com as soluções de compensação líquida, a técnica de gel de agarose mantém os esferoides fixos no lugar, permitindo a coleta de imagens tridimensionais (3D) confocal. O presente artigo elabora como o método produz imagens de alta qualidade de duas e 3D que fornecem informações sobre variabilidade intercelular e estrutura esferoide interna.

Para demonstrar a capacidade deste método de compensação de fornecer imagens bi e tridimensionais de alta qualidade, esferoides com diâmetros de 300-600 μm foram cultivados a partir de Fluorescent ubiquitination baseado Cell Cycle Indicator (FUCCI) linhas celulares de melanoma transduzidas FUCCI-WM164 e FUCCI-WM983b 9,17 , que expressam a monomérica Kusabira Orange2 (mKO2) e a proteína monomérica Azami Green (mAG) quando em Gap1, e a fase S-phase/Gap2/mitosis precoces do ciclo celular, respectivamente, de acordo com procedimentos previstos na etapa 3 1,3,14. Os esferoides foram então fixados com 4% de solução de formaldeído a 37 °C, permeabilizados, e manchados com anti-p27kip1/anti-coelho Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol/anti-mouse Alexa Fluor 647, DAPI ou DRAQ7 (ver Tabela de Materiais) (Figura 2). Todos os arquivos de microscopia são carregados no repositório do GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Em comparação com os esferoides montados em PBS, a solução de compensação fornece imagens de alta clareza com distorção de tamanho mínimo (Figura 2A). O protocolo permite imagens de alta resolução de detalhes de nível celular mais profundamente nos esferoides sem seção histológica, e a imagem transversal foi obtida a partir de um objetivo de ar de 20x (0,7 NA) em uma resolução de 4096 x 4096 px sem costura (Figura 2B). Utilizando uma ampliação mais baixa e um objetivo de abertura numérica mais baixa com uma distância de trabalho mais longa, imagens confocal 3D que fornecem detalhes de nível celular a uma profundidade de pelo menos 200 μm podem ser obtidas (Figura 2C). Os esferoides também foram criosedos e manchados conforme o protocolo de Spoerri et al.4 e comparados com manchas esferoides inteiras (Figura 2D,E). A Figura 2D mostra a região hipóxica do esferoide manchada por pimonidazol, e a Figura 2E mostra manchas p27kip1 que marcam a prisão do ciclo celular (amarelo) e a mancha nuclear DAPI (cinza). A localização da proteína e o padrão de coloração são semelhantes entre a criosecção e a limpeza e, portanto, não são afetados por este método de compensação.
A correção da intensidade do sinal em z permite a imagem de todo o esferoide. No entanto, a dispersão de luz devido ao núcleo necrosado limita a capacidade de imagem do lado distante do esferoide. A penetração mais profunda e a menor dispersão de um fluoróforo vermelho distante, como a mancha nuclear DRAQ7, permitem uma representação ainda maior da estrutura esferoide 3D (Figura 3). O filme 1 mostra a renderização 3D dos esferoides FUCCI manchados com DRAQ7. Uma fatia z mais fina pode permitir uma melhor resolução z, mas isso aumenta significativamente o tempo de imagem e o fotobleachamento dos fluoroforos.
Para determinar se a solução de compensação causa distorção de tamanho, doze esferoides em gel 2% agarose-PBS foram imagedos às 6h, 12h, 24h, 72 h e 168 h após a introdução da solução de compensação. As imagens foram resumidas pela determinação do diâmetro do esferoide, definido com base em uma esfera com a mesma área transversal que o esferoide (Figura 4A). Enquanto os esferoides são observados para um leve aumento de tamanho ao longo das primeiras 6 horas, indicados por uma variação de dobra de diâmetro entre 2% e 6% (Figura 4B), após 24h a 72 h, os esferoides retornam a um tamanho aproximadamente igual ao tamanho correspondente na fixação de PBS pós PFA (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração do protocolo de montagem e limpeza de esferoides. Esferoides fixos e manchados são transferidos para um tubo de 500 μL; o excesso de fluido é substituído por 200 μL agarose-PBS gel e centrifusado. Os spheroids são então transferidos para um poço de fundo de vidro em uma placa de 24 poços. Depois que o gel é permitido solidificar, a solução de compensação de 500 μL é adicionada e os esferoides são autorizados a equilibrar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig02.jpg"> Figura 2: Comparação de esferoides de melanoma humano FUCCI limpos e não esclarecidos. A coloração indica núcleos celulares positivos para mKO2 (vermelho), o que indica células na lacuna 1; e núcleos celulares positivos para mAG (verde), o que indica células em gap 2. (A) Esferoides cultivados a partir de 5000 células FUCCI-WM983b, colhidas no dia 10 e imagens em gel agarose-PBS e 24 horas após a solução de compensação. Comparar imagens brightfield e confocal antes e depois da solução de compensação mostra uma distorção de tamanho mínimo e um grande ganho de clareza. As imagens são obtidas utilizando-se um objetivo de 10x. (B) Spheroids cultivados a partir de células FUCCI-WM164 permeabilizadas usando Triton X-100 e manchadas com DRAQ7, manchando todos os núcleos celulares. A imagem é obtida utilizando-se um objetivo de 20x (0,75 NA), demonstrando que a solução de compensação permite imagens de alta resolução de detalhes de nível celular. (C) imagens 3D (10x, 0,4 NA) foram obtidas de esferoides FUCCI-WM164 em PBS, e 24 horas após a solução de compensação ser adicionada. Ajustar a potência do laser, tensão e deslocamento em diferentes z-plane permite imagens mais profundas dentro do esferoide. (D,E) Comparação entre criosection e esferoide inteiro limpo manchado para pimonidazol e p27kip1. (D) A coloração de pimonidazol em magenta mostra a região hipóxica nos esferoides. Vermelho e verde indicam FUCCI. (E) Cryosections e esferoide limpo mostrando DAPI (cinza) e p27kip1 (amarelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig03.jpg"> Figura 3: A limpeza permite imagens mais profundas no esferoide com perda mínima de luz. Imagens de microscopia confocal de um esferoide de melanoma humano FUCCI a 10x de ampliação e na inferior (0,4), permitindo imagens em maior profundidade z com perda mínima de sinal. (A) fatias de 3,88 μm de núcleos esferoides manchados com draq7. (B-D) y/z-resolução nos canais 488 (mAG), 568 (mKO2) e 647 nm (DRAQ7), respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig04.jpg"> Figura 4: A solução de compensação tem impacto mínimo no tamanho do esferoide. (A) Distribuição do tamanho esferoide inicial (diâmetro equivalente) em gel PBS (n = 12 esferoides). (B) Variação de diâmetro ao longo do tempo desde a adição da solução de compensação. Às 0h, os spheroids estão apenas em gel PBS. (C) Distribuição de dobras de diâmetro a 12h, 24 h e 72 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig04large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme 1: Renderização 3D de um esferoide FUCCI manchado com DRAQ7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/Movie%20S1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Filme.</a>

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Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Os esferoides tumorais estão se tornando cada vez mais utilizados para avaliar as interações de microambientes de células tumorais e a resposta terapêutica. O presente protocolo descreve um método robusto, mas simples, para imagens semi-de alta produtividade de esferoides tumorais 3D usando limpeza óptica rápida.

Limpeza óptica rápida para análise semi-de alto rendimento de esferoides tumorais

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Meu laboratório é especializado em modelagem de tumores tridimensionais. Modelos de esferoides tumorais são amplamente utilizados ao longo da biologia e descoberta de drogas. No entanto, os protocolos existentes para coletar dados desses experimentos são caros, difíceis e limitados.Este protocolo requer produtos químicos e equipamentos de fácil acesso, e não é muito trabalhoso em comparação com métodos atuais que fornecem resultados semelhantes. Este protocolo foi desenvolvido para ser relativamente fácil de implementar para iniciantes e robusto para pequenos erros, já que muitas das etapas são reversíveis. Comece pesando 0,5 gramas de agarose de baixo derretimento em uma garrafa de vidro.E adicione 25 mililitros de PBS. Derreta a agarose fervendo a solução em um micro-ondas por 30 a 60 segundos com a tampa fechada, e redemoinhos constantes. Pese nove gramas de N, N, N'N'Tetrakis(2-hidroxipropyl)etilenediamina, 22 gramas de ureia, 44 gramas de sacarose, 0,1 gramas de Triton X-100 e 24,9 gramas de água deionizada.Aqueça a solução em um banho de água de 56 graus Celsius com mistura constante. Depois que os cristais forem dissolvidos, descanse a solução à temperatura ambiente para permitir que as bolhas se formem durante a mistura, subam à superfície. Gerar esferoides usando o método de sobreposição de agarose descrito no manuscrito do texto.Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro usando um bisturi para ampliar o orifício. Usando a pipeta, aspire os esferoides dos poços e transfira-os para um tubo cônico claro de 1,5 mililitro. Vários esferoides das mesmas condições podem ser combinados no mesmo tubo.Lave os esferoides duas vezes em um mililitro de PBS, depois adicione uma solução de paraformaldeído neutro de 4% pré-aquecida e incuba os esferoides a 37 graus Celsius. Após 20 minutos, remova a solução de paraformaldeído e lave os esferoides duas vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, para coloração, transfira até 15 esferoides em um tubo PCR de 200 microliter, usando uma pipeta.Permeabilize as células usando 200 microlitrais de 0,5% Triton X-100 em PBS. Coloque os tubos PCR dentro de 50 mililitros, tubos de tampa de parafuso e cubra o tubo com papel alumínio e incubar os esferoides à temperatura ambiente com leve agitação. Após duas horas, substitua a solução por 200 microliters de tampão de diluição de anticorpos e incubar durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, remova o tampão de diluição de anticorpos antes de adicionar 75 microlitadores de anticorpos primários e incubar a quatro graus Celsius por dois dias e meio. Após a incubação, remova o supernascer e lave os esferoides duas vezes com 200 microliters de PBS, contendo 0,1% Tween e 0,1%Triton X-100 ou PBS-TT. Em seguida, incubar com 200 microliters de PBS-TT por quatro horas em temperatura ambiente.Em seguida, remova o PBS-TT antes de adicionar 100 microlitadores do anticorpo secundário e incubar a quatro graus Celsius por dois dias e meio. Após a incubação, remova o supernascer e lave duas vezes com PBS-TT, antes de incubar com 200 microliters de PBS-TT por quatro horas. Para montagem, use uma pipeta de 200 microliter, transfira esferoides fixos e manchados para 500 tubos PCR microliter, a um tubo por condição.Substitua a solução por 200 microliters de gel de agarose 2% líquido, e centrífuga no giro rápido, na velocidade máxima fixa, em temperatura ambiente, por 30 segundos. Aspire os esferoides em 50 microliters de gel líquido agarose e dispense no poço de uma placa inferior de vidro de 24 poços. Antes que o gel endureça, separe os esferoides usando uma ponta de pipeta no gel circundante e certifique-se de que os esferoides estejam cobertos com gel.Em seguida, submergir o gel adicionando 500 microliters de solução de compensação por poço, e incubar à temperatura ambiente, no escuro, por 24 horas antes da imagem. Para a imagem, escolha um objetivo com uma distância de trabalho tempo suficiente para abranger todo o esferoide, incluindo a altura de montagem do esferoide no vaso. Para identificar o plano equatorial, ajuste o foco até que a maior área de superfície seja atingida no plano XY, e imagem com a porcentagem de energia laser necessária, tensão do detector, ganho e configurações de deslocamento.Para imagens tridimensionais, defina o início e o fim dos esferoides e escolha a intensidade de sinal apropriada em várias profundidades Z, usando configurações de correção de intensidade Z. Este estudo mostra uma comparação dos esferoides de melanoma humano FUCCI limpos e não claros, em comparação com os esferoides montados na PBS. A solução de compensação fornece imagens de alta clareza com distorção de tamanho mínimo.A solução de compensação permite ainda imagens de alta resolução de detalhes de nível celular mais profundas nos esferoides sem seção histológica. Com imagens confocal tridimensionais, podem ser obtidos detalhes do nível celular a uma profundidade de 200 mícrons. Além disso, é mostrada uma comparação entre o esferoide de buracos criosectionados e limpos, manchado para pimonidazol e p27kip1.A coloração do pimonidazol mostra a região hipóxica do esferoide, e a coloração p27kip1, marca a prisão do ciclo celular e a mancha nuclear DAPI. Penetração mais profunda e menos dispersão, permitem uma melhor representação da estrutura esferoide tridimensional com perda mínima de luz. A renderização tridimensional dos esferoides FUCCI, manchada com DRAQ7, é mostrada.A solução de compensação tem impacto mínimo no tamanho do esferoide. O diâmetro do esferoide foi definido com base em uma esfera com a mesma área transversal do esferoide. Os esferoides foram observados para um leve aumento de tamanho nas primeiras seis horas, como indicado por uma variação de dobra de diâmetro entre 2% e 6% Em contraste, após 24 a 72 horas, os esferoides voltaram a um tamanho aproximadamente igual ao tamanho correspondente na fixação pós-paraformaldeído pbs.É importante esperar pelo menos 24 horas antes da imagem, para deixar a solução de compensação equilibrar com os esferoides e o gel. Este protocolo permite que os praticantes coletem rapidamente dados de um grande número de esferoides, permitindo uma análise matemática e estatística quantitativa detalhada que fornece insights detalhados sobre a biologia.

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