Name: in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

Vi vil gerne takke M. Kondo og M. Matsuzaki for at låne os XLPLN25XSVMP-objektivet. Dette arbejde blev støttet økonomisk fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) af Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 til R.K.) og Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til S.O.), fra Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til S.O.) og fra Japan Science and Technology Agency af Moonshot R&D (JPMJMS2024 til H.M.).

Alle dyreforsøg blev godkendt og udført efter politikkerne fra Animal Ethics Committee og Genetic Recombinant Experiment Safety Committee ved University of Tokyo. Både mandlige og kvindelige CX3CR1-GFP-mus i alderen 2-4 måneder blev brugt i forsøgene. Af hensyn til eksperimenternes sikkerhed og vedligeholdelsen af sterile forhold blev alle procedurer udført med hvide frakker, masker og sterile handsker. Alle instrumenter blev steriliseret før brug.
1. Forberedelse af instrumenter og dyr
<ol><li>Saml et metalrør med glasbund (figur 1A).<ol><li>Påfør en lille dråbe UV-hærdende optisk klæbemiddel i den ene ende af et specialfremstillet rustfrit rør (udvendig diameter 3,0 mm, indvendig diameter 2,8 mm, højde 1,7 mm). Spred limen ensartet på rørets cirkulære kant. BEMÆRK: Der skal bruges en tilstrækkelig mængde klæbemiddel til at dække hele kanten af røret.</li>
		<li>Anbring et cirkulært glasdæksel (3,0 mm diameter, 0,15 ± 0,02 mm tykkelse) til den limdækkede ende af metalrøret, og tryk let dækslet mod røret, så mellemrummet mellem røret og glasset er fyldt med limen. Juster derefter glasets position, så det passer inden for metalrørets ydre kant.</li>
		<li>Bestråle glasset med UV-lys i tilstrækkelig tid til at hærde klæbemidlet. BEMÆRK: Sørg for, at glasset og røret er helt fastgjort. Hvis vedhæftningen er utilstrækkelig, kan glasset falde af efter operationen, hvilket resulterer i mislykket billeddannelse eller lækage af cerebrospinalvæske (CSF).</li>
		<li>Desinficer det samlede glasbundne metalrør med 70% ethanol og vask med sterilt saltvand for at fjerne snavs.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliser alle kirurgiske instrumenter med en tør varmesterilisator.</li>
	<li>Forbered mus til operation af vinduesimplantation. BEMÆRK: Mus skal have en passende alder. Det foretrækkes, at de er genetisk manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner i CA1 og dentate gyrus (DG). Disse punkter forklares yderligere i diskussionsafsnittet.</li>
</ol>2. Anæstesi og hovedfiksering
<ol><li>Bedøv en mus ved intraperitoneal injektion af ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin). Meloxicam (2 mg/kg) administreres ved subkutan injektion til præoperativ analgesi. Bekræft forsvinden af svaret på smertefulde stimuli, såsom haleklemning for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi. Tilsæt en halv dosis ketamin-xylazin hver gang anæstesien slides under operationen, typisk 1 time efter den første administration og hvert 30. minut derefter. Brug en varmepude under kroppen til at yde termisk støtte og påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi. BEMÆRK: Valget af anæstesi til kirurgi er afgørende. Dette punkt diskuteres detaljeret i diskussionsafsnittet.</li>
	<li>Påfør hårfjerningscreme for at fjerne hår fra hovedbunden. Desinficer hovedbunden flere gange i en cirkulær bevægelse med povidon-jodskrubbe efterfulgt af alkohol. Placer musen på den kirurgiske platform, der er forberedt med en steril vandtæt pude, og påfør sterile gardiner for at sikre det kirurgiske sted. Skær og fjern derefter hovedbunden cirkulært med en skalpel, så parietal- og occipitale knogler er fuldt eksponeret på den operative side.</li>
	<li>Fjern det subkutane bindevæv ved at gnide det med en vatpind, mens du anvender sterilt saltvand for at fjerne blødningen. Skrab forsigtigt kranieoverfladen med en rundspidset miniaturekniv for at fjerne periosteum, hvilket hjælper med at styrke vedhæftningen mellem cementen og knoglen (se trin 2.6).</li>
	<li>Påfør tandætsningsmateriale på hele overfladen, vent i titusinder af sekunder, og skyl med tilstrækkeligt sterilt saltvand.</li>
	<li>Brug vandtæt blæk til at markere det område af knoglen, der skal fjernes (et cirkulært område med en diameter på 3,0 mm, centreret ca. 2,5 mm bageste og 2,5 mm lateralt til bregma). Efter mærkning tørres kraniets overflade grundigt. BEMÆRK: Placeringen af kraniotomi afhænger af hippocampusens størrelse og bør optimeres til forskellige aldre. Nyttige indikatorer for kraniotomiens position vil blive præsenteret nedenfor (se trin 3.4.5, BEMÆRK).</li>
	<li>Fastgør den rektangulære aluminiumsplade med en tykkelse på 1,0 mm og med et hul på 5,0 mm i diameter i midten til kraniet ved hjælp af tandharpikscement i henhold til producentens anvisninger.<ol><li>Juster forsigtigt hullet i midten af pladen med det cirkulære område markeret med en pen (se trin 2.5), så aluminiumspladen er parallel med kraniets markerede overflade (figur 1B). Sørg for, at cementen tæt forsegler alle huller mellem pladen og knoglen. Vent i ca. 5 minutter på, at cementen er tilstrækkeligt hærdet.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer musen på hovedholderenheden med vinkeljusteringer via den vedhæftede plade.</li>
</ol>3. Implantation af observationsvinduet
BEMÆRK: Følgende kirurgiske procedurer skal udføres under et stereomikroskop.
<ol><li>Lav en cirkulær rille på kraniet ved hjælp af en dermal stans med en diameter på 3,0 mm. Juster den cirkulære rille og det område, der er markeret med en pen i trin 2.5. Drej dermalstansen med let tryk, så rilledybden gradvist øges. Kontroller ofte, at rilledybden er konstant over hele omkredsen.</li>
	<li>Når dermalstansen når det inderste lag af kraniet, løftes forsigtigt den centrale knogleø ved hjælp af en 30 G nål, før du rører ved den underliggende dura. BEMÆRK: Let væskelækage fra bunden af rillen indikerer, at rillen er tæt på duraen.</li>
	<li>Fjern dura ved hjælp af en dura picker. BEMÆRK: Fuldstændig fjernelse af dura i kranievinduet er nødvendig og vil kræve omhyggelig resektion af den resterende dura i periferien ved hjælp af fine tang.</li>
	<li>Aspirer forsigtigt vævet for at udsætte hippocampusens alveus med 23 G eller 25 G stumpe nåle forbundet med aspiranten. BEMÆRK: Dette trin er det mest kritiske for vellykket billeddannelse. Vigtige tekniske punkter for vævsaspiration er beskrevet detaljeret i diskussionsafsnittet.<ol><li>Aspirer pia og pial karrene.</li>
		<li>Aspirer det kortikale væv fra overfladen. Hold dybden af eksponeret vævsoverflade homogen over hele kranievinduet. Uddyb gradvist aspirationen, indtil fibrene i den ydre kapsel eksponeres.</li>
		<li>Placer forsigtigt sugespidsen til den ydre kapsel nær den laterale ventrikel (LV) placeret i den rostrolaterale ende af kranievinduet. Fjern overfladelaget af den ydre kapsel, der løber i caudomedial til rostrolateral retning, og derefter det indre lag, der løber i mediolateral retning. BEMÆRK: Den udvendige kapsel nær LV kan let fjernes fra den underliggende struktur.</li>
		<li>Bekræft fjernelsen af hele den eksterne kapsel ved at kontrollere den fulde eksponering af overfladen af alveus og den dorsale hippocampale kommission (DHC). BEMÆRK: DHC dækker den kaudomediale del af CA1. Alveus og DHC kan skelnes fra den ydre kapsel ved deres fiberorienteringer. Fibrene i alveus og DHC løber nemlig i rostromedial til kaudolateral retning og kan skelnes fra fibrene i den ydre kapsel. Alveus og DHC er tæt fastgjort til CA1 og bør ikke beskadiges. Alle fragmenter af den ydre kapsel skal fjernes, da eventuelle resterende fragmenter forhindrer direkte kontakt af glasdækslet til alveus.</li>
		<li>Bekræft, at blødningen er stoppet grundigt, og fyld hullet med sterilt saltvand til niveauet af kraniets overflade. BEMÆRK: Synsfeltet her hjælper med at bedømme, om hullet er i den passende position til musens specifikke alder. Ideelt set bør alveus og den underliggende CA1 optage det meste af det centrale område. En del af DHC er synlig i det kaudomerede område. Åbningen af LV kan påvises ved den rostrolaterale kant (figur 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Indsæt glasbundet metalrør (se trin 1.1) lodret i hullet, mens du aspirerer det overskydende vand, der løber over fra rørets sider, indtil glasbunden presser let mod alvenen og delvis flader den underliggende CA1. BEMÆRK: Dette tryk skal justeres korrekt. Hvis den er for stærk, vil CA1 blive beskadiget. Hvis det er for svagt, vil den sfæriske aberration på grund af krumningen af CA1 forringe billedopløsningen i dybe strukturer.</li>
	<li>Brug tandharpikscement til at fastgøre væggen i det indsatte rør til det omgivende kranium (figur 1C). Sørg for, at hele omkredsen er tæt forseglet, og at der ikke er lækage af luft eller CSF. Vent i ca. 5 minutter på, at cementen hærder. BEMÆRK: Hvis cementen placeres, når dens viskositet er lav, kan den lække ind i hjernens parenchyma gennem mellemrummet mellem røret og kraniet og beskadige hjernen. Derfor bør cementen påføres efter polymerisationsinitiering, hvilket øger viskositeten og reducerer lækage gennem spalten.</li>
	<li>Vask hele pladen, kraniet og indersiden af røret med sterilt saltvand for at fjerne snavs.</li>
</ol>4. To-fotonmikroskopi umiddelbart efter operationen til kvalitetskontrol af operationen
<ol><li>Sæt musen i hovedholderenheden under objektivlinsen på to-fotonmikroskopet og på det motoriserede XY-scanningstrin. Brug en varmepude til termisk støtte. Overvåg og juster dybden af anæstesi som beskrevet i trin 2.1, da denne kvalitetskontrol kan tage op til 30 minutter. BEMÆRK: objektivobjektivet til nedsænkning i vand med en arbejdsafstand (WD) længere end 3 mm og en høj numerisk blænde (NA) anbefales. En korrektionskrave på objektivlinsen kan forbedre opløsningen ved at kompensere for brydningsindeksets uoverensstemmelse mellem glasset og biomaterialerne.</li>
	<li>Fyld mellemrummet mellem glasset og objektivlinsen med vand, og vær særlig omhyggelig med at undgå luftbobler. Udvid om nødvendigt metalpladens areal ved hjælp af en plastfilm, der holder mere vand, for at dække hele objektivets frontlinse.</li>
	<li>Tænd en femtosekundpulserende laser med 920 nm bølgelængde til excitation af de fluorescerende sonder udtrykt i hjernen, og start billedoptagelsessoftware.</li>
	<li>Juster fokus til CA1 ved hjælp af det motoriserede trin og det motoriserede fokussystem. Placer målstrukturen med vejledning af fluorescensen udsendt fra hjernens parenchyma og det reflekterede lys fra kanten af metalrøret under kontinuerlig belysning af den pulserende laser.</li>
	<li>Mål dybden af hjernens parenchyma, der berører glasbunden, ved at justere fokus med det motoriserede fokussystem. Sammenlign dybderne på forskellige vandrette steder for at bedømme justeringen af glasbunden og billedplanet.<ol><li>Juster vinklen på musehovedet ved at vippe hovedholderenheden, indtil glasbunden er indstillet til at være parallel med billedplanet.</li>
	</ol></li>
	<li>Juster korrektionskraven for målet for at opnå den højeste opløsning i dybden af målstrukturen i CA1.</li>
	<li>Bekræft, at fluorescerende celler i molekyllaget (ML) på DG's øverste blad i en dybde på 500 μm fra glasbunden kan afbildes i hele synsfeltet. BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at bedømme kvaliteten af operationen. Hvis CA1 er beskadiget, forhindrer fokal hjerneødem fluorescensdetektion i en dybde på mere end 200 μm fra overfladen. Kun når der ikke er nogen skade på CA1, og krumningen af CA1-lagene er korrekt fladtrykt af den overliggende dæksel, kan DG-signalerne detekteres umiddelbart efter operationen (figur 2A-D). Afsnittet Repræsentative resultater er en enkel måde at bestemme grænsen mellem CA1 og GD'et på.</li>
</ol>5. Postoperativ pleje
<ol><li>Sug vandet inde i røret og dæk det med en plastikforsegling for at forhindre snavs i at komme ind.</li>
	<li>Hold musen varm og vent på genopretning fra anæstesi.</li>
	<li>Administrer meloxicam (2 mg/kg) subkutant hver 24. time, så længe musen udviser smerterelateret adfærd.</li>
	<li>Hæv den postoperative mus i individuelle boliger i flere uger.</li>
</ol>6. In vivo kronisk to-foton-billeddannelse af mikroglia ved hjælp af CX3CR1-GFP-mus
<ol><li>Efter induktion af anæstesi vaskes indersiden af metalrøret med sterilt saltvand for at fjerne snavs. Sørg for, at hippocampusens hvide alveus er synlig gennem glasset (figur 3A), og at der ikke er komplikationer såsom postoperativ blødning.</li>
	<li>Indstil musen under to-fotonmikroskopet ved at følge trin 4.1 til 4.6.</li>
	<li>Kontroller kvaliteten og intensiteten af billeder opnået ved to-foton excitation af hippocampus (figur 3B). Sørg for, at de billeder, der tages efter reduktion af postoperativt ødem, er sammenlignelige med eller bedre end dem, der er taget på operationsdagen (figur 2A, se trin 4.5). BEMÆRK: Billedforringelse indikerer tilstedeværelsen af vævsskade inde i hjernen.</li>
	<li>Sørg for, at mikroglia allerede har genvundet deres forgrenede morfologi (figur 3C). BEMÆRK: Billeddannelsesdataene for microglia indikerer, at der kræves mindst 3-4 uger for mikroglia at vende tilbage til deres basale tilstand.</li>
	<li>Der udføres in vivo-billeddannelse i alle lag af CA1 til forsøgets særlige formål.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+disease.">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity.">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum.">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).</li><li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines.">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo.">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).</li><li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex.">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540 (2016).</li><li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization.">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).</li><li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits.">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures.">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li><li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia.">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li><li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity.">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li><li>B&#246;ttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution.">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination.">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity.">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer's+disease+model.">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties.">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1.">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning.">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li><li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus.">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li><li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability.">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li><li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li></ol>

Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter.

Denne metode indeholder detaljerede kirurgiske procedurer, men den kan give billeder i høj opløsning over hele CA1 i en længere periode, hvis den er forberedt korrekt. Eksperimenter med flere mus bekræftede, at billedkvaliteten i den kroniske postoperative fase er bedre end for akut postoperativ billeddannelse. Den bedre billedkvalitet blev opretholdt i mere end 2 måneder. Den mest almindelige årsag til svigt er utilsigtet skade på CA1 under operationen, som er identificeret i den postoperative kvalitetskontrol (se trin 4). Dette kan skyldes direkte skade ved aspiration, tørring af hjernen, overdreven tryk af glasset eller toksicitet fra tandcementen i det sidste trin. En anden årsag til svigt er postoperativ blødning, som kan bekræftes gennem glasbundsvinduet inden for 1 uge efter operationen (se trin 6.1). Læs protokollen omhyggeligt og tag alle forholdsregler for at undgå sådanne problemer.
Selv med den nuværende opsætning af to-fotonmikroskop med GaAsP-detektorer i laboratoriet resulterer forsøget på at afbilde dorsal CA1 gennem cortex i et betydeligt tab af opløsning på grund af den ikke ubetydelige spredning af lys. For at opnå tilstrækkelig opløsning til at observere bevægelsen af mikrogliale processer eller dannelsen af dendritiske rygsøjler af neuroner i CA1 er det derfor uundgåeligt at fjerne en del af den overliggende cortex som i den nuværende metode. Den eneste alternative måde at reducere omfanget af kortikal fjernelse på, samtidig med at der opretholdes en høj billedopløsning, er at integrere et relæobjektiv, såsom et gradientbrydningsindeks (GRIN) objektiv. I denne tilgang er en GRIN-linse blevet placeret inde i et styrerør implanteret direkte over CA1 til kronisk CA1-billeddannelse28,29. Styrerørets ydre diameter var 1,8 mm, hvilket er mindre end enhedens 3,0 mm i dette papir, samtidig med at der blev produceret høj opløsning (NA; 0,82), der kan sammenlignes med systemet her (effektiv NA; 0,88). Imidlertid har tilgangen med et GRIN-objektiv et smalt synsfelt til observation i høj opløsning og en kort billeddybde begrænset af GRIN-objektivets WD. Derfor er billeddannelse af alle hippocampale lag i et bredt synsfelt med høj opløsning en specifik fordel ved metoden i dette papir.
En begrænsning af denne procedure er, at delvis fjernelse af cortex og betændelse kan have nogle skadelige virkninger på hippocampus. Men fordi den fjernede cortex ikke har nogen direkte input til hippocampus, er entorhinal cortex ikke beskadiget, og hippocampus selv er ikke direkte skadet, er den samlede vurdering, at funktionsnedsættelsen af hippocampus ikke er signifikant. Flere tidligere undersøgelser har bekræftet, at hippocampale funktioner, herunder læring og hukommelse, bevares efter hippocampus vinduesimplantation 25,26,27,30,31,32,33,34. Derfor forventes den billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, trofast at rapportere hippocampale funktioner efter en tilstrækkelig postoperativ periode.
Fremtidige retninger af forskningsemner baseret på denne billeddannelsesteknik kan omfatte synaptisk beskæring detekteret ved samtidig billeddannelse af mikroglia og neuroner5, læringsrelateret mikroglial interaktion med synapser35, mikroglial motilitet reguleret af hippocampus neurale aktivitet36 og mikrogliale reaktioner på perifer inflammation eller vævsskade7. Denne metode vil også hjælpe med at belyse udviklingen af neurodegenerative sygdomme. For eksempel akkumuleres amyloid β- og tau-proteiner parallelt med neuronale celledødsfald og hippocampal atrofi, hvilket fører til kognitiv dysfunktion i Alzheimers sygdom (AD); Microglia er rapporteret at være involveret i denne proces37,38. In vivo kronisk billeddannelse af mikroglia og neuroner ved hjælp af AD-musemodellerne vil gøre det muligt for os at overvåge sammenhængen mellem mikrogliafunktioner og neuronal patologi i hippocampus i AD-musemodellerne.
Dette papir fokuserer på mikroglial billeddannelse, men den samme billeddannelsesprocedure gælder for de andre neuronale og gliacelletyper i CA1. Derudover er protokollen begrænset til billeddannelse af bedøvede mus, men teknikken kan også udvides til overvågning af hippocampus mikroglia i vågne mus. Bevægelsesartefakterne induceret af åndedræt, hjerteslag og kropsbevægelser, især i de dybe hippocampale lag væk fra glasvinduet, kan eksistere i eksperimenter med vågne mus. Derfor kan det være nødvendigt med et passende bevægelseskorrektionssystem til at fange mikroglial morfologi og dynamik.
Drøftelse vedrørende protokollen Det anbefales at vælge mus af passende alder og genetiske modifikationer til ekspression af fluorescerende sonder med tidsmæssig og rumlig specificitet (se trin 1.3). Mus ved 1 måneds alder kan bruges til forsøg, men mus ældre end 2 måneder er lettere at håndtere med deres større kropsstørrelse og modstand mod kirurgisk stress. Derudover er den ydre kapsel og hippocampusens alveus vanskeligere at adskille hos yngre mus. Derfor kræver fjernelse af den eksterne kapsel hos unge mus kirurgiske færdigheder (se trin 3.4.3-4). Vurdering af operationen og efterfølgende billeddannelse vil være mere ligetil med mus, der udtrykker fluorescerende proteiner reproducerbart og ensartet i CA1 og DG (se trin 4.7). Derfor anbefales det i de indledende forsøg med operationen at bruge transgene mus med tyndt mærkede neuroner, såsom Thy1-YFP eller Thy1-GFP mus39, eller mus med mærket microglia, såsom CX3CR1-GFP mus24.
For en vellykket operation er valget af anæstesi vigtigt (se trin 2.1). Forskellige typer anæstesi kan forårsage forskellige grader af intraoperativt hjerneødem, som påvirker operationens sværhedsgrad, den relative position af det implanterede metalrør og omfanget af hjernekompression ved glasvinduet. Disse faktorer kan også påvirke overlevelsen af hippocampus neuroner efter operationen.
I aspirationsprocessen for at afsløre hippocampus (se trin 3.4) skal følgende punkter bemærkes for at minimere skaden på hjernen og sikre en vellykket billeddannelse. Tilfør konstant sterilt saltvand på vævsoverfladen ved at placere et udløb ved siden af kranievinduet. Undgå, at vævsoverfladen udsættes for luft under aspiration. Det grundlæggende princip for vævsaspiration er at fjerne vævsoverfladen ved en væskestrøm ind i sugespidsen. Direkte kontakt mellem sugespidsen og vævet bør undgås. Juster det undertryk, der påføres sugerøret, til at være minimalt. Opsug vævet trin for trin og bekræft, at blødningen kontrolleres i hvert trin. Når blødningen forlænges, skal du vente, indtil blødningen stopper spontant. Hold aspiration fra en kort afstand fra blødningsstedet med en konstant strøm af sterilt saltvand. Opsug vævet for at skabe et cylindrisk rum med størrelse, der passer til metalrøret med glasbund (se trin 1.1). Vælg 23 G nåle til at opsuge tykke pialkar eller store vævsfragmenter og 25 G nåle til at suge små vævsrester.

Microglia er de eneste immunceller og vævsmakrofager, der er bosiddende i hjernen. Ud over deres funktioner som immunceller, såsom hurtig reaktion på inflammation, har de vist sig at spille en række fysiologiske roller i vedligeholdelse og ombygning af neurale kredsløb, såsom synaptisk beskæring, regulering af synaptisk plasticitet og kontrol af neuronal aktivitet 1,2,3,4,5 . Fysiologiske interaktioner mellem mikroglia og neuroner er af stigende interesse i både neurale kredsløbsudvikling og sygdomsneurobiologi. Analyse af mikrogliaens fysiologi in vivo kræver metoder til at observere mikroglia uden vævsskade og inflammatoriske reaktioner. Imidlertid er mikroglia følsomme over for betændelse og ændrer dramatisk deres former og funktioner som reaktion på vævsskade 6,7.
To-foton in vivo billeddannelse er et ideelt værktøj til at fange den fysiologiske dynamik i microglia8. Indledende anvendelser af in vivo to-foton-billeddannelse afslørede den dynamiske bevægelse af mikrogliale processer til miljøovervågning i den voksne musecortex 9,10. De følgende to-foton billeddannelsesundersøgelser udvidede yderligere in vivo overvågning af microglia til analyse af funktionelle og strukturelle interaktioner med neuroner 5,11,12,13,14. Imidlertid har billeddybden af konventionel to-fotonmikroskopi været begrænset til mindre end 1 mm fra hjerneoverfladen15,16. Denne begrænsning forklarer manglen på tidligere undersøgelser, der rapporterer mikrogliaens adfærd i dybe hjerneområder, såsom hippocampus.
Nylige RNA-sekventeringsundersøgelser har afsløret en betydelig regional heterogenitet af mikroglia, hvilket øger muligheden for forskellige funktionelle roller 17,18,19,20,21. Derfor er det nødvendigt at registrere mikrogliale interaktioner med neuroner i forskellige hjerneområder, men tekniske vanskeligheder har hæmmet sådanne undersøgelser. Især er mikroglial aktiv involvering i synapsremodellering blevet rapporteret at være kritisk i udviklingen af det hippocampale neurale netværk og dets hukommelsesrelaterede funktioner22,23. Imidlertid har effektive metoder til observation af ubestridt hippocampus mikroglia in vivo ikke været tilgængelige.
Denne protokol forklarer procedurerne for kronisk in vivo observation af hvilende mikroglia i CA1 i dorsal hippocampus ved hjælp af præcist kontrollerede kirurgiske teknikker. To-foton-billeddannelse af CA1-området i CX3CR1-GFP-mus (CX3CR1+/GFP), som udtrykker GFP i mikroglia24, muliggjorde observation af den forgrenede mikroglia i alle lag af CA1 med tilstrækkelig opløsning. Protokollen indeholder flere tip til vellykket implantation af observationsvinduet og passende billeddannelsesbetingelser. Derudover præsenteres samtidig visualisering af pyramidale neuroner og mikroglia i CA1 som et applikationseksempel. Fordelene, begrænsningerne og potentialerne ved denne teknik diskuteres også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >23 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-166</td>
			<td >Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-167</td>
			<td>Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3 mm dermal punches (DermaPunch)</td>
			<td >Maruho</td>
			<td >213001610</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 G needles</td>
			<td >Dentronics</td>
			<td >Disposable needle No. 30</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A femtosecond pulsed laser</td>
			<td >Spectra-Physics</td>
			<td >MaiTai Deep See</td>
			<td>A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A two-photon microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >A1R MP+</td>
			<td >Microscope for the CA1 imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-hSyn-Cre</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >An objective lens for two-photon imaging</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >XLPLN25XSVMP</td>
			<td>25&#215; objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aspirators</td>
			<td >Shin-ei Industries</td>
			<td >KS-500</td>
			<td>Tools for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum plates</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >CP-1</td>
			<td>Plates made of alminum for head fixation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemical depilatory cream</td>
			<td >YANAGIYA</td>
			<td ></td>
			<td>Cream for hair removal around the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circular glass coverslips</td>
			<td >Matsunami Glass</td>
			<td >3&#966; No.1</td>
			<td>Coverslips bonded to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CX3CR1-GFP mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >008451</td>
			<td>Transgenic mice for microglial imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cylindrical stainless steel tubes</td>
			<td >MORISHITA</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental etching material</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610461</td>
			<td>Used to etch the skull bones.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental resin cement (Super-Bond C&#38;B)</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610555</td>
			<td>Dental cement.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dura pickers (Micro Points)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >10063-15</td>
			<td>Tools for dura removal.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >PRI13-3374</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head holding device</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >MAG-2</td>
			<td>The head holding device of mice with angle adjusters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >BWT-100A and HB-10</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >ALA Scientific</td>
			<td >HEATINGPAD-1 and Hot-1</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine (Ketalar)</td>
			<td >Daiichi Sankyo Company</td>
			<td >S9-001665</td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam</td>
			<td >Tokyo Chemical Industry</td>
			<td >M1959</td>
			<td>Analgesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ophthalmic ointment</td>
			<td >Sato Pharmaceutical</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prevent eye dryness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-iodine scrub solution</td>
			<td >Meiji Seika Pharma</td>
			<td >2612701Q1137</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-tipped miniature knives</td>
			<td >Surgistar</td>
			<td >4769</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td >MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td>
			<td >450-098-67</td>
			<td>Disposable surgical tool.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo microscopes</td>
			<td >Leica Microsystems</td>
			<td >S8 APO</td>
			<td>Microscopes for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td >Otsuka Pharmaceutical Factory</td>
			<td >3311401A2026</td>
			<td>Washing solution during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile waterproof pad</td>
			<td >AS ONE</td>
			<td >8-5945-01</td>
			<td>Surgical platform.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulforhodamine 101</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S7635</td>
			<td>A dye for in vivo vessel imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical drape</td>
			<td >Medline Industries</td>
			<td >MP-0606F6T</td>
			<td>Perforated drape for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Toshiba</td>
			<td >GL15</td>
			<td>Used to cure the adhesives.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-curing optical adhesives</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >NOA81</td>
			<td>Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine (Celactal 2%)</td>
			<td >Bayer</td>
			<td ></td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus

Microglia, de eneste immunceller, der er bosiddende i hjernen, deltager aktivt i vedligeholdelse af neurale kredsløb ved at ændre synapser og neuronal excitabilitet. Nylige undersøgelser har afsløret differentiel genekspression og funktionel heterogenitet af mikroglia i forskellige hjerneområder. De unikke funktioner i det hippocampale neurale netværk i læring og hukommelse kan være forbundet med mikrogliaens aktive roller i synapsemodellering. Imidlertid har inflammatoriske reaktioner induceret af kirurgiske procedurer været problematiske i den to-foton mikroskopiske analyse af hippocampus mikroglia. Her præsenteres en metode, der muliggør kronisk observation af mikroglia i alle lag af hippocampus CA1 gennem et billeddannelsesvindue. Denne metode tillader analyse af morfologiske ændringer i mikrogliale processer i mere end 1 måned. Langsigtet og højopløselig billeddannelse af hvilemikroglia kræver minimalt invasive kirurgiske procedurer, passende objektivt linsevalg og optimerede billeddannelsesteknikker. Den forbigående inflammatoriske respons af hippocampus microglia kan forhindre billeddannelse umiddelbart efter operationen, men microglia genoprette deres hvilende morfologi inden for få uger. Desuden giver billeddannelsesneuroner samtidigt med microglia os mulighed for at analysere interaktionerne mellem flere celletyper i hippocampus. Denne teknik kan give vigtige oplysninger om mikroglial funktion i hippocampus.

Ved hjælp af denne teknik kan den forgrenede og hvilende mikroglia observeres kronisk inden for alle lag af dorsal CA1, herunder stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) og stratum lacunosum-moleculare (SLM), især 3-4 uger efter operationen, når betændelsen aftager. Hvis operationen udføres korrekt, kan billeddannelse udføres op til flere måneder efter operationen. Dette afsnit indeholder tre emner, der er nyttige til evaluering af intravital billeddannelse. For det første gives prøvebilleder umiddelbart efter operationen og i den kroniske fase som referencer for passende kirurgiske og billeddiagnostiske procedurer. For det andet beskrives mikrogliaens særskilte morfologi, deres fluorescensintensitet og blodkarfordeling i specifikke hippocampale lag for at hjælpe læserne med at estimere billeddybden, der spænder fra alveus til DG. For det tredje gives et applikationseksempel, der illustrerer samtidig billeddannelse af neuroner og mikroglia.
De repræsentative billeder af mikroglia i CX3CR1-GFP-mus umiddelbart efter operationen er vist i figur 2. Hvis der ikke er nogen åbenbar skade på CA1, og krumningen af CA1-lagene er korrekt fladtrykt af det overliggende dækslip, overstiger to-fotonbilleddannelsesdybden af mikroglia hele CA1-lagene og når 500 μm fra den kirurgiske overflade, hvor DG's ML eller granulatcellelag (GCL) findes (figur 2A; se trin 4.7 og figur 4E). Microglia er lidt mindre forgrenet, især i laget tæt på den kirurgiske overflade sammenlignet med dem i den intakte hippocampus. Ikke desto mindre udviser de ingen fremtrædende aktivering, hvilket tyder på korrekte kirurgiske procedurer (figur 2B). På den anden side vil ødem i CA1 induceret af vævsskade begrænse billeddybden til 200 μm (figur 2C). Vævsskade inducerer også unormal mikroglial aktivering, såsom akkumulering af udbulningsprocesser mod den frie vævsoverflade (figur 2D; sammenlign med det øverste billede i figur 2B). Dette er tegn på uhensigtsmæssig kirurgi.
De repræsentative billeder af mikroglia i den kroniske fase mere end 3 uger efter operationen er vist i figur 3. Microglia kan afbildes igen ud over CA1 til de dybere lag af DG med højere fluorescerende intensitet og opløsning og med mere homogen fordeling (se trin 6.3, figur 3B). Billedkvaliteten er bedre end umiddelbart efter operationen (figur 2A). Denne forskel kan forklares ved reduceret ødem og betændelse. Microglia i alle lag har allerede genoprettet deres forgrenede morfologi (figur 3C), forskellig fra deres postoperative udseende (figur 2B). Time-lapse imaging af microglia i CA1 afslører de immobile cellelegemer og meget bevægelige processer til overvågning (Video 1-2). Deres bevægelige opførsel ligner den tidligere rapport om mikroglial procesdynamik i cortex9.
Det er ligetil at specificere de afbildede hippocampale lag baseret på fordelingen og dybden af neuronale cellelegemer ved hjælp af mus, der udtrykker fluorescerende sonder i hippocampale neuroner25,26,27. Uden hjælp fra positionsinformationen om neuroncellelegemerne giver signalerne fra fluorescerende mikroglia alene nogle spor til identifikation af hippocampale lag (figur 3B). Microglia i alveus har aflange cellelegemer og processer, der har tendens til at strække sig langs de aksonale kanaler (figur 4A). Microglia i andre lag kan skelnes ved deres runde cellelegemer og processer, der udstråler uden foretrukne retninger. Microglia i SP er blandt de tæt pakkede pyramidale neuroner og kan skelnes af den lavere tæthed af mikrogliale processer. Lagene over og under SP identificeres som henholdsvis SO og SR (figur 4B). Det er umuligt at skelne mellem SR og SLM baseret på mikrogliale egenskaber alene. Grænsen mellem CA1 og DG genkendes af tykke blodkar, der løber langs grænsen (figur 4C). Disse beholdere kan bedre genkendes ved mærkning af beholdere med farvestoffer såsom sulforhodamin 101 (SR101; 5 mM, 4 μL / g legemsvægt) injiceret intraperitonealt (figur 4D). Fluorescenssignalet fra microglia falder kraftigt i DG sammenlignet med det overliggende CA1, sandsynligvis på grund af forskellen i brydningsindekset for disse strukturer. Denne forskel i fluorescensintensitet kan også bidrage til at præcisere grænsen mellem GD og CA1. Som et applikationseksempel vises samtidig billeddannelse af GFP-positive mikroglia og tdTomato-mærkede pyramidale neuroner (figur 4E). I dette eksperiment modtog CX3CR1-GFP-mus en injektion af adeno-associeret virus (AAV) til ekspression af tdTomato i hippocampale pyramidale neuroner. Neuronal mærkning hjælper med at forstå de nøjagtige lagstrukturer i CA1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Figur 1: Skematiske tegninger til implantation af observationsvinduet . (A) Tværsnit af det samlede glasbundne metalrør. Et cirkulært glasdæksel klæber til den ene ende af det cylindriske rustfri rør. (B) Tværsnitsbillede af aluminiumspladen, der er fastgjort til kraniet. Pladen skal være parallel med den markerede overflade af kraniet for ikke at forstyrre objektivlinsen, placeret tæt på pladen til fokusering. C) Tværsnit af det implanterede rør. Glasbunden skal være tæt fastgjort til hippocampusens alveus for forsigtigt at trykke og flade overfladen af CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Figur 2: In vivo-billeddannelse af mikroglia i CX3CR1-GFP-mus umiddelbart efter operationen. (A) Repræsentativ 3D-rekonstruktion fra in vivo CA1-billeddannelse af en CX3CR1-GFP-mus på postoperativ dag (POD) 0 (bredde: 511 μm, højde: 511 μm, dybde: 550 μm). Den fluorescerende mikroglia i DG's ML i en dybde af 500 μm fra glasbunden kan afbildes gennem hele CA1. (B) Typiske GFP-fyldte mikroglia opnået i (A) vises som de maksimale intensitetsfremskrivninger (MIP'er) af billedstakke med en tykkelse på 20 μm i dybder på 100, 300 og 520 μm fra glasbunden. Mikroglial morfologi kan påvises fra DG's overfladiske CA1 til ML, dog med tilsyneladende billedforringelse i DG. Microglia, især i laget tæt på den kirurgiske overflade, er mindre forgrenede, men udviser ingen åbenbar aktivering. Skalastænger, 50 μm. (C) Repræsentativ 3D-billedrekonstruktion af den kirurgisk beskadigede CA1. Dataene blev hentet fra en CX3CR1-GFP-mus på POD 0 (bredde: 399 μm, højde: 399 μm, dybde: 450 μm). Mikroglial fluorescens kan kun påvises op til dybden af 200 μm i modsætning til den ubeskadigede CA1 (A) med fluorescerende mikroglia detekteret i en dybde på 500 μm. (D) Det typiske billede af unormalt aktiveret mikroglia i (C). MIP for GFP-billedstakke med 20 μm tykkelse i en dybde på 60 μm viser mikrogliale udbulningsprocesser, der strækker sig mod den kirurgisk eksponerede vævsoverflade. Den overordnede mikrogliamorfologi er forskellig fra billedet vist i (B). Vægtstang, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Figur 3: In vivo-billeddannelse af mikroglia i CX3CR1-GFP-mus i den kroniske fase. (A) Det repræsentative udseende af det implanterede vindue på højre dorsale CA1 i den kroniske fase. Gennem glasbunden observeres de hvide fibre i alveus tydeligt uden postoperativ blødning. DHC og LV er delvist synlige i henholdsvis det kaudomediale område og i den rostrolaterale kant. Vægtstang, 1 mm. (B) Repræsentativ 3D-rekonstruktion fra in vivo kronisk CA1-billeddannelse af en CX3CR1-GFP-mus på POD 24 (bredde: 511 μm, højde: 511 μm, dybde: 670 μm). Sammenlignet med billederne umiddelbart efter operationen (figur 2A) viser mikroglia en mere homogen fordeling og kan observeres tydeligere i de dybere lag af DG på grund af reduktionen af ødem og inflammation. (C) Typiske billeder af mikroglia fra (B) med fuldt restaureret forgrenet morfologi vises som MIP'er for GFP-billedstakke med 20 μm tykkelse i dybder på 100, 280 og 500 μm fra den kirurgiske overflade. Vægtstænger, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Figur 4: Ledetråde til identifikation af hvert lag af hippocampus under in vivo-billeddannelse og et applikationseksempel på denne metode. (A) Det typiske billede af mikroglia i alveus hos CX3CR1-GFP-mus i den kroniske fase. Mikrogliale cellelegemer og processer, der strækker sig langs de aksonale kanaler, er vist i MIP for GFP-billedstakke med 10 μm tykkelse i en dybde på 15 μm. Skalabjælke, 50 μm. (B) Repræsentative billeder af mikroglia i SO, SP og SR i den kroniske fase vist som MIP for GFP-billedstakke med 5 μm tykkelse. Den lokale tæthed af mikrogliale processer er lavere i SP end i omgivende SO eller SR på grund af de tæt pakkede pyramidale neuroner i SP. Skalastænger, 100 μm. (C) De tykke blodkar, der løber langs grænsen mellem CA1 og DG, kan kun genkendes af den mikrogliale fluorescens. Den gennemsnitlige intensitetsprojektion af flisebelagte GFP-billedstakke med 90 μm tykkelse i den kroniske fase i en dybde på ca. 500 μm vises. Hulrummet i GFP-signalet svarer til de tykke kar. Skalabjælke, 500 μm. (D) (Øvre) Billedet af samme synsfelt som C efter intraperitoneal injektion af SR101. Skalabjælke, 500 μm. (Nederst) 3D-rekonstruktion af flisebillederne efter SR101-injektion (bredde: 2,60 mm, højde: 1,73 mm, dybde: 0,69 mm). De tykke kar, der løber langs grænsen mellem CA1 og DG, kan let genkendes af den intravaskulære SR101-fluorescens. (E) (venstre) 3D-rekonstruktion af CA1 og DG (bredde: 255 μm, højde: 255 μm, dybde: 730 μm) og (højre) MIP for GFP og tdTomatfluorescens i SP fremstillet af billedstakke med 20 μm tykkelse. 1 uge før operationen blev 1,5 μL af en blanding af AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 1012 vg/ml) og AAV1-hSyn-Cre (1,0 x 109 vg/ml) injiceret i hippocampus på en CX3CR1-GFP-mus for at mærke neuronerne sparsomt. Billeddannelse blev udført på POD 0. SP og GCL genkendes let af positionen af neuronale cellelegemer. Vægtstang, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Video 1: Time-lapse billeddannelse af SO microglia i den kroniske fase. MIP af GFP-billedstabler med 20 μm tykkelse i time-lapse-billeddannelsen af SO-mikroglia, animeret, så 28 minutters afspilning på 1 sek. Vægtstang, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Video 2: Time-lapse billeddannelse af SR microglia i den kroniske fase. MIP af GFP-billedstakke med 20 μm tykkelse i time-lapse-billeddannelsen af SR-mikroglia, animeret, så 28 minutters afspilning på 1 sek. Vægtstang, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Denne artikel beskriver en metode til kronisk in vivo observation af hvilemikroglia i musens hippocampus CA1 ved hjælp af præcist kontrolleret kirurgi og to-fotonmikroskopi.

In vivo Kronisk to-foton billeddannelse af microglia i musen hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Microglia's roller i hippocampus er endnu ikke fuldt ud forstået. Denne protokol kan direkte afbilde, hvordan mikroglia kontakter og regulerer neuroner. In vivo billeddannelse af hvilende mikroglia og neuroner i hippocampus har været meget vanskelig.Denne metode kan løse dette problem. For at implantere observationsvinduet skal du lave en tre millimeter cirkulær rille på kraniet ved hjælp af en dermal stans, hvilket sikrer justeringen af rillen med det tidligere markerede område. Når dermalstansen når det inderste lag af kraniet, før du rører ved den underliggende dura, løftes forsigtigt den centrale knogleø ved hjælp af en 30 gauge nål.Fjern derefter forsigtigt dura ved hjælp af en dura picker. Opsug pia, pialkar og kortikalt væv fra overfladen. Hold dybden af eksponeret vævsoverflade homogen over hele kranievinduet og gradvist uddybe aspirationen, indtil fibrene i den ydre kapsel er udsat.Efter at have anbragt sugespidsen til den ydre kapsel nær den laterale ventrikel i den rostrolaterale ende af kranievinduet, fjernes overfladelaget af den ydre kapsel, der løber i kaudomedialen til den rostrolaterale retning. Fjern derefter det indre lag, der løber i mediolateral retning. Bekræft fjernelsen af hele den eksterne kapsel ved at kontrollere den fulde eksponering af alveusoverfladen og den dorsale hippocampale kommission.Efter at have sikret, at blødningen er helt stoppet, skal du fylde hullet med sterilt saltvand til niveauet af kraniets overflade. Indsæt derefter glasbundet metalrør lodret i hullet, mens du aspirerer det overskydende vand, der løber ud fra siderne af røret, indtil glasbunden presser let mod alveus og delvist flader den underliggende CA1. Brug tandharpikscementen til at fastgøre væggen i det indsatte rør til det omgivende kranium.Sæt musen i hovedholderenheden under objektivlinsen på to-fotonmikroskopet og på det motoriserede XY-scanningstrin. Fyld derefter mellemrummet mellem glasbunden og objektivlinsen med vand uden at skabe luftbobler. Juster fokus til CA1 med vejledning af fluorescens udsendt fra hjernens parenchyma og det reflekterede lys fra kanten af metalrøret under kontinuerlig belysning af den pulserende laser.Juster musehovedets vinkel ved at vippe hovedholderenheden, så glasbunden er parallel med billedplanet. Juster derefter korrektionskraven for målet for at opnå den højeste opløsning i en dybde af målstrukturen i CA1. Bekræft derefter, at fluorescerende celler i det molekylære lag af dentate gyrus eller DG i en dybde på 500 mikrometer fra glasbunden er afbildet i hele synsfeltet.Kun i tilfælde af en vellykket operation kan DG-signalerne detekteres med det samme. Hæv den postoperative mus i individuelle boliger i flere uger. Indstil den bedøvede mus under to-fotonmikroskopet.Udfør billeddannelsen af hippocampus. Bekræft, om kvaliteten og intensiteten af de billeder, der er taget efter reduktionen af postoperativt ødem, er bedre eller sammenlignelige med dem, der er taget på operationsdagen. Sørg for, at mikroglia har genvundet deres forgrenede morfologi.Udfør derefter in vivo-billeddannelse på laget af interesse i CA1. Microglia i CX3CR1-GFP-mus fanget umiddelbart efter operationen viste ingen fremtrædende aktivering. Efter vellykket operation uden induktion af ødem oversteg to-fotonbilleddannelsesdybderne hele CA1-lagene og nåede 500 mikrometer fra den kirurgiske overflade.Mikroglia i den kroniske fase på mere end tre uger efter operationen udviste højere fluorescerende intensitet og opløsning og mere homogen fordeling på grund af reduceret ødem og betændelse. Microglia i alle lag genoprettede allerede deres forgrenede morfologi og udviste ubevægelige cellelegemer og meget modale processer. Billederne i høj opløsning over hele CA1 blev leveret i flere måneder.Signalerne fra fluorescerende mikroglia hjælper med at identificere hippocampale lag. Microglia i alveus havde aflange cellelegemer og processer, der strækker sig langs de aksonale kanaler. Microglia i stratum pyramidale kunne skelnes af den lavere tæthed af deres processer.Grænsen mellem CA1 og DG kunne genkendes af tykke blodkar, der løber langs grænsen, hvilket blev bedre anerkendt ved mærkning af skibe med sulforhodamin 101. Som et applikationseksempel blev GFP-positive mikroglia og tdTomato-mærkede pyramidale neuroner samtidig afbildet. Neuronal mærkning hjalp med at forstå de nøjagtige lagstrukturer af CA1.Det vigtigste punkt er at reducere kirurgiske skader. Undgå vævsskade ved aspiration. Påfør et let tryk, når du indsætter glasbunden, og undgå, at tandcement rører hjerneoverfladen.Denne tilgang vil hjælpe med at identificere mikrogliaens rolle i hippocampus. For eksempel, hvordan mikroglia interagerer med neuroner, hvordan de er involveret i læring, og hvordan de styrer hjernesygdomme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-foton<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af dendritiske spidser i Mouse Cortex Ved hjælp af en tyndere-kranium Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging for Cellulær Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Samtidig To-foton<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af synaptisk indgange og Postsynaptiske Mål i Mouse retrospenialis Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillær to-foton In vivo Billeddannelse af musens nethinde

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...