Name: in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

Vi vil gjerne takke M. Kondo og M. Matsuzaki for å låne oss XLPLN25XSVMP objektivlinsen. Dette arbeidet ble økonomisk støttet fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) av Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 til RK) og Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til SO), fra Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til SO), og fra Japan Science and Technology Agency av Moonshot R &D (JPMJMS2024 til HM).

Alle dyreforsøk ble godkjent og utført i henhold til retningslinjene til Animal Ethics Committee og Genetic Recombinant Experiment Safety Committee ved University of Tokyo. Både mannlige og kvinnelige CX3CR1-GFP-mus, i alderen 2-4 måneder, ble brukt i forsøkene. For eksperimentenes sikkerhet og vedlikehold av sterile forhold ble alle prosedyrene utført med hvite frakker, masker og sterile hansker. Alle instrumenter ble sterilisert før bruk.
1. Klargjøring av instrumenter og dyr
<ol><li>Monter et metallrør med glassbunn (figur 1A).<ol><li>Påfør en liten dråpe UV-herdende optisk lim på den ene enden av et skreddersydd rustfritt rør (ytre diameter 3,0 mm, indre diameter 2,8 mm, høyde 1,7 mm). Spred limet på den sirkulære kanten av røret jevnt. MERK: En tilstrekkelig mengde lim skal brukes til å dekke hele kanten av røret.</li>
		<li>Plasser et sirkulært glassdeksel (3,0 mm diameter, 0,15 ± 0,02 mm tykkelse) til den limbelagte enden av metallrøret, og trykk dekselet lett mot røret slik at gapet mellom røret og glasset fylles med limet. Deretter justerer du glassets posisjon slik at den passer innenfor metallrørets ytre kant.</li>
		<li>Bestråle glasset med UV-lys i tilstrekkelig tid til å herde limet. MERK: Forsikre deg om at glasset og røret er helt festet. Hvis vedheftet er utilstrekkelig, kan glasset løsne etter operasjonen, noe som resulterer i mislykket avbildning eller lekkasje av cerebrospinalvæske (CSF).</li>
		<li>Desinfiser det monterte glassbunnmetallrøret med 70% etanol og vask med sterilt saltvann for å fjerne rusk.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliser alle kirurgiske instrumenter med en tørr varmesterilisator.</li>
	<li>Forbered mus for kirurgi av vindusimplantasjon. MERK: Mus bør være av passende alder. Det er å foretrekke at de er genetisk konstruert for å uttrykke fluorescerende proteiner i CA1 og dentate gyrus (DG). Disse punktene er nærmere forklart i diskusjonsdelen.</li>
</ol>2. Anestesi og hodefiksering
<ol><li>Bedøv en mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin). Administrer meloksikam (2 mg/kg) ved subkutan injeksjon ved preoperativ analgesi. Bekreft forsvinningen av responsen på smertefulle stimuli, for eksempel hale klemming for å sikre tilstrekkelig dybde av anestesi. Legg til en halv dose ketamin-xylazin hver gang anestesien slites av under operasjonen, vanligvis 1 time etter den første administrasjonen og deretter hvert 30. minutt. Bruk en varmepute under kroppen for å gi termisk støtte og bruk oftalmisk salve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi. MERK: Valget av anestesi for kirurgi er viktig. Dette punktet er diskutert i detalj i diskusjonsdelen.</li>
	<li>Påfør hårfjerningskrem for å fjerne hår fra hodebunnen. Desinfiser hodebunnen flere ganger i en sirkulær bevegelse med povidon-jodskrubb etterfulgt av alkohol. Plasser musen på den kirurgiske plattformen forberedt med en steril vanntett pute og bruk sterile gardiner for å sikre operasjonsstedet. Deretter kutter og fjerner du hodebunnen sirkulært med en skalpell slik at parietal- og oksipitalbenene er fullt eksponert på operativ side.</li>
	<li>Fjern det subkutane bindevevet ved å gni det med en bomullspinne mens du påfører steril saltoppløsning for å fjerne blødningen. Skrap forsiktig kranialoverflaten med en rundtippet miniatyrkniv for å fjerne periosteum, noe som bidrar til å styrke adhesjonen mellom sement og bein (se trinn 2.6).</li>
	<li>Påfør tannetsemateriale på hele overflaten, vent i titalls sekunder og skyll med tilstrekkelig sterilt saltvann.</li>
	<li>Bruk vanntett blekk til å merke området av beinet som skal fjernes (et sirkulært område med en diameter på 3,0 mm, sentrert ca. 2,5 mm bakre og 2,5 mm lateralt til bregma). Etter markering, tørk skalleoverflaten grundig. MERK: Plasseringen av kraniotomi avhenger av størrelsen på hippocampus og bør optimaliseres for ulike aldre. Nyttige indikatorer for kraniotomiens posisjon vil bli presentert nedenfor (se trinn 3.4.5, MERK).</li>
	<li>Fest den rektangulære aluminiumsplaten med en tykkelse på 1,0 mm og med et hull på 5,0 mm i midten til skallen ved hjelp av tannharpiks sement i henhold til produsentens instruksjoner.<ol><li>Juster hullet på midten av platen forsiktig med det sirkulære området merket med en penn (se trinn 2.5) slik at aluminiumsplaten er parallell med den markerte overflaten av skallen (figur 1B). Sørg for at sementen tett forsegler alle hull mellom platen og beinet. Vent i ca. 5 minutter til sementen er tilstrekkelig herdet.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasser musen på hodeholdingsenheten med vinkeljusterere via den vedlagte platen.</li>
</ol>3. Implantasjon av observasjonsvinduet
MERK: Følgende kirurgiske prosedyrer skal utføres under et stereomikroskop.
<ol><li>Lag et sirkulært spor på skallen ved hjelp av en dermal stans med en diameter på 3,0 mm. Juster den sirkulære rillen og området merket med en penn i trinn 2.5. Vri dermal punch med forsiktig trykk slik at spordybden gradvis øker. Kontroller ofte at spordybden er konstant over hele omkretsen.</li>
	<li>Når den dermale stansen når det innerste laget av kraniet, før den berører den underliggende duraen, løft forsiktig den sentrale benøya med en 30 G nål. MERK: Lett væskelekkasje fra bunnen av sporet indikerer at sporet er nær duraen.</li>
	<li>Fjern dura ved hjelp av en dura picker. MERK: Fullstendig fjerning av dura i kranialvinduet er nødvendig og vil kreve forsiktig reseksjon av gjenværende dura i periferien ved hjelp av fine tang.</li>
	<li>Aspirer vevet forsiktig for å eksponere hippocampusens alveus med 23 G eller 25 G butte nåler koblet til aspiratoren. MERK: Dette trinnet er det mest kritiske for vellykket bildebehandling. Viktige tekniske punkter for vevsaspirasjon er beskrevet i detalj i diskusjonsdelen.<ol><li>Aspirer pia og pialfartøyene.</li>
		<li>Aspirer det kortikale vevet fra overflaten. Hold dybden av eksponert vevsoverflate homogen over hele kranialvinduet. Utdyp aspirasjonen gradvis til fibrene i den eksterne kapselen blir eksponert.</li>
		<li>Plasser sugespissen forsiktig på den eksterne kapselen nær lateral ventrikkel (LV) som ligger i den rostrolaterale enden av kranialvinduet. Fjern overflatelaget av den eksterne kapselen som går i kaudomedial til rostrolateral retning, og deretter det indre laget som går i mediolateral retning. MERK: Den eksterne kapselen nær LV kan enkelt fjernes fra den underliggende strukturen.</li>
		<li>Bekreft fjerning av hele den eksterne kapselen ved å kontrollere full eksponering av overflaten av alveus og dorsal hippocampus commissure (DHC). MERK: DHC dekker den caudomedial delen av CA1. Alveus og DHC kan skilles fra den eksterne kapselen ved deres fiberorientering. Fibrene i alveus og DHC løper nemlig i rostromedial til kaudolateral retning, og kan skilles fra fibrene i den eksterne kapselen. Alveus og DHC er tett festet til CA1 og bør ikke bli skadet. Alle fragmenter av den eksterne kapselen skal fjernes, siden eventuelle gjenværende fragmenter vil forhindre direkte kontakt av glassdekselet til alveus.</li>
		<li>Bekreft at blødningen har stoppet grundig og fyll hullet med steril saltoppløsning til nivået på skalleoverflaten. MERK: Synsfeltet her bidrar til å bedømme om hullet er i riktig posisjon for musens spesifikke alder. Ideelt sett bør alveus og den underliggende CA1 okkupere det meste av det sentrale området. En del av DHC er synlig i kaudomedialområdet. Åpningen av LV kan påvises ved den rostrolaterale kanten (figur 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Sett glassbunnmetallrøret (se trinn 1.1) vertikalt inn i hullet mens du aspirerer overflødig vann som renner over fra sidene av røret til glassbunnen presser lett mot alveus og delvis flater ut den underliggende CA1. MERK: Dette trykket må justeres på riktig måte. Hvis den er for sterk, vil CA1 bli skadet. Hvis den er for svak, vil den sfæriske aberrasjonen på grunn av krumningen til CA1 svekke bildeoppløsningen i dype strukturer.</li>
	<li>Bruk tannharpiks sement, fest veggen av det innsatte røret til den omkringliggende skallen (figur 1C). Forsikre deg om at hele omkretsen er tett forseglet og at det ikke er lekkasje av luft eller CSF. Vent i ca 5 min til sementen stivner. MERK: Hvis sementen er plassert når viskositeten er lav, kan den lekke inn i hjerneparenkymet gjennom gapet mellom røret og skallen og skade hjernen. Derfor bør sementen påføres etter polymerisasjonsinitiering, noe som øker viskositeten og reduserer lekkasje gjennom gapet.</li>
	<li>Vask hele platen, skallen og innsiden av røret med steril saltoppløsning for å fjerne rusk.</li>
</ol>4. To-foton mikroskopi umiddelbart etter operasjon for kvalitetskontroll av operasjonen
<ol><li>Sett musen i hodeholdingsenheten under objektivlinsen til to-fotonmikroskopet og på motorisert XY-skanningstrinn. Bruk en varmepute for termisk støtte. Overvåk og juster anestesidybden som beskrevet i trinn 2.1, da denne kvalitetskontrollen kan ta opptil 30 minutter. MERK: Objektivlinsen for vannfordypning med arbeidsavstand (WD) lengre enn 3 mm og høy numerisk blenderåpning (NA) anbefales. En korreksjonskrage på objektivlinsen kan forbedre oppløsningen ved å kompensere for brytningsindeksens misforhold mellom glasset og biomaterialene.</li>
	<li>Fyll mellomrommet mellom glasset og objektivlinsen med vann, og vær spesielt forsiktig for å unngå luftbobler. Utvid om nødvendig området på metallplaten ved hjelp av en plastfilm, som holder mer vann, for å dekke hele frontlinsen på objektivet.</li>
	<li>Slå på en femtosekund pulserende laser på 920 nm bølgelengde for eksitering av fluorescerende prober uttrykt i hjernen og start bildeinnsamlingsprogramvare.</li>
	<li>Juster fokuset til CA1 ved bruk av det motoriserte trinnet og det motoriserte fokussystemet. Plasser målstrukturen med veiledning av fluorescensen som sendes ut fra hjerneparenkymet og det reflekterte lyset fra kanten av metallrøret under kontinuerlig belysning av den pulserende laseren.</li>
	<li>Mål dybden av hjerneparenkymet som berører glassbunnen ved å justere fokuset med det motoriserte fokussystemet. Sammenlign dybdene på forskjellige horisontale steder for å bedømme justeringen av glassbunnen og bildeplanet.<ol><li>Juster vinkelen på musehodet ved å vippe hodeholdeenheten til glassbunnen er satt til å være parallell med bildeplanet.</li>
	</ol></li>
	<li>Juster korreksjonskragen til målet for å oppnå den høyeste oppløsningen på dybden av målstrukturen i CA1.</li>
	<li>Bekreft at fluorescerende celler i molekyllaget (ML) av DGs øvre blad på en dybde på 500 μm fra glassbunnen kan avbildes i hele synsfeltet. MERK: Dette trinnet er viktig for å bedømme kvaliteten på operasjonen. Hvis CA1 er skadet, forhindrer fokal hjerneødem fluorescensdeteksjon på en dybde på mer enn 200 μm fra overflaten. Først når det ikke er noen skade på CA1, og krumningen av CA1-lagene er riktig flatt av den overliggende dekselet, kan DG-signalene detekteres umiddelbart etter operasjonen (figur 2A-D). Delen Representative resultater gir en enkel måte å bestemme grensen mellom CA1 og DG.</li>
</ol>5. Postoperativ behandling
<ol><li>Aspirer vannet inne i røret og dekk det med en plastforsegling for å forhindre at rusk kommer inn.</li>
	<li>Hold musen varm og vent på utvinning fra anestesi.</li>
	<li>Administrer meloksikam (2 mg/kg) subkutant hver 24. time så lenge musen utviser smerterelatert atferd.</li>
	<li>Løft den postoperative musen i individuelle boliger i flere uker.</li>
</ol>6. In vivo kronisk to-foton avbildning av mikroglia ved bruk av CX3CR1-GFP-mus
<ol><li>Etter induksjon av anestesi, vask innsiden av metallrøret med steril saltoppløsning for å fjerne rusk. Sørg for at hippocampuss hvite alveus er synlig gjennom glasset (figur 3A), og det er ingen komplikasjoner som postoperativ blødning.</li>
	<li>Sett musen under to-foton mikroskopet følger trinn 4.1 til 4.6.</li>
	<li>Kontroller kvaliteten og intensiteten til bilder oppnådd ved to-foton eksitering av hippocampus (figur 3B). Sørg for at bildene tatt etter reduksjon av postoperativt ødem er sammenlignbare med eller bedre enn de som er tatt på operasjonsdagen (figur 2A, se trinn 4.5). MERK: Bildeforringelse indikerer tilstedeværelse av vevskader i hjernen.</li>
	<li>Sørg for at mikroglia allerede har gjenopprettet sin forgrenede morfologi (figur 3C). MERK: Bildedataene for mikroglia indikerer at det kreves minst 3-4 uker for at mikroglia skal gå tilbake til basal tilstand.</li>
	<li>Utfør in vivo-avbildning i et hvilket som helst lag av CA1 for det spesielle formålet med eksperimentet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+disease.">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity.">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum.">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).</li><li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines.">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo.">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).</li><li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex.">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540 (2016).</li><li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization.">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).</li><li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits.">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures.">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li><li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia.">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li><li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity.">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li><li>B&#246;ttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution.">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination.">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity.">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer's+disease+model.">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties.">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1.">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning.">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li><li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus.">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li><li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability.">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li><li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li></ol>

Ingen av forfatterne har interessekonflikter.

Denne metoden inneholder detaljerte kirurgiske prosedyrer, men den kan gi høyoppløselige bilder over hele CA1 i en lengre periode hvis den tilberedes riktig. Eksperimenter med flere mus bekreftet at bildekvaliteten i kronisk postoperativ fase er bedre enn for akutt postoperativ avbildning. Den bedre bildekvaliteten ble opprettholdt i mer enn 2 måneder. Den vanligste årsaken til svikt er utilsiktet skade på CA1 under operasjonen, som er identifisert i den postoperative kvalitetskontrollen (se trinn 4). Dette kan skyldes direkte skade ved aspirasjon, tørking av hjernen, overdreven trykk på glasset eller toksisitet fra tannsementen i det siste trinnet. En annen årsak til svikt er postoperativ blødning, som kan bekreftes gjennom glassbunnvinduet innen 1 uke etter operasjonen (se trinn 6.1). Les protokollen nøye og ta alle forholdsregler for å unngå slike problemer.
Selv med det nåværende oppsettet av to-foton mikroskop med GaAsP-detektorer i laboratoriet, resulterer forsøket på å avbilde den dorsale CA1 gjennom cortex i et betydelig tap av oppløsning på grunn av ikke-ubetydelig spredning av lys. Derfor, for å oppnå tilstrekkelig oppløsning for å observere bevegelsen av mikroglialprosesser eller dannelsen av dendritiske spines av nevroner i CA1, er det uunngåelig å fjerne en del av den overliggende cortexen, som i denne metoden. Den eneste alternative måten å redusere omfanget av kortikal fjerning samtidig som du opprettholder høy bildeoppløsning, er å legge inn et reléobjektiv, for eksempel et GRIN-objektiv (gradient refractive index). I denne tilnærmingen har en GRIN-linse blitt plassert inne i et styrerør implantert rett over CA1 for kronisk CA1-avbildning28,29. Den ytre diameteren på styrerøret var 1,8 mm, som er mindre enn 3,0 mm av enheten i dette papiret, samtidig som den produserte høy oppløsning (NA; 0,82) sammenlignbar med systemet her (effektiv NA; 0,88). Imidlertid har tilnærmingen med et GRIN-objektiv et smalt synsfelt for høyoppløselig observasjon og en kort bildedybde begrenset av GRIN-objektivets WD. Derfor er avbildning av alle hippocampus-lag i et bredt synsfelt med høy oppløsning en spesifikk fordel ved metoden i dette papiret.
En begrensning av denne prosedyren er at delvis fjerning av cortex og betennelse kan ha noen skadelige effekter på hippocampus. Men fordi den fjernede cortex ikke har direkte inngang til hippocampus, entorhinal cortex ikke er skadet, og hippocampus i seg selv ikke er direkte skadet, er den samlede vurderingen at funksjonsnedsettelsen i hippocampus ikke er signifikant. Flere tidligere studier har bekreftet at hippocampus-funksjoner, inkludert læring og hukommelse, er bevart etter hippocampus-vindusimplantasjon 25,26,27,30,31,32,33,34. Derfor forventes bildebehandlingsmetoden beskrevet her å rapportere hippocampusfunksjoner trofast etter en tilstrekkelig postoperativ periode.
Fremtidige retninger av forsøkspersoner basert på denne bildebehandlingsteknikken kan omfatte synaptisk beskjæring oppdaget ved samtidig avbildning av mikroglia og nevroner5, læringsrelatert mikroglial interaksjon med synapser35, mikroglialmotilitet regulert av hippocampus nevral aktivitet36, og mikrogliale responser på perifer betennelse eller vevskader7. Denne metoden vil også bidra til å belyse utviklingen av nevrodegenerative sykdommer. For eksempel, i Alzheimers sykdom (AD), akkumuleres amyloid β og tau-proteiner parallelt med nevroncelledød og hippocampus-atrofi, noe som fører til kognitiv dysfunksjon; Mikroglia har blitt rapportert å være involvert i denne prosessen37,38. In vivo kronisk avbildning av mikroglia og nevroner ved hjelp av AD-musemodellene vil gjøre oss i stand til å overvåke korrelasjonen mellom mikrogliafunksjoner og nevronpatologi i hippocampus i AD-musemodellene.
Denne artikkelen fokuserer på mikrogliaavbildning, men den samme bildebehandlingsprosedyren gjelder for de andre nevron- og gliacelletypene i CA1. I tillegg er protokollen begrenset til avbildning av bedøvede mus, men teknikken kan også utvides til å overvåke hippocampus microglia hos våkne mus. Bevegelsesartefakter indusert av respirasjon, hjerteslag og kroppsbevegelser, spesielt i de dype hippocampuslagene vekk fra glassvinduet, kan eksistere i eksperimenter med våkne mus. Derfor kan det være nødvendig med et passende bevegelseskorreksjonssystem for å fange mikroglialmorfologi og dynamikk.
Diskusjon knyttet til protokollen Det anbefales å velge mus med passende alder og genetiske modifikasjoner for ekspresjon av fluorescerende prober med tidsmessig og romlig spesifisitet (se trinn 1.3). Mus ved 1 måneds alder kan brukes til eksperimenter, men mus eldre enn 2 måneder er lettere å håndtere, med større kroppsstørrelse og motstand mot kirurgisk stress. I tillegg er den eksterne kapselen og alveus i hippocampus vanskeligere å skille hos yngre mus. Derfor krever fjerning av den eksterne kapselen hos unge mus kirurgiske ferdigheter (se trinn 3.4.3-4). Vurdering av operasjonen og påfølgende avbildning vil være enklere med mus som uttrykker fluorescerende proteiner reproduserbart og jevnt i CA1 og DG (se trinn 4.7). Derfor, i de første forsøkene av operasjonen, er det tilrådelig å bruke transgene mus med sparsomt merkede nevroner, for eksempel Thy1-YFP eller Thy1-GFP mus39, eller mus med merket mikroglia, som CX3CR1-GFP mus24.
For vellykket kirurgi er valg av anestesi viktig (se trinn 2.1). Ulike typer anestesi kan forårsake ulike grader av intraoperativt hjerneødem, noe som påvirker operasjonens vanskeligheter, den relative posisjonen til det implanterte metallrøret og omfanget av hjernekompresjon av glassvinduet. Disse faktorene kan også påvirke overlevelsen av hippocampus-nevroner etter operasjonen.
I aspirasjonsprosessen for å eksponere hippocampus (se trinn 3.4), bør følgende punkter noteres for å minimere skaden på hjernen og sikre vellykket avbildning. Tilfør konstant sterilt saltvann på vevsoverflaten ved å plassere et utløp på siden av kranialvinduet. Forhindre at vevsoverflaten blir utsatt for luft under aspirasjon. Det grunnleggende prinsippet for vevsaspirasjon er å fjerne vevsoverflaten ved en væskestrøm inn i sugespissen. Direkte kontakt av sugespissen til vevet bør unngås. Juster det negative trykket på sugerøret til å være minimum. Aspirer vevet trinn for trinn og bekreft at blødningen er kontrollert i hvert trinn. Når blødningen er forlenget, vent til blødningen stopper spontant. Hold aspirasjon fra kort avstand fra blødningsstedet med en konstant strøm av sterilt saltvann. Aspirer vevet for å skape et sylindrisk rom med størrelsen som passer til metallrøret med glassbunn (se trinn 1.1). Velg 23 G nåler for å aspirere tykke pialkar eller store vevsfragmenter og 25 G nåler for å suge småvevsrester.

Mikroglia er de eneste immuncellene og vevsmakrofagene som sitter i hjernen. I tillegg til deres funksjoner som immunceller, som rask respons på betennelse, har de vist seg å spille en rekke fysiologiske roller i vedlikehold og ombygging av nevrale kretser, for eksempel synaptisk beskjæring, regulering av synaptisk plastisitet og kontroll av nevronaktivitet 1,2,3,4,5 . Fysiologiske interaksjoner mellom mikroglia og nevroner er av økende interesse for både nevralkretsutvikling og sykdomsnevrobiologi. Analyse av fysiologien til mikroglia in vivo krever metoder for å observere mikroglia uten vevskader og inflammatoriske responser. Imidlertid er mikroglia følsomme for betennelse og endrer dramatisk form og funksjoner som respons på vevskader 6,7.
To-foton in vivo-avbildning er et ideelt verktøy for å fange den fysiologiske dynamikken til mikroglia8. Innledende anvendelser av in vivo to-foton avbildning avslørte den dynamiske bevegelsen av mikrogliaprosesser for miljøovervåking i den voksne musens cortex 9,10. Følgende to-foton imaging studier utvidet in vivo overvåking av mikroglia ytterligere for analyse av funksjonelle og strukturelle interaksjoner med nevroner 5,11,12,13,14. Imidlertid har bildedybden av konvensjonell to-foton mikroskopi vært begrenset til mindre enn 1 mm fra hjerneoverflaten15,16. Denne begrensningen forklarer mangelen på tidligere studier som rapporterer oppførselen til mikroglia i dype hjernegrupper, som hippocampus.
Nylige RNA-sekvenseringsstudier har avslørt en betydelig regional heterogenitet av mikroglia, noe som øker muligheten for distinkte funksjonelle roller 17,18,19,20,21. Derfor er det nødvendig å registrere mikrogliale interaksjoner med nevroner i forskjellige hjernegrupper, men tekniske vanskeligheter har hindret slike studier. Spesielt har mikroglial aktiv involvering i synapse remodeling blitt rapportert å være kritisk i utviklingen av hippocampus nevrale nettverk og dets minnerelaterte funksjoner22,23. Effektive metoder for å observere uimotsagt hippocampus mikroglia in vivo har imidlertid ikke vært tilgjengelig.
Denne protokollen forklarer prosedyrene for kronisk in vivo observasjon av hvilende mikroglia i CA1 av dorsal hippocampus ved hjelp av nøyaktig kontrollerte kirurgiske teknikker. To-foton avbildning av CA1-området i CX3CR1-GFP-mus (CX3CR1+/GFP), som uttrykker GFP i mikroglia24, muliggjorde observasjon av den forgrenede mikroglia i alle lag av CA1 med tilstrekkelig oppløsning. Protokollen inneholder flere tips for vellykket implantasjon av observasjonsvinduet og passende bildeforhold. I tillegg presenteres samtidig visualisering av pyramidale nevroner og mikroglia i CA1 som et applikasjonseksempel. Fordelene, begrensningene og potensialene til denne teknikken diskuteres også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >23 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-166</td>
			<td >Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-167</td>
			<td>Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3 mm dermal punches (DermaPunch)</td>
			<td >Maruho</td>
			<td >213001610</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 G needles</td>
			<td >Dentronics</td>
			<td >Disposable needle No. 30</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A femtosecond pulsed laser</td>
			<td >Spectra-Physics</td>
			<td >MaiTai Deep See</td>
			<td>A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A two-photon microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >A1R MP+</td>
			<td >Microscope for the CA1 imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-hSyn-Cre</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >An objective lens for two-photon imaging</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >XLPLN25XSVMP</td>
			<td>25&#215; objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aspirators</td>
			<td >Shin-ei Industries</td>
			<td >KS-500</td>
			<td>Tools for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum plates</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >CP-1</td>
			<td>Plates made of alminum for head fixation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemical depilatory cream</td>
			<td >YANAGIYA</td>
			<td ></td>
			<td>Cream for hair removal around the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circular glass coverslips</td>
			<td >Matsunami Glass</td>
			<td >3&#966; No.1</td>
			<td>Coverslips bonded to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CX3CR1-GFP mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >008451</td>
			<td>Transgenic mice for microglial imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cylindrical stainless steel tubes</td>
			<td >MORISHITA</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental etching material</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610461</td>
			<td>Used to etch the skull bones.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental resin cement (Super-Bond C&#38;B)</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610555</td>
			<td>Dental cement.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dura pickers (Micro Points)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >10063-15</td>
			<td>Tools for dura removal.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >PRI13-3374</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head holding device</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >MAG-2</td>
			<td>The head holding device of mice with angle adjusters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >BWT-100A and HB-10</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >ALA Scientific</td>
			<td >HEATINGPAD-1 and Hot-1</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine (Ketalar)</td>
			<td >Daiichi Sankyo Company</td>
			<td >S9-001665</td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam</td>
			<td >Tokyo Chemical Industry</td>
			<td >M1959</td>
			<td>Analgesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ophthalmic ointment</td>
			<td >Sato Pharmaceutical</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prevent eye dryness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-iodine scrub solution</td>
			<td >Meiji Seika Pharma</td>
			<td >2612701Q1137</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-tipped miniature knives</td>
			<td >Surgistar</td>
			<td >4769</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td >MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td>
			<td >450-098-67</td>
			<td>Disposable surgical tool.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo microscopes</td>
			<td >Leica Microsystems</td>
			<td >S8 APO</td>
			<td>Microscopes for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td >Otsuka Pharmaceutical Factory</td>
			<td >3311401A2026</td>
			<td>Washing solution during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile waterproof pad</td>
			<td >AS ONE</td>
			<td >8-5945-01</td>
			<td>Surgical platform.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulforhodamine 101</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S7635</td>
			<td>A dye for in vivo vessel imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical drape</td>
			<td >Medline Industries</td>
			<td >MP-0606F6T</td>
			<td>Perforated drape for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Toshiba</td>
			<td >GL15</td>
			<td>Used to cure the adhesives.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-curing optical adhesives</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >NOA81</td>
			<td>Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine (Celactal 2%)</td>
			<td >Bayer</td>
			<td ></td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus

Mikroglia, de eneste immuncellene som er bosatt i hjernen, deltar aktivt i vedlikehold av nevrale kretser ved å modifisere synapser og neuronal excitability. Nylige studier har avslørt differensialgenuttrykk og funksjonell heterogenitet av mikroglia i forskjellige hjernegrupper. De unike funksjonene til hippocampus nevrale nettverk i læring og minne kan være forbundet med de aktive rollene til mikroglia i synapse remodeling. Imidlertid har inflammatoriske responser indusert av kirurgiske prosedyrer vært problematiske i to-foton mikroskopisk analyse av hippocampus microglia. Her presenteres en metode som muliggjør kronisk observasjon av mikroglia i alle lag av hippocampus CA1 gjennom et bildevindu. Denne metoden tillater analyse av morfologiske endringer i mikroglialprosesser i mer enn 1 måned. Langsiktig og høyoppløselig avbildning av hvilemikroglia krever minimalt invasive kirurgiske prosedyrer, passende objektivt linsevalg og optimaliserte bildebehandlingsteknikker. Den forbigående inflammatoriske responsen av hippocampus microglia kan forhindre avbildning umiddelbart etter operasjonen, men mikroglia gjenoppretter sin hvilende morfologi innen få uker. Videre lar avbildning av nevroner samtidig med mikroglia oss analysere interaksjonene mellom flere celletyper i hippocampus. Denne teknikken kan gi viktig informasjon om mikrogliafunksjonen i hippocampus.

Ved hjelp av denne teknikken kan den ramified og quiescent microglia observeres kronisk innenfor alle lag av dorsal CA1, inkludert stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) og stratum lacunosum-moleculare (SLM), spesielt 3-4 uker etter operasjonen når betennelsen avtar. Hvis operasjonen utføres på riktig måte, kan bildebehandling utføres opptil flere måneder etter operasjonen. Denne delen inneholder tre emner som er nyttige for evaluering av intravital avbildning. Først gis prøvebilder umiddelbart etter operasjonen og i kronisk fase som referanser for passende kirurgiske og bildebehandlingsprosedyrer. For det andre er den distinkte morfologien til mikroglia, deres fluorescensintensitet og blodkarfordeling i spesifikke hippocampuslag beskrevet for å hjelpe leserne til å estimere bildedybden som spenner fra alveus til DG. For det tredje er det gitt et applikasjonseksempel som illustrerer samtidig avbildning av nevroner og mikroglia.
De representative bildene av mikroglia i CX3CR1-GFP-mus umiddelbart etter operasjon er vist i figur 2. Hvis det ikke er noen åpenbar skade på CA1 og krumningen av CA1-lagene er riktig flatt av den overliggende dekkslippen, overskrider to-foton bildedybder av mikroglia hele CA1-lagene og når 500 μm fra den kirurgiske overflaten, hvor ML eller granulatcellelaget (GCL) til DG eksisterer (figur 2A; se trinn 4.7 og figur 4E). Mikroglia er litt mindre ramified, spesielt i laget nær den kirurgiske overflaten i forhold til de i den intakte hippocampus. Likevel viser de ingen fremtredende aktivering, noe som tyder på riktige kirurgiske prosedyrer (figur 2B). På den annen side vil ødem i CA1 indusert av vevskader begrense bildedybden til 200 μm (figur 2C). Vevsskade induserer også unormal mikrogliaaktivering, for eksempel akkumulering av svulmende prosesser mot den frie vevsoverflaten (figur 2D; sammenlign med det øvre bildet i figur 2B). Dette er tegn på upassende kirurgi.
De representative bildene av mikroglia i kronisk fase mer enn 3 uker etter operasjon er vist i figur 3. Mikroglia kan avbildes igjen utover CA1 til de dypere lagene av DG med høyere fluorescerende intensitet og oppløsning og med mer homogen fordeling (se trinn 6.3, figur 3B). Bildekvaliteten er bedre enn den umiddelbart etter operasjonen (figur 2A). Denne forskjellen kan forklares med redusert ødem og betennelse. Mikroglia i alle lag har allerede gjenopprettet sin forgrenede morfologi (figur 3C), forskjellig fra deres postoperative utseende (figur 2B). Time-lapse-avbildning av mikroglia i CA1 avslører immobile cellelegemer og svært bevegelige prosesser for overvåking (Video 1-2). Deres motile oppførsel ligner den forrige rapporten om mikroglialprosessdynamikk i cortex9.
Det er enkelt å spesifisere de avbildede hippocampuslagene basert på fordelingen og dybden av nevroncellelegemer, ved hjelp av mus som uttrykker fluorescerende prober i hippocampus-nevronene25,26,27. Uten hjelp av posisjonsinformasjon om nevroncellelegemene gir signalene fra fluorescerende mikroglia alene noen ledetråder for identifisering av hippocampuslag (figur 3B). Mikroglia i alveus har langstrakte cellelegemer og prosesser som har en tendens til å strekke seg langs aksonalkanalene (figur 4A). Mikroglia i andre lag kan preges av deres runde cellelegemer og prosesser som utstråler uten foretrukne retninger. Microglia i SP er blant de tettpakkede pyramidale nevronene og kan preges av den lavere tettheten av mikroglialprosesser. Lagene over og under SP er identifisert som henholdsvis SO og SR (figur 4B). Det er umulig å skille mellom SR og SLM basert på mikrogliaegenskaper alene. Grensen mellom CA1 og DG gjenkjennes av tykke blodkar som går langs grensen (figur 4C). Disse karene kan gjenkjennes bedre ved å merke kar med fargestoffer som sulforhodamin 101 (SR101; 5 mM, 4 μL / g kroppsvekt) injisert intraperitonealt (figur 4D). Fluorescenssignalet fra mikroglia faller kraftig i DG sammenlignet med den overliggende CA1, sannsynligvis på grunn av forskjellen i brytningsindeksen til disse strukturene. Dette gapet i fluorescensintensitet kan også bidra til å spesifisere grensen mellom DG og CA1. Som et applikasjonseksempel vises samtidig avbildning av GFP-positive mikroglia og tdTomatmerkede pyramidale nevroner (figur 4E). I dette eksperimentet fikk CX3CR1-GFP-mus en injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) for uttrykket av tdTomato i hippocampuspyramidale nevroner. Neuronal merking vil bidra til å forstå de eksakte lagstrukturene til CA1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Figur 1: Skjematiske tegninger for implantasjon av observasjonsvinduet . (A) Tverrsnittsvisning av det monterte metallrøret med glassbunn. Et sirkulært glassdeksel fester seg til den ene enden av det sylindriske rustfrie røret. (B) Tverrsnittsvisning av aluminiumsplaten festet til skallen. Platen skal være parallell med den markerte overflaten av skallen for ikke å forstyrre objektivlinsen, plassert nær platen for fokusering. (C) Tverrsnittsvisning av det implanterte røret. Glassbunnen skal være tett festet til hippocampusens alveus for forsiktig å trykke og flate overflaten av CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Figur 2: In vivo avbildning av mikroglia i CX3CR1-GFP-mus umiddelbart etter kirurgi. (A) Representativ 3D-rekonstruksjon fra in vivo CA1-avbildning av en CX3CR1-GFP-mus på postoperativ dag (POD) 0 (bredde: 511 μm, høyde: 511 μm, dybde: 550 μm). Den fluorescerende mikroglia i DGs ML på en dybde på 500 μm fra glassbunnen kan avbildes gjennom hele CA1. (B) Typisk GFP-fylt mikroglia oppnådd i (A) vises som maksimale intensitetsprojeksjoner (MIPs) av bildestabler med 20 μm tykkelse på dybder på 100, 300 og 520 μm fra glassbunnen. Mikroglialmorfologi kan påvises fra overfladisk CA1 til ML i DG, men med tilsynelatende bildeforringelse i DG. Mikroglia, spesielt i laget nær den kirurgiske overflaten, er mindre forgrenet, men viser ingen åpenbar aktivering. Skalastenger, 50 μm. (C) Representativ 3D-bilderekonstruksjon av den kirurgisk skadede CA1. Dataene ble hentet fra en CX3CR1-GFP-mus på POD 0 (bredde: 399 μm, høyde: 399 μm, dybde: 450 μm). Mikroglialfluorescens kan bare påvises opp til dybden på 200 μm, i motsetning til den uskadet CA1 (A) med fluorescerende mikroglia detektert på en dybde på 500 μm. (D) Det typiske bildet av unormalt aktivert mikroglia i (C). MIP av GFP-bildestabler med 20 μm tykkelse på en dybde på 60 μm viser mikrogliale bulgingprosesser som strekker seg mot den kirurgisk eksponerte vevsoverflaten. Den generelle mikroglialmorfologien er forskjellig fra bildet vist i (B). Skala bar, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Figur 3: In vivo-avbildning av mikroglia hos CX3CR1-GFP-mus i kronisk fase. (A) Det representative utseendet til det implanterte vinduet på høyre dorsale CA1 i kronisk fase. Gjennom glassbunnen observeres de hvite fibrene i alveus tydelig uten postoperativ blødning. DHC og LV er delvis synlige i henholdsvis kaudomedialområdet og i rostrolateralkanten. Skala bar, 1 mm. (B) Representativ 3D-rekonstruksjon fra in vivo kronisk CA1-avbildning av en CX3CR1-GFP-mus på POD 24 (bredde: 511 μm, høyde: 511 μm, dybde: 670 μm). Sammenlignet med bildene umiddelbart etter operasjonen (figur 2A) viser mikroglia en mer homogen fordeling og kan observeres tydeligere i de dypere lagene av DG på grunn av reduksjon av ødem og betennelse. (C) Typiske bilder av mikroglia fra (B) med fullstendig restaurert ramified morfologi vises som MIPs av GFP-bildestabler med 20 μm tykkelse på dybder på 100, 280 og 500 μm fra kirurgisk overflate. Skala barer, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Figur 4: Ledetråder for å identifisere hvert lag av hippocampus under in vivo avbildning og et applikasjonseksempel på denne metoden. (A) Det typiske bildet av mikroglia i alveus av CX3CR1-GFP-mus i kronisk fase. Mikrogliacellelegemer og prosesser som strekker seg langs aksonalkanalene er vist i MIP av GFP-bildestabler med 10 μm tykkelse på en dybde på 15 μm. Skala bar, 50 μm. (B) Representative bilder av mikroglia i SO, SP og SR i kronisk fase vist som MIP for GFP-bildestabler med 5 μm tykkelse. Den lokale tettheten av mikroglialprosesser er lavere i SP enn i omgivende SO eller SR på grunn av de tettpakkede pyramidale nevronene i SP. Skalastenger, 100 μm. (C) De tykke blodkarene som løper langs grensen mellom CA1 og DG, kan bare gjenkjennes av mikroglialfluorescensen. Den gjennomsnittlige intensitetsprojeksjonen av flislagte GFP-bildestabler med 90 μm tykkelse i kronisk fase ved en dybde på ca. 500 μm er vist. Tomrommet til GFP-signalet tilsvarer de tykke karene. Skalastang, 500 μm. (D) (Øvre) Bildet av samme synsfelt som C etter intraperitoneal injeksjon av SR101. Skalastang, 500 μm. (Nedre) 3D-rekonstruksjon av flisleggingsbildene etter SR101-injeksjon (bredde: 2,60 mm, høyde: 1,73 mm, dybde: 0,69 mm). De tykke karene som går langs grensen mellom CA1 og DG kan lett gjenkjennes av den intravaskulære SR101-fluorescensen. (E) (venstre) 3D-rekonstruksjon av CA1 og DG (bredde: 255 μm, høyde: 255 μm, dybde: 730 μm) og (høyre) MIP av GFP og tdTomatfluorescens i SP laget av bildestabler med 20 μm tykkelse. Ved 1 uke før operasjonen ble 1,5 μL av en blanding av AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 vg / ml) og AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 vg / ml) injisert i hippocampus av en CX3CR1-GFP-mus for å merke nevronene sparsomt. Avbildning ble utført på POD 0. SP og GCL gjenkjennes lett av posisjonen til nevroncellelegemer. Skala bar, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: Time-lapse avbildning av SO mikroglia i kronisk fase. MIP av GFP-bildet stabler med 20 μm tykkelse i time-lapse-avbildningen av SO microglia, animert slik at 28 min spiller på 1 sek. Skala bar, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 2: Time-lapse-avbildning av SR-mikroglia i kronisk fase. MIP av GFP-bildet stabler med 20 μm tykkelse i time-lapse-avbildningen av SR-mikroglia, animert slik at 28 min spiller på 1 sek. Skala bar, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Denne artikkelen beskriver en metode for kronisk in vivo observasjon av hvilende mikroglia i musens hippocampus CA1 ved bruk av nøyaktig kontrollert kirurgi og to-foton mikroskopi.

In vivo Kronisk to-foton avbildning av mikroglia i musens hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Rollene til mikroglia i hippocampus er ennå ikke fullt ut forstått. Denne protokollen kan direkte avbilde hvordan mikroglia kontakter og regulerer nevroner. In vivo avbildning av hvilende mikroglia og nevroner i hippocampus har vært svært vanskelig.Denne metoden kan løse dette problemet. For å implantere observasjonsvinduet, lag en tre millimeter sirkulær spor på skallen ved hjelp av en dermal punch, og sørg for justering av sporet med det tidligere merkede området. Når den dermale stansen når det innerste laget av kraniet før den berører den underliggende duraen, løfter du forsiktig den sentrale beinøya med en 30 gauge nål.Fjern deretter dura forsiktig ved hjelp av en dura picker. Aspirer pia, pialkar og kortikalt vev fra overflaten. Hold dybden av eksponert vevsoverflate homogen over hele kranialvinduet og gradvis utdype aspirasjonen til fibrene i den eksterne kapselen blir eksponert.Etter å ha plassert sugespissen til den eksterne kapselen nær lateral ventrikkel ved den rostrolaterale enden av kranialvinduet, fjern overflatelaget av den eksterne kapselen som går i kaudomedial til rostrolateral retning. Fjern deretter det indre laget som går i mediolateral retning. Bekreft fjerning av hele den eksterne kapselen ved å kontrollere full eksponering av overflaten av alveus og den dorsale hippocampus-kommisjonen.Etter å ha sørget for at blødningen har stoppet helt, fyll hullet med steril saltvann til nivået på skallenoverflaten. Sett deretter glassbunnmetallrøret vertikalt inn i hullet mens du aspirerer overflødig vann som strømmer over fra sidene av røret til glassbunnen lett presser mot alveus og delvis flater ut den underliggende CA1. Bruk tannharpiks sement, fest veggen av det innsatte røret til den omkringliggende skallen.Sett musen i hodeholdingsenheten under objektivlinsen til to-fotonmikroskopet og på motorisert XY-skanningstrinn. Fyll deretter mellomrommet mellom glassbunnen og objektivlinsen med vann uten å skape luftbobler. Juster fokuset til CA1 med veiledning av fluorescens som sendes ut fra hjerneparenkymet og det reflekterte lyset fra kanten av metallrøret under kontinuerlig belysning av den pulserende laseren.Juster vinkelen på musehodet ved å vippe hodeholdeenheten slik at glassbunnen er parallell med avbildningsplanet. Juster deretter korreksjonskragen til målet for å oppnå den høyeste oppløsningen på en dybde av målstrukturen i CA1. Bekreft deretter at fluorescerende celler i molekyllaget av dentate gyrus eller DG på en dybde på 500 mikrometer fra glassbunnen er avbildet i hele synsfeltet.Bare i tilfelle en vellykket operasjon kan DG-signalene oppdages umiddelbart. Løft den postoperative musen i individuelle boliger i flere uker. Sett den bedøvede musen under to-fotonmikroskopet.Utfør avbildning av hippocampus. Bekreft om kvaliteten og intensiteten på bildene tatt etter reduksjon av postoperativt ødem er bedre eller sammenlignbare med de som er tatt på operasjonsdagen. Sørg for at mikroglia har gjenopprettet sin forgrenede morfologi.Utfør deretter in vivo-avbildning på laget av interesse i CA1. Mikroglia i CX3CR1-GFP-mus fanget umiddelbart etter operasjonen viste ingen fremtredende aktivering. Etter vellykket operasjon uten induksjon av ødem, overskred de to-foton bildedybdene hele CA1-lagene og nådde 500 mikrometer fra den kirurgiske overflaten.Mikroglia i kronisk fase på mer enn tre uker etter operasjonen viste høyere fluorescerende intensitet og oppløsning og mer homogen fordeling på grunn av redusert ødem og betennelse. Mikroglia i alle lag gjenopprettet allerede sin forgrenede morfologi og viste immobile cellelegemer og svært modale prosesser. De høyoppløselige bildene over hele CA1 ble gitt i flere måneder.Signalene fra fluorescerende mikroglia bidrar til å identifisere hippocampuslag. Mikroglia i alveus hadde langstrakte cellelegemer og prosesser som strakte seg langs aksonalkanalene. Mikroglia i stratum pyramidale kunne preges av den lavere tettheten av prosessene deres.Grensen mellom CA1 og DG kunne gjenkjennes av tykke blodkar som løp langs grensen, noe som ble bedre gjenkjent ved å merke kar med sulforhodamin 101. Som et applikasjonseksempel ble GFP-positive mikroglia og tdTomato-merkede pyramidale nevroner samtidig avbildet. Neuronal merking bidro til å forstå de eksakte lagstrukturene til CA1.Det viktigste poenget er å redusere operasjonsskader. Unngå vevskader ved aspirasjon. Påfør forsiktig trykk når du setter inn glassbunnen og unngå at dental sement berører hjerneoverflaten.Denne tilnærmingen vil bidra til å identifisere rollen til mikroglia i hippocampus. For eksempel hvordan mikroglia samhandler med nevroner, hvordan de er involvert i læring, og hvordan de kontrollerer hjernesykdommer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

I Vivo to-foton avbildning av erfaring-avhengige molekylære endringer i kortikale Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo to-foton mikroskopi av Enkeltnerveender i hud

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av dendrittutløperne i Mouse Cortex Bruke en Tynnet-skalle Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Samtidig To-foton<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av synaptiske innganger og postsynaptiske mål i Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

I Vivo To-fotonet avbilding av kortikale nevroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillary To-foton In vivo Avbildning av musens netthinne

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...