Name: in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00
Duration: 7 min 3 s
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हम एम कोंडो और एम मात्सुजाकी को हमें एक्सएलपीएलएन 25एक्सएसवीएमपी उद्देश्य लेंस देने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) से जेएसपीएस रिसर्च फेलो (18जे21331 से आरके) के लिए सहायता अनुदान और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (20एच00481, 20ए301, 20एच05894, 20एच05895 से एसओ) द्वारा वित्तीय रूप से सहायता प्रदान की गई थी।

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	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+disease.">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity.">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum.">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).</li><li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines.">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo.">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).</li><li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex.">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540 (2016).</li><li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization.">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).</li><li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits.">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures.">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li><li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia.">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li><li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity.">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li><li>B&#246;ttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution.">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination.">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity.">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer's+disease+model.">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties.">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1.">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning.">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li><li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus.">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li><li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability.">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li><li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li></ol>

लेखकों में से किसी के भी हितों का कोई टकराव नहीं है।

इस विधि में विस्तृत शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं, लेकिन यह ठीक से तैयार होने पर विस्तारित अवधि के लिए पूरे सीए 1 पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान कर सकती है। कई चूहों के साथ प्रयोगों ने पुष्टि की कि क्रोनिक पोस्टऑपरेटिव चरण में छवि की गुणवत्ता तीव्र पोस्टऑपरेटिव इमेजिंग की तुलना में बेहतर है। बेहतर छवि गुणवत्ता 2 महीने से अधिक समय तक बनाए रखी गई थी। विफलता का सबसे आम कारण सर्जरी के दौरान सीए 1 को अनजाने में नुकसान है, जिसे पोस्टऑपरेटिव गुणवत्ता जांच में पहचाना जाता है (चरण 4 देखें)। यह आकांक्षा से सीधी चोट, मस्तिष्क के सूखने, कांच द्वारा अत्यधिक दबाव, या अंतिम चरण में दंत सीमेंट से विषाक्तता के कारण हो सकता है। विफलता का एक अन्य कारण पोस्टऑपरेटिव रक्तस्राव है, जिसे सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के भीतर ग्लास-बॉटम विंडो के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है (चरण 6.1 देखें)। प्रोटोकॉल को ध्यान से पढ़ें और ऐसी परेशानियों से बचने के लिए सभी सावधानियां बरतें।
प्रयोगशाला में GAAsP डिटेक्टरों के साथ दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के वर्तमान सेटअप के साथ भी, कॉर्टेक्स के माध्यम से पृष्ठीय CA1 को चित्रित करने के प्रयास के परिणामस्वरूप प्रकाश के गैर-नगण्य प्रकीर्णन के कारण संकल्प का महत्वपूर्ण नुकसान होता है। इसलिए, माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के आंदोलन या सीए 1 में न्यूरॉन्स के डेंड्राइटिक स्पाइन के गठन का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्राप्त करने के लिए, वर्तमान विधि की तरह ओवरलाइंग कॉर्टेक्स के एक हिस्से को हटाना अपरिहार्य है। उच्च छवि रिज़ॉल्यूशन बनाए रखते हुए कॉर्टिकल हटाने की सीमा को कम करने का एकमात्र वैकल्पिक तरीका रिले लेंस को एम्बेड करना है, जैसे कि ग्रेडिएंट अपवर्तक सूचकांक (ग्रिन) लेंस। इस दृष्टिकोण में, क्रोनिक सीए 1 इमेजिंग28,29 के लिए सीए 1 के ऊपर सीधे प्रत्यारोपित एक गाइड ट्यूब के अंदर एक जीआरआईएन लेंस रखा गया है। गाइड ट्यूब का बाहरी व्यास 1.8 मिमी था, जो इस पेपर में डिवाइस के 3.0 मिमी से छोटा है, जबकि उच्च रिज़ॉल्यूशन (एनए; 0.82) का उत्पादन यहां सिस्टम (प्रभावी एनए; 0.88) के बराबर है। हालांकि, एक ग्रिन लेंस का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन के लिए दृश्य का एक संकीर्ण क्षेत्र है और ग्रिन लेंस के डब्ल्यूडी द्वारा सीमित एक छोटी इमेजिंग गहराई है। इसलिए, उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ दृश्य के एक विस्तृत क्षेत्र में सभी हिप्पोकैम्पल परतों की इमेजिंग इस पेपर में विधि का एक विशिष्ट लाभ है।
इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि कॉर्टेक्स और सूजन को आंशिक रूप से हटाने से हिप्पोकैम्पस पर कुछ हानिकारक प्रभाव पड़ सकते हैं। हालांकि, क्योंकि हटाए गए कॉर्टेक्स का हिप्पोकैम्पस के लिए कोई प्रत्यक्ष इनपुट नहीं है, एंटोरिनल कॉर्टेक्स क्षतिग्रस्त नहीं है, और हिप्पोकैम्पस स्वयं सीधे घायल नहीं होता है, समग्र मूल्यांकन यह है कि हिप्पोकैम्पस की कार्यात्मक हानि महत्वपूर्ण नहीं है। पिछले कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि हिप्पोकैम्पल विंडो प्रत्यारोपण 25,26,27,30,31,32,33,34 के बाद सीखने और स्मृति सहित हिप्पोकैम्पल कार्य संरक्षित हैं। इसलिए, यहां वर्णित इमेजिंग दृष्टिकोण से पर्याप्त पोस्टऑपरेटिव अवधि के बाद हिप्पोकैम्पल कार्यों की ईमानदारी से रिपोर्ट करने की उम्मीद है।
इस इमेजिंग तकनीक के आधार पर अनुसंधान विषयों की भविष्य की दिशाओं में माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स5 की एक साथ इमेजिंग द्वारा पता लगाया गया सिनैप्टिक प्रूनिंग, सिनैप्स35 के साथ सीखने से संबंधित माइक्रोग्लियल इंटरैक्शन, हिप्पोकैम्पल तंत्रिका गतिविधि36 द्वारा विनियमित माइक्रोग्लियल गतिशीलता और परिधीय सूजन या ऊतक क्षति के लिए माइक्रोग्लियल प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकतीहैं।. यह विधि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्रगति को स्पष्ट करने में भी मदद करेगी। उदाहरण के लिए, अल्जाइमर रोग (एडी) में, अमाइलॉइड β और ताऊ प्रोटीन न्यूरोनल सेल मौतों और हिप्पोकैम्पल शोष के समानांतर जमा होते हैं, जिससे संज्ञानात्मक शिथिलता होती है; माइक्रोग्लिया को इस प्रक्रिया में शामिल होने की सूचना मिली है37,38. एडी माउस मॉडल का उपयोग करके माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स की विवो क्रोनिक इमेजिंग में हमें एडी माउस मॉडल के हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लियल कार्यों और न्यूरोनल पैथोलॉजी के बीच सहसंबंध की निगरानी करने में सक्षम करेगा।
यह पेपर माइक्रोग्लियल इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन सीए 1 में अन्य न्यूरोनल और ग्लियल सेल प्रकारों पर एक ही इमेजिंग प्रक्रिया लागू होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों की इमेजिंग तक सीमित है, लेकिन तकनीक को जागृत चूहों में हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया की निगरानी के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। श्वसन, दिल की धड़कन और शरीर के आंदोलनों से प्रेरित गति कलाकृतियां, विशेष रूप से कांच की खिड़की से दूर गहरी हिप्पोकैम्पल परतों में, जागृत चूहों के साथ प्रयोगों में मौजूद हो सकती हैं। इसलिए, माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता को पकड़ने के लिए एक उपयुक्त गति सुधार प्रणाली की आवश्यकता हो सकती है।
प्रोटोकॉल से संबंधित चर्चा अस्थायी और स्थानिक विशिष्टता के साथ फ्लोरोसेंट जांच की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त आयु और आनुवंशिक संशोधनों के चूहों का चयन करना उचित है (चरण 1.3 देखें)। 1 महीने की उम्र में चूहों का उपयोग प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, लेकिन 2 महीने से अधिक उम्र के चूहों को संभालना आसान होता है, उनके बड़े शरीर के आकार और सर्जिकल तनाव के प्रतिरोध के साथ। इसके अलावा, बाहरी कैप्सूल और हिप्पोकैम्पस के एल्वस को युवा चूहों में अलग करना अधिक कठिन है। इसलिए, युवा चूहों में बाहरी कैप्सूल को हटाने के लिए सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है (चरण 3.4.3-4 देखें)। सर्जरी और बाद की इमेजिंग का आकलन चूहों के साथ अधिक सरल होगा जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सीए 1 और डीजी में समान रूप से व्यक्त करते हैं (चरण 4.7 देखें)। इसलिए, सर्जरी के प्रारंभिक परीक्षणों में, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जैसे कि थाई 1-वाईएफपी या थाई 1-जीएफपी चूहे39, या लेबल माइक्रोग्लिया वाले चूहे, जैसे कि सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहे24।
सफल सर्जरी के लिए, संज्ञाहरण का विकल्प महत्वपूर्ण है (चरण 2.1 देखें)। विभिन्न प्रकार के संज्ञाहरण इंट्राऑपरेटिव मस्तिष्क एडिमा के विभिन्न डिग्री का कारण बन सकते हैं, जो सर्जरी की कठिनाई, प्रत्यारोपित धातु ट्यूब की सापेक्ष स्थिति और ग्लास विंडो द्वारा मस्तिष्क संपीड़न की सीमा को प्रभावित करते हैं। ये कारक सर्जरी के बाद हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के अस्तित्व को भी प्रभावित कर सकते हैं।
हिप्पोकैम्पस को उजागर करने की आकांक्षा प्रक्रिया में (चरण 3.4 देखें), मस्तिष्क को नुकसान को कम करने और सफल इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। कपाल खिड़की के किनारे एक आउटलेट की स्थिति में ऊतक की सतह पर बाँझ खारा लगातार आपूर्ति करें। आकांक्षा के दौरान ऊतक की सतह को हवा के संपर्क से रोकें। ऊतक आकांक्षा का मूल सिद्धांत सक्शन टिप में तरल प्रवाह द्वारा ऊतक की सतह को हटाना है। ऊतक के लिए सक्शन टिप के सीधे संपर्क से बचा जाना चाहिए। सक्शन ट्यूब पर लागू नकारात्मक दबाव को न्यूनतम होने के लिए समायोजित करें। चरण-दर-चरण ऊतक को एस्पिरेट करें और पुष्टि करें कि प्रत्येक चरण में रक्तस्राव नियंत्रित है। जब रक्तस्राव लंबे समय तक होता है, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक रक्तस्राव अनायास बंद न हो जाए। बाँझ लवण के निरंतर प्रवाह के साथ रक्तस्राव वाले स्थान से थोड़ी दूरी से आकांक्षा रखें। ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब में फिट होने वाले अपने आकार के साथ एक बेलनाकार स्थान बनाने के लिए ऊतक को एस्पिरेटेड करें (चरण 1.1 देखें)। मोटे पियाल वाहिकाओं या बड़े ऊतक के टुकड़ों को एस्पिरेट करने के लिए 23 जी सुइयों और छोटे ऊतक मलबे को चूसने के लिए 25 ग्राम सुइयों का चयन करें।

माइक्रोग्लिया मस्तिष्क में रहने वाली एकमात्र प्रतिरक्षा कोशिकाएं और ऊतक मैक्रोफेज हैं। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में उनके कार्यों के अलावा, जैसे कि सूजन के लिए तेजी से प्रतिक्रिया, उन्हें तंत्रिका सर्किट के रखरखाव और रीमॉडेलिंग में विभिन्न प्रकार की शारीरिक भूमिकाएं निभाने के लिए दिखाया गया है, जैसे कि सिनैप्टिक प्रूनिंग, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का विनियमन, और न्यूरोनल गतिविधिका नियंत्रण 1,2,3,4,5 . माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के बीच शारीरिक बातचीत तंत्रिका सर्किट विकास और रोग न्यूरोबायोलॉजी दोनों में बढ़ती रुचि है। विवो में माइक्रोग्लिया के शरीर विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए ऊतक क्षति और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बिना माइक्रोग्लिया का निरीक्षण करने के तरीकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, माइक्रोग्लिया सूजन के प्रति संवेदनशील हैं और ऊतक क्षति 6,7 के जवाब में नाटकीय रूप से अपने आकार और कार्यों को बदलते हैं।
विवो इमेजिंग में दो-फोटॉन माइक्रोग्लिया8 की शारीरिक गतिशीलता को पकड़ने के लिए एक आदर्श उपकरण है। विवो टू-फोटॉन इमेजिंग के प्रारंभिक अनुप्रयोगों ने वयस्क माउस कॉर्टेक्स 9,10 में पर्यावरण निगरानी के लिए माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के गतिशील आंदोलन का खुलासा किया। निम्नलिखित दो-फोटॉन इमेजिंग अध्ययनों ने न्यूरॉन्स 5,11,12,13,14 के साथ कार्यात्मक और संरचनात्मक बातचीत के विश्लेषण के लिए माइक्रोग्लिया की विवो निगरानी को आगे बढ़ाया। हालांकि, पारंपरिक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गहराई मस्तिष्क की सतह 15,16 से1 मिमी से कम तक सीमित है। यह बाधा हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में माइक्रोग्लिया के व्यवहार की रिपोर्ट करने वाले पिछले अध्ययनों की कमी की व्याख्या करती है।
हाल के आरएनए अनुक्रमण अध्ययनों ने माइक्रोग्लिया की काफी क्षेत्रीय विषमता का खुलासा किया है, जिससे अलग-अलग कार्यात्मक भूमिकाओं की संभावना बढ़ गई है 17,18,19,20,21। इसलिए, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स के साथ माइक्रोग्लियल इंटरैक्शन रिकॉर्ड करना आवश्यक है, लेकिन तकनीकी कठिनाइयों ने ऐसे अध्ययनों में बाधा डाली है। विशेष रूप से, सिनैप्स रीमॉडेलिंग में माइक्रोग्लियल सक्रिय भागीदारी को हिप्पोकैम्पल तंत्रिका नेटवर्क और इसके स्मृति से संबंधित कार्योंके विकास में महत्वपूर्ण बताया गया है। हालांकि, विवो में बिना चुनौती वाले हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया को देखने के लिए प्रभावी तरीके उपलब्ध नहीं हैं।
यह प्रोटोकॉल ठीक से नियंत्रित शल्य चिकित्सा तकनीकों का उपयोग करके पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के सीए 1 में माइक्रोग्लिया को आराम देने के क्रोनिक विवो अवलोकन के लिए प्रक्रियाओं की व्याख्या करता है। सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों (सीएक्स 3 सीआर 1 + / जीएफपी) में सीए 1 क्षेत्र की दो-फोटॉन इमेजिंग, जो माइक्रोग्लिया24 में जीएफपी को व्यक्त करती है, ने पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के साथ सीए 1 की सभी परतों में रैमिफाइड माइक्रोग्लिया के अवलोकन को सक्षम किया। प्रोटोकॉल में अवलोकन विंडो और उचित इमेजिंग स्थितियों के सफल आरोपण के लिए कई सुझाव शामिल हैं। इसके अलावा, सीए 1 में पिरामिड न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को एक आवेदन उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस तकनीक के फायदे, सीमाएं और क्षमता पर भी चर्चा की गई है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >23 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-166</td>
			<td >Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-167</td>
			<td>Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3 mm dermal punches (DermaPunch)</td>
			<td >Maruho</td>
			<td >213001610</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 G needles</td>
			<td >Dentronics</td>
			<td >Disposable needle No. 30</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A femtosecond pulsed laser</td>
			<td >Spectra-Physics</td>
			<td >MaiTai Deep See</td>
			<td>A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A two-photon microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >A1R MP+</td>
			<td >Microscope for the CA1 imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-hSyn-Cre</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >An objective lens for two-photon imaging</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >XLPLN25XSVMP</td>
			<td>25&#215; objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aspirators</td>
			<td >Shin-ei Industries</td>
			<td >KS-500</td>
			<td>Tools for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum plates</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >CP-1</td>
			<td>Plates made of alminum for head fixation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemical depilatory cream</td>
			<td >YANAGIYA</td>
			<td ></td>
			<td>Cream for hair removal around the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circular glass coverslips</td>
			<td >Matsunami Glass</td>
			<td >3&#966; No.1</td>
			<td>Coverslips bonded to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CX3CR1-GFP mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >008451</td>
			<td>Transgenic mice for microglial imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cylindrical stainless steel tubes</td>
			<td >MORISHITA</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental etching material</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610461</td>
			<td>Used to etch the skull bones.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental resin cement (Super-Bond C&#38;B)</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610555</td>
			<td>Dental cement.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dura pickers (Micro Points)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >10063-15</td>
			<td>Tools for dura removal.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >PRI13-3374</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head holding device</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >MAG-2</td>
			<td>The head holding device of mice with angle adjusters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >BWT-100A and HB-10</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >ALA Scientific</td>
			<td >HEATINGPAD-1 and Hot-1</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine (Ketalar)</td>
			<td >Daiichi Sankyo Company</td>
			<td >S9-001665</td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam</td>
			<td >Tokyo Chemical Industry</td>
			<td >M1959</td>
			<td>Analgesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ophthalmic ointment</td>
			<td >Sato Pharmaceutical</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prevent eye dryness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-iodine scrub solution</td>
			<td >Meiji Seika Pharma</td>
			<td >2612701Q1137</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-tipped miniature knives</td>
			<td >Surgistar</td>
			<td >4769</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td >MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td>
			<td >450-098-67</td>
			<td>Disposable surgical tool.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo microscopes</td>
			<td >Leica Microsystems</td>
			<td >S8 APO</td>
			<td>Microscopes for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td >Otsuka Pharmaceutical Factory</td>
			<td >3311401A2026</td>
			<td>Washing solution during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile waterproof pad</td>
			<td >AS ONE</td>
			<td >8-5945-01</td>
			<td>Surgical platform.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulforhodamine 101</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S7635</td>
			<td>A dye for in vivo vessel imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical drape</td>
			<td >Medline Industries</td>
			<td >MP-0606F6T</td>
			<td>Perforated drape for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Toshiba</td>
			<td >GL15</td>
			<td>Used to cure the adhesives.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-curing optical adhesives</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >NOA81</td>
			<td>Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine (Celactal 2%)</td>
			<td >Bayer</td>
			<td ></td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में रहने वाली एकमात्र प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनैप्स और न्यूरोनल उत्तेजना को संशोधित करके तंत्रिका सर्किट रखरखाव में सक्रिय रूप से भाग लेती हैं। हाल के अध्ययनों ने विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में माइक्रोग्लिया की अंतर जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक विषमता का खुलासा किया है। सीखने और स्मृति में हिप्पोकैम्पल तंत्रिका नेटवर्क के अद्वितीय कार्य सिनैप्स रीमॉडेलिंग में माइक्रोग्लिया की सक्रिय भूमिकाओं से जुड़े हो सकते हैं। हालांकि, सर्जिकल प्रक्रियाओं से प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रियाएं हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया के दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण में समस्याग्रस्त रही हैं। यहां, एक विधि प्रस्तुत की गई है जो एक इमेजिंग विंडो के माध्यम से हिप्पोकैम्पल सीए 1 की सभी परतों में माइक्रोग्लिया के पुराने अवलोकन को सक्षम बनाती है। यह विधि 1 महीने से अधिक समय तक माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं में रूपात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है। आराम करने वाले माइक्रोग्लिया की दीर्घकालिक और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल प्रक्रियाओं, उचित उद्देश्य लेंस चयन और अनुकूलित इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है। हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया की क्षणिक भड़काऊ प्रतिक्रिया सर्जरी के तुरंत बाद इमेजिंग को रोक सकती है, लेकिन माइक्रोग्लिया कुछ हफ्तों के भीतर अपनी क्वीसेंट आकृति विज्ञान को बहाल करती है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया के साथ एक साथ इमेजिंग न्यूरॉन्स हमें हिप्पोकैम्पस में कई सेल प्रकारों की बातचीत का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। यह तकनीक हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लियल फ़ंक्शन के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकती है।

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In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

यह पेपर सटीक रूप से नियंत्रित सर्जरी और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माउस हिप्पोकैम्पल सीए 1 में आराम करने वाले माइक्रोग्लिया के क्रोनिक इन विवो अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Vivo में माउस हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की क्रोनिक टू-फोटॉन इमेजिंग

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की भूमिका अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। यह प्रोटोकॉल सीधे छवि बना सकता है कि माइक्रोग्लिया न्यूरॉन्स से कैसे संपर्क और विनियमन करता है। हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स को आराम देने की विवो इमेजिंग बहुत मुश्किल रही है।यह विधि इस समस्या को हल कर सकती है। अवलोकन खिड़की को प्रत्यारोपित करने के लिए, एक त्वचीय पंच का उपयोग करके खोपड़ी पर तीन मिलीमीटर गोलाकार नाली बनाएं, जो पहले चिह्नित क्षेत्र के साथ नाली के संरेखण को सुनिश्चित करता है। जब त्वचीय पंच अंतर्निहित ड्यूरा को छूने से पहले क्रैनियम की सबसे भीतरी परत तक पहुंच जाता है, तो 30 गेज सुई का उपयोग करके केंद्रीय हड्डी द्वीप को धीरे से उठाएं।इसके बाद, ड्यूरा पिकर का उपयोग करके ड्यूरा को सावधानीपूर्वक हटा दें। सतह से पिया, पियाल वाहिकाओं और कॉर्टिकल ऊतक को एस्पिरेट करें। पूरे कपाल खिड़की पर उजागर ऊतक की सतह की गहराई को सजातीय रखें और धीरे-धीरे आकांक्षा को गहरा करें जब तक कि बाहरी कैप्सूल के फाइबर उजागर न हों।कपाल खिड़की के रोस्ट्रोलेटरल छोर पर पार्श्व वेंट्रिकल के पास बाहरी कैप्सूल के लिए सक्शन टिप को रखने के बाद, कोडोमेडियल में चलने वाले बाहरी कैप्सूल की सतह की परत को रोस्ट्रोलेटरल दिशा में हटा दें। फिर मेडियोलेटरल दिशा में चल रही आंतरिक परत को हटा दें। एल्वस की सतह और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पल कमिसर के पूर्ण जोखिम की जांच करके पूरे बाहरी कैप्सूल को हटाने की पुष्टि करें।यह सुनिश्चित करने के बाद कि रक्तस्राव पूरी तरह से बंद हो गया है, खोपड़ी की सतह के स्तर तक बाँझ खारा के साथ छेद भरें। इसके बाद, कांच के निचले धातु ट्यूब को छेद में लंबवत रूप से डालें, जब तक कि ट्यूब के किनारों से बहने वाले अतिरिक्त पानी को तब तक दबाएं जब तक कि कांच का तल हल्के से एल्वस के खिलाफ दबा न जाए और आंशिक रूप से अंतर्निहित सीए 1 को समतल न कर दे। दंत राल सीमेंट का उपयोग करके, आसपास की खोपड़ी में डाली गई ट्यूब की दीवार को ठीक करें।दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के तहत और मोटराइज्ड एक्सवाई स्कैनिंग स्टेज पर हेड होल्डिंग डिवाइस में माउस सेट करें। फिर हवा के बुलबुले बनाए बिना ग्लास बॉटम और ऑब्जेक्टिव लेंस के बीच की जगह को पानी से भरें। स्पंदित लेजर द्वारा निरंतर रोशनी के तहत मस्तिष्क पैरेन्काइमा से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति और धातु ट्यूब के किनारे से परावर्तित प्रकाश के मार्गदर्शन के साथ सीए 1 पर ध्यान केंद्रित करें।हेड होल्डिंग डिवाइस को झुकाकर माउस हेड के कोण को समायोजित करें ताकि ग्लास बॉटम इमेजिंग प्लेन के समानांतर हो। फिर सीए 1 में लक्ष्य संरचना की गहराई पर उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के उद्देश्य के सुधार कॉलर को समायोजित करें। इसके बाद, पुष्टि करें कि ग्लास तल से 500 माइक्रोमीटर की गहराई पर डेंटेट गाइरस या डीजी की आणविक परत में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को पूरे क्षेत्र में चित्रित किया गया है।केवल एक सफल सर्जरी के मामले में, डीजी सिग्नल का तुरंत पता लगाया जा सकता है। कई हफ्तों के लिए व्यक्तिगत आवास में पोस्टऑपरेटिव माउस उठाएं। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत एनेस्थेटाइज्ड माउस सेट करें।हिप्पोकैम्पस की इमेजिंग करें। पुष्टि करें कि पोस्टऑपरेटिव एडिमा में कमी के बाद कैप्चर की गई छवियों की गुणवत्ता और तीव्रता सर्जरी के दिन कैप्चर की गई छवियों से बेहतर या तुलनीय है या नहीं। सुनिश्चित करें कि माइक्रोग्लिया ने अपनी रामीकृत आकृति विज्ञान को पुनर्प्राप्त कर लिया है।फिर सीए 1 में रुचि की परत पर विवो इमेजिंग में प्रदर्शन करें। सर्जरी के तुरंत बाद पकड़े गए सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों में माइक्रोग्लिया ने कोई प्रमुख सक्रियण नहीं दिखाया। एडिमा के प्रेरण के बिना सफल सर्जरी के बाद, दो-फोटॉन इमेजिंग गहराई पूरे सीए 1 परतों को पार कर गई और सर्जिकल सतह से 500 माइक्रोमीटर तक पहुंच गई।सर्जरी के बाद तीन सप्ताह से अधिक के पुराने चरण में माइक्रोग्लिया ने कम एडिमा और सूजन के कारण उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता और रिज़ॉल्यूशन और अधिक समरूप वितरण का प्रदर्शन किया। सभी परतों में माइक्रोग्लिया ने पहले से ही अपनी रामीकृत आकृति विज्ञान को बहाल कर दिया है और स्थिर सेल निकायों और अत्यधिक मोडल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया है। पूरे सीए 1 पर उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां कई महीनों तक प्रदान की गई थीं।फ्लोरोसेंट माइक्रोग्लिया से संकेत हिप्पोकैम्पल परतों की पहचान करने में मदद करते हैं। एल्वस में माइक्रोग्लिया में लम्बी कोशिका निकाय और प्रक्रियाएं थीं जो अक्षीय ट्रैक्ट के साथ फैली हुई थीं। स्ट्रेटम पिरामिड में माइक्रोग्लिया को उनकी प्रक्रियाओं के कम घनत्व से अलग किया जा सकता है।सीए 1 और डीजी के बीच की सीमा को सीमा के साथ चलने वाली मोटी रक्त वाहिकाओं द्वारा पहचाना जा सकता है, जिसे सल्फोरोडामाइन 101 के साथ वाहिकाओं को लेबल करके बेहतर पहचाना गया था। एक आवेदन उदाहरण के रूप में, जीएफपी पॉजिटिव माइक्रोग्लिया और टीडीटोमेटो लेबल पिरामिड न्यूरॉन्स को एक साथ चित्रित किया गया था। न्यूरोनल लेबलिंग ने सीए 1 की सटीक परत संरचनाओं को समझने में मदद की।सबसे महत्वपूर्ण बिंदु सर्जरी क्षति को कम करना है। आकांक्षा से ऊतक क्षति से बचें। कांच के तल को डालते समय कोमल दबाव लागू करें और दंत सीमेंट को मस्तिष्क की सतह को छूने से बचें।यह दृष्टिकोण हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की भूमिका की पहचान करने में मदद करेगा। उदाहरण के लिए, माइक्रोग्लिया न्यूरॉन्स के साथ कैसे बातचीत करते हैं, वे सीखने में कैसे शामिल होते हैं, और वे मस्तिष्क रोगों को कैसे नियंत्रित करते हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

जीर्ण दो photon के लिए एक पतली खोपड़ी विंडो तकनीक Vivo में Murine microglia Neuroinflammation के मॉडल में इमेजिंग

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

माउस रीढ़ की हड्डी दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग गर्भनाल के vivo इमेजिंग में

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo में दो photon इमेजिंग cortical न्यूरॉन्स में अनुभव पर निर्भर आणविक परिवर्तन

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

त्वचा में एकल तंत्रिका अंत के vivo दो photon माइक्रोस्कोपी में

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

दो photon<em&gt; में विवो</em&gt; एक पतला खोपड़ी तैयारी का उपयोग माउस प्रांतस्था में वृक्ष के समान spines के इमेजिंग

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

माउस रीढ़ की हड्डी में सेलुलर गतिशीलता के दो photon इमेजिंग

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

एक साथ दो-फोटान<em&gt; Vivo</em&gt; माउस Retrosplenial कोर्टेक्स में अन्तर्ग्रथनी आदानों की इमेजिंग और postsynaptic लक्ष्य

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉनल Dendrites में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

वीवो में नवजात चूहों में Cortical न्यूरॉन्स की दो-फोटॉन इमेजिंग

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

माउस रेटिना के विवो इमेजिंग में ट्रांसप्युपिलरी टू-फोटॉन

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...