Name: in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить М. Кондо и М. Мацудзаки за предоставление нам объектива XLPLN25XSVMP. Эта работа была финансово поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) грантом для научного сотрудника JSPS (18J21331 для Р.К.) и грантами в помощь для научных исследований (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 для S.O.), от Японского агентства медицинских исследований и разработок (JP19gm1310003 и JP17gm5010003 для S.O.) и от Японского агентства по науке и технологиям от Moonshot R&D (JPMJMS2024 до HM).

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+disease.">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity.">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum.">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).</li><li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines.">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo.">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).</li><li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex.">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540 (2016).</li><li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization.">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).</li><li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits.">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures.">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li><li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia.">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li><li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity.">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li><li>B&#246;ttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution.">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination.">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity.">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer's+disease+model.">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties.">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1.">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning.">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li><li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus.">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li><li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability.">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li><li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li></ol>

Ни у кого из авторов нет конфликта интересов.

Этот метод содержит сложные хирургические процедуры, но при правильной подготовке он может обеспечить изображения с высоким разрешением по всему CA1 в течение длительного периода времени. Эксперименты с несколькими мышами подтвердили, что качество изображения в хронической послеоперационной фазе лучше, чем при острой послеоперационной визуализации. Лучшее качество изображения сохранялось более 2 месяцев. Наиболее частой причиной отказа является непреднамеренное повреждение СА1 во время операции, которое выявляется при послеоперационной проверке качества (см. шаг 4). Это может быть связано с прямым повреждением аспирацией, высыханием мозга, чрезмерным давлением стекла или токсичностью зубного цемента на последнем этапе. Другой причиной неудачи является послеоперационное кровотечение, которое может быть подтверждено через стеклянное нижнее окно в течение 1 недели после операции (см. шаг 6.1). Внимательно прочитайте протокол и примите все меры предосторожности, чтобы избежать подобных неприятностей.
Даже при нынешней установке двухфотонного микроскопа с детекторами GaAsP в лаборатории попытка визуализировать дорсальный CA1 через кору головного мозга приводит к значительной потере разрешения из-за непренебрежимо малого рассеяния света. Поэтому для получения достаточной разрешающей способности наблюдать за движением микроглиальных процессов или формированием дендритных шипиков нейронов в СА1 неизбежно удаление части вышележащей коры, как и в настоящем способе. Единственным альтернативным способом уменьшить степень удаления коры головного мозга при сохранении высокого разрешения изображения является встраивание релейной линзы, такой как линза с градиентным показателем преломления (GRIN). В этом подходе линза GRIN была помещена внутрь направляющей трубки, имплантированной непосредственно над CA1, для хронической визуализации CA128,29. Наружный диаметр направляющей трубки составлял 1,8 мм, что меньше, чем 3,0 мм устройства в этой статье, при этом обеспечивая высокое разрешение (NA; 0,82), сравнимое с системой здесь (эффективный NA; 0,88). Однако подход с использованием объектива GRIN имеет узкое поле зрения для наблюдения с высоким разрешением и малую глубину изображения, ограниченную WD объектива GRIN. Таким образом, визуализация всех слоев гиппокампа в широком поле зрения с высоким разрешением является специфическим преимуществом метода в данной работе.
Ограничением этой процедуры является то, что частичное удаление коры и воспаление могут иметь некоторые пагубные последствия для гиппокампа. Однако, поскольку удаленная кора не имеет прямого входа в гиппокамп, энторинальная кора не повреждается, а сам гиппокамп не повреждается напрямую, общая оценка заключается в том, что функциональное нарушение гиппокампа не является значительным. Несколько предыдущих исследований подтвердили, что функции гиппокампа, включая обучение и память, сохраняются после имплантации окна гиппокампа 25,26,27,30,31,32,33,34. Таким образом, ожидается, что описанный здесь подход к визуализации будет точно сообщать о функциях гиппокампа после достаточного послеоперационного периода.
Будущие направления исследований субъектов, основанных на этом методе визуализации, могут включать синаптическую обрезку, обнаруженную при одновременной визуализации микроглии и нейронов5, связанное с обучением взаимодействие микроглии с синапсами35, подвижность микроглии, регулируемую нейронной активностьюгиппокампа 36, и реакции микроглии на периферическое воспаление или повреждение тканей7. Этот метод также поможет выяснить прогрессирование нейродегенеративных заболеваний. Например, при болезни Альцгеймера (БА) амилоидные β и тау-белки накапливаются параллельно с гибелью нейрональных клеток и атрофией гиппокампа, что приводит к когнитивной дисфункции; Сообщалось, что микроглия участвует в этом процессе37,38. Хроническая визуализация микроглии и нейронов in vivo с использованием моделей мышей с болезнью Альцгеймера позволит нам отслеживать корреляцию между функциями микроглии и патологией нейронов в гиппокампе моделей мышей с болезнью Альцгеймера.
В этой статье основное внимание уделяется микроглиальной визуализации, но та же процедура визуализации применима к другим типам нейрональных и глиальных клеток в CA1. Кроме того, протокол ограничен визуализацией анестезированных мышей, но этот метод также может быть распространен на мониторинг микроглии гиппокампа у бодрствующих мышей. Артефакты движения, вызванные дыханием, сердцебиением и движениями тела, особенно в глубоких слоях гиппокампа вдали от стеклянного окна, могут существовать в экспериментах с бодрствующими мышами. Следовательно, может потребоваться соответствующая система коррекции движения для захвата морфологии и динамики микроглии.
Обсуждение, связанное с Протоколом Целесообразно отбирать мышей соответствующего возраста и генетических модификаций для экспрессии флуоресцентных зондов с временной и пространственной специфичностью (см. шаг 1.3). Мыши в возрасте 1 месяца могут быть использованы для экспериментов, но с мышами старше 2 месяцев легче обращаться, с их большими размерами тела и устойчивостью к хирургическому стрессу. Кроме того, внешнюю капсулу и альвеус гиппокампа труднее отделить у молодых мышей. Поэтому удаление внешней капсулы у молодых мышей требует хирургических навыков (см. шаги 3.4.3-4). Оценка хирургического вмешательства и последующей визуализации будет более простой с мышами, экспрессирующими флуоресцентные белки воспроизводимо и равномерно в CA1 и DG (см. шаг 4.7). Следовательно, в первоначальных испытаниях операции рекомендуется использовать трансгенных мышей с редко мечеными нейронами, таких как мыши Thy1-YFP или Thy1-GFP39, или мышей с меченой микроглией, таких как мыши CX3CR1-GFP24.
Для успешной операции важен выбор анестезии (см. шаг 2.1). Различные виды анестезии могут вызывать различные степени интраоперационного отека мозга, которые влияют на сложность операции, взаимное расположение имплантированной металлической трубки и степень сжатия мозга стеклянным окном. Эти факторы также могут влиять на выживание нейронов гиппокампа после операции.
В процессе аспирации обнажить гиппокамп (см. шаг 3.4) следует отметить следующие моменты, чтобы свести к минимуму повреждение мозга и обеспечить успешную визуализацию. Постоянно подавайте стерильный физиологический раствор на поверхность ткани, расположив выходное отверстие сбоку от черепного окна. Не допускайте контакта воздуха с поверхностью тканей во время аспирации. Основным принципом тканевой аспирации является удаление тканевой поверхности потоком жидкости во всасывающий наконечник. Следует избегать прямого контакта всасывающего наконечника с тканью. Отрегулируйте отрицательное давление, приложенное к всасывающей трубке, до минимума. Аспирируйте ткань шаг за шагом и убедитесь, что кровотечение контролируется на каждом этапе. Когда кровотечение затягивается, подождите, пока кровотечение не прекратится самопроизвольно. Держите аспирацию на небольшом расстоянии от места кровотечения с постоянным потоком стерильного физиологического раствора. Аспирируйте ткань, чтобы создать цилиндрическое пространство, размер которого соответствует металлической трубке со стеклянным дном (см. шаг 1.1). Выбирайте иглы 23 г для аспирации толстых пиальных сосудов или крупных фрагментов тканей и иглы 25 г для отсасывания мелкого тканевого мусора.

Микроглия являются единственными иммунными клетками и тканевыми макрофагами, находящимися в головном мозге. Было показано, что в дополнение к их функциям иммунных клеток, таким как быстрая реакция на воспаление, они играют различные физиологические роли в поддержании и ремоделировании нейронных цепей, такие как синаптическая обрезка, регуляция синаптической пластичности и контроль активности нейронов 1,2,3,4,5 . Физиологические взаимодействия между микроглией и нейронами представляют все больший интерес как для развития нейронных цепей, так и для нейробиологии заболеваний. Анализ физиологии микроглии in vivo требует методов наблюдения за микроглией без повреждения тканей и воспалительных реакций. Однако микроглии чувствительны к воспалению и резко меняют свою форму и функции в ответ на повреждение тканей 6,7.
Двухфотонная визуализация in vivo является идеальным инструментом для фиксации физиологической динамики микроглии8. Первоначальные применения двухфотонной визуализации in vivo выявили динамическое движение микроглиальных процессов для наблюдения за окружающей средой в коре головного мозга взрослых мышей 9,10. Следующие исследования двухфотонной визуализации еще больше расширили мониторинг микроглии in vivo для анализа функциональных и структурных взаимодействий с нейронами 5,11,12,13,14. Однако глубина визуализации обычной двухфотонной микроскопии была ограничена менее чем 1 мм от поверхности мозга15,16. Это ограничение объясняет скудность предыдущих исследований, в которых сообщалось о поведении микроглии в глубоких областях мозга, таких как гиппокамп.
Недавние исследования секвенирования РНК выявили значительную региональную гетерогенность микроглии, что повышает вероятность различных функциональных ролей 17,18,19,20,21. Поэтому необходимо регистрировать микроглиальные взаимодействия с нейронами в различных областях мозга, но технические трудности мешают таким исследованиям. В частности, сообщалось, что активное участие микроглии в ремоделировании синапсов имеет решающее значение для развития нейронной сети гиппокампа и ее функций, связанных с памятью22,23. Однако эффективных методов наблюдения за неоспоримой микроглией гиппокампа in vivo не было.
Этот протокол объясняет процедуры хронического наблюдения in vivo микроглии покоя в CA1 дорсального гиппокампа с использованием точно контролируемых хирургических методов. Двухфотонная визуализация области CA1 у мышей CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), которые экспрессируют GFP в микроглии24, позволила наблюдать разветвленную микроглию во всех слоях CA1 с достаточным разрешением. Протокол включает в себя несколько советов для успешной имплантации смотрового окна и соответствующих условий визуализации. Кроме того, в качестве примера применения представлена одновременная визуализация пирамидных нейронов и микроглии в СА1. Также обсуждаются преимущества, ограничения и возможности этой техники.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >23 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-166</td>
			<td >Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-167</td>
			<td>Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3 mm dermal punches (DermaPunch)</td>
			<td >Maruho</td>
			<td >213001610</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 G needles</td>
			<td >Dentronics</td>
			<td >Disposable needle No. 30</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A femtosecond pulsed laser</td>
			<td >Spectra-Physics</td>
			<td >MaiTai Deep See</td>
			<td>A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A two-photon microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >A1R MP+</td>
			<td >Microscope for the CA1 imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-hSyn-Cre</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >An objective lens for two-photon imaging</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >XLPLN25XSVMP</td>
			<td>25&#215; objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aspirators</td>
			<td >Shin-ei Industries</td>
			<td >KS-500</td>
			<td>Tools for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum plates</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >CP-1</td>
			<td>Plates made of alminum for head fixation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemical depilatory cream</td>
			<td >YANAGIYA</td>
			<td ></td>
			<td>Cream for hair removal around the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circular glass coverslips</td>
			<td >Matsunami Glass</td>
			<td >3&#966; No.1</td>
			<td>Coverslips bonded to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CX3CR1-GFP mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >008451</td>
			<td>Transgenic mice for microglial imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cylindrical stainless steel tubes</td>
			<td >MORISHITA</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental etching material</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610461</td>
			<td>Used to etch the skull bones.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental resin cement (Super-Bond C&#38;B)</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610555</td>
			<td>Dental cement.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dura pickers (Micro Points)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >10063-15</td>
			<td>Tools for dura removal.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >PRI13-3374</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head holding device</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >MAG-2</td>
			<td>The head holding device of mice with angle adjusters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >BWT-100A and HB-10</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >ALA Scientific</td>
			<td >HEATINGPAD-1 and Hot-1</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine (Ketalar)</td>
			<td >Daiichi Sankyo Company</td>
			<td >S9-001665</td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam</td>
			<td >Tokyo Chemical Industry</td>
			<td >M1959</td>
			<td>Analgesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ophthalmic ointment</td>
			<td >Sato Pharmaceutical</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prevent eye dryness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-iodine scrub solution</td>
			<td >Meiji Seika Pharma</td>
			<td >2612701Q1137</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-tipped miniature knives</td>
			<td >Surgistar</td>
			<td >4769</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td >MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td>
			<td >450-098-67</td>
			<td>Disposable surgical tool.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo microscopes</td>
			<td >Leica Microsystems</td>
			<td >S8 APO</td>
			<td>Microscopes for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td >Otsuka Pharmaceutical Factory</td>
			<td >3311401A2026</td>
			<td>Washing solution during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile waterproof pad</td>
			<td >AS ONE</td>
			<td >8-5945-01</td>
			<td>Surgical platform.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulforhodamine 101</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S7635</td>
			<td>A dye for in vivo vessel imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical drape</td>
			<td >Medline Industries</td>
			<td >MP-0606F6T</td>
			<td>Perforated drape for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Toshiba</td>
			<td >GL15</td>
			<td>Used to cure the adhesives.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-curing optical adhesives</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >NOA81</td>
			<td>Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine (Celactal 2%)</td>
			<td >Bayer</td>
			<td ></td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus

Микроглия, единственные иммунные клетки, находящиеся в головном мозге, активно участвуют в поддержании нейронной цепи, изменяя синапсы и возбудимость нейронов. Недавние исследования выявили дифференциальную экспрессию генов и функциональную гетерогенность микроглии в разных областях мозга. Уникальные функции нейронной сети гиппокампа в обучении и памяти могут быть связаны с активной ролью микроглии в ремоделировании синапсов. Тем не менее, воспалительные реакции, вызванные хирургическими процедурами, были проблематичными при двухфотонном микроскопическом анализе микроглии гиппокампа. Здесь представлен метод, который позволяет хронически наблюдать микроглию во всех слоях гиппокампа CA1 через окно визуализации. Этот метод позволяет проводить анализ морфологических изменений микроглиальных процессов на протяжении более 1 месяца. Долгосрочная визуализация микроглии покоя с высоким разрешением требует минимально инвазивных хирургических процедур, соответствующего выбора объектива и оптимизированных методов визуализации. Преходящая воспалительная реакция микроглии гиппокампа может препятствовать визуализации сразу после операции, но микроглия восстанавливает свою морфологию в состоянии покоя в течение нескольких недель. Кроме того, визуализация нейронов одновременно с микроглией позволяет нам анализировать взаимодействия нескольких типов клеток в гиппокампе. Этот метод может предоставить важную информацию о функции микроглии в гиппокампе.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

В данной работе описан метод хронического наблюдения in vivo микроглии покоя в гиппокампе мыши CA1 с использованием точно контролируемой хирургии и двухфотонной микроскопии.

В естественных условиях Хроническая двухфотонная визуализация микроглии в гиппокампе мыши

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Роль микроглии в гиппокампе еще не до конца изучена. Этот протокол может непосредственно визуализировать, как микроглия контактирует и регулирует нейроны. Визуализация in vivo покоящихся микроглии и нейронов в гиппокампе была очень сложной.Этот метод может решить эту проблему. Чтобы имплантировать смотровое окно, сделайте трехмиллиметровую круговую канавку на черепе с помощью дермального пуансона, обеспечив выравнивание бороздки с ранее отмеченной областью. Когда дермальный пуансон достигнет самого внутреннего слоя черепа, прежде чем коснуться нижележащей твердой мозговой оболочки, осторожно поднимите центральный костный остров с помощью иглы 30 калибра.Далее осторожно удалите твердую мозговую оболочку с помощью подборщика твердой мозговой оболочки. Аспирируйте мягкую пищу, пиальные сосуды и корковую ткань с поверхности. Сохраняйте глубину открытой поверхности тканей однородной по всему черепному окну и постепенно углубляйте аспирацию до тех пор, пока волокна внешней капсулы не обнажаются.После размещения всасывающего наконечника к внешней капсуле рядом с боковым желудочком на ростролатеральном конце черепного окна удалите поверхностный слой наружной капсулы, идущий в хвостомедиальном направлении в ростролатеральном направлении. Затем снимите внутренний слой, идущий в медиолатеральном направлении. Подтвердите удаление всей наружной капсулы, проверив полное обнажение поверхности альвеуса и дорсальной спайки гиппокампа.Убедившись, что кровотечение полностью остановилось, заполните отверстие стерильным физиологическим раствором до уровня поверхности черепа. Затем вставьте металлическую трубку со стеклянным дном вертикально в отверстие, всасывая лишнюю воду, переливающуюся со сторон трубки, пока стеклянное дно не слегка прижмется к альвеусу и частично не сплющет нижележащий CA1. Используя цемент из стоматологической смолы, закрепите стенку вставленной трубки к окружающему черепу.Установите мышь в устройство для удержания головы под линзой объектива двухфотонного микроскопа и на моторизованном сканирующем столике XY. Затем заполните пространство между дном стекла и линзой объектива водой, не создавая пузырьков воздуха. Отрегулируйте фокус на CA1 с помощью флуоресценции, излучаемой паренхимой головного мозга, и отраженного света от края металлической трубки при непрерывном освещении импульсным лазером.Отрегулируйте угол наклона головы мыши, наклонив устройство удержания головы так, чтобы дно стекла было параллельно плоскости изображения. Затем отрегулируйте корректирующий воротник объектива для достижения наибольшего разрешения на глубине целевой структуры в CA1. Затем подтвердите, что флуоресцентные клетки в молекулярном слое зубчатой извилины или DG на глубине 500 микрометров от дна стекла изображены во всем поле зрения.Только в случае успешной операции сигналы DG могут быть обнаружены немедленно. Выращивают послеоперационную мышь в индивидуальном жилье в течение нескольких недель. Поместите анестезированную мышь под двухфотонный микроскоп.Выполните визуализацию гиппокампа. Подтвердите, являются ли качество и интенсивность изображений, полученных после уменьшения послеоперационного отека, лучше или сопоставимы с теми, которые были получены в день операции. Убедитесь, что микроглия восстановила свою разветвленную морфологию.Затем выполните визуализацию in vivo на интересующем слое в CA1. Микроглия у мышей CX3CR1-GFP, захваченная сразу после операции, не показала заметной активации. После успешного хирургического вмешательства без индукции отека глубина двухфотонной визуализации превысила все слои CA1 и достигла 500 микрометров от операционной поверхности.Микроглия в хронической фазе более трех недель после операции показала более высокую интенсивность и разрешение флуоресценции и более однородное распределение из-за уменьшения отека и воспаления. Микроглия во всех слоях уже восстановила свою разветвленную морфологию и показала неподвижные клеточные тела и высокомодальные процессы. Изображения с высоким разрешением по всему CA1 предоставлялись в течение нескольких месяцев.Сигналы от флуоресцентной микроглии помогают идентифицировать слои гиппокампа. Микроглия в альвеусе имела вытянутые клеточные тела и отростки, простирающиеся вдоль аксональных ходов. Микроглии в пирамидальном слое можно отличить по меньшей плотности их отростков.Граница между CA1 и DG может быть распознана по толстым кровеносным сосудам, идущим вдоль границы, что было лучше распознано путем маркировки сосудов сульфорходамином 101. В качестве примера применения одновременно были визуализированы GFP-положительная микроглия и меченые tdTomato пирамидальные нейроны. Нейронная маркировка помогла понять точные слоистые структуры CA1.Наиболее важным моментом является уменьшение повреждений от операции. Избегайте повреждения тканей аспирацией. Применяйте мягкое давление при вставке стеклянного дна и избегайте прикосновения зубного цемента к поверхности мозга.Такой подход поможет выявить роль микроглии в гиппокампе. Например, как микроглия взаимодействует с нейронами, как они участвуют в обучении и как они контролируют заболевания мозга.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

В Vivo Двухфотонное микроскопии Одноместный нервных окончаний в коже

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Одновременная Двухфотонное<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...