Name: in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

XLPLN25XSVMP objektif lensi bize ödünç verdikleri için M. Kondo ve M. Matsuzaki'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) tarafından JSPS Araştırma Görevlisi için Grant-in-Aid (18J21331'den R.K.'ya) ve Bilimsel Araştırma için Grants-in-Aid (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan (JP19gm1310003 ve JP17gm5010003 to S.O.) ve Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'ndan Moonshot R&D (JPMJMS2024'ten H.M.'ye) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi ve Genetik Rekombinant Deney Güvenliği Komitesi'nin politikalarına uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür. Deneylerde 2-4 aylık hem erkek hem de dişi CX3CR1-GFP fareler kullanıldı. Deneycilerin güvenliği ve steril koşulların korunması için tüm prosedürler beyaz önlükler, maskeler ve steril eldivenlerle gerçekleştirildi. Tüm aletler kullanılmadan önce sterilize edildi.
1. Aletlerin ve hayvanların hazırlanması
<ol><li>Cam tabanlı metal bir boru monte edin (Şekil 1A).<ol><li>Özel yapım paslanmaz tüpün bir ucuna küçük bir damla UV kürlü optik yapıştırıcı uygulayın (dış çap 3,0 mm, iç çap 2,8 mm, yükseklik 1,7 mm). Yapıştırıcıyı tüpün dairesel kenarına eşit şekilde yayın. NOT: Tüpün tüm kenarını kaplamak için yeterli miktarda yapıştırıcı kullanılmalıdır.</li>
		<li>Metal borunun tutkalla kaplı ucuna dairesel bir cam kapak kayması (3,0 mm çapında, 0,15 ± 0,02 mm kalınlığında) yerleştirin ve kapak kapağını tüpe hafifçe bastırın, böylece tüp ile cam arasındaki boşluk tutkalla doldurulur. Ardından, camın konumunu metal borunun dış kenarına sığacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Yapıştırıcıyı kürlemek için camı UV ışığıyla yeterli bir süre ışınlayın. NOT: Camın ve tüpün tamamen takılı olduğundan emin olun. Yapışıklık yetersizse, ameliyattan sonra cam çıkabilir, bu da başarısız görüntüleme veya beyin omurilik sıvısı (BOS) sızıntısına neden olabilir.</li>
		<li>Monte edilmiş cam tabanlı metal tüpü% 70 etanol ile dezenfekte edin ve kalıntıları gidermek için steril salin ile yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm cerrahi aletleri kuru ısı sterilizatörü ile sterilize edin.</li>
	<li>Pencere implantasyonu ameliyatı için fareleri hazırlayın. NOT: Fareler uygun yaşta olmalıdır. CA1 ve dentat girustaki (DG) floresan proteinleri eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış olmaları tercih edilir. Bu noktalar Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.</li>
</ol>2. Anestezi ve kafa fiksasyonu
<ol><li>Bir fareyi intraperitoneal ketamin-ksilazin enjeksiyonu (100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin) ile uyuşturun. Preoperatif analjezi için subkutan enjeksiyon ile meloksikam (2 mg/kg) uygulayın. Yeterli anestezi derinliğini sağlamak için kuyruk kıstırma gibi ağrılı uyaranlara verilen yanıtın kaybolduğunu onaylayın. Ameliyat sırasında anestezi her aşındığında, tipik olarak ilk uygulamadan 1 saat sonra ve bundan sonra her 30 dakikada bir yarım doz ketamin-ksilazin ekleyin. Termal destek sağlamak için vücudun altında bir ısıtma yastığı kullanın ve anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. NOT: Ameliyat için anestezi seçimi esastır. Bu nokta Tartışma bölümünde ayrıntılı olarak tartışılmıştır.</li>
	<li>Saçları kafa derisinden çıkarmak için tüy dökücü krem sürün. Kafa derisini povidon-iyot ovma ve ardından alkol ile dairesel bir hareketle birkaç kez dezenfekte edin. Fareyi steril su geçirmez bir ped ile hazırlanan cerrahi platforma yerleştirin ve ameliyat bölgesini sabitlemek için steril perdeler uygulayın. Daha sonra, kafa derisini bir neşterle dairesel olarak kesin ve çıkarın, böylece parietal ve oksipital kemikler ameliyat tarafında tamamen açığa çıkar.</li>
	<li>Kanamayı temizlemek için steril salin uygularken deri altı bağ dokusunu pamuklu çubukla ovalayarak çıkarın. Çimento ve kemik arasındaki yapışmayı güçlendirmeye yardımcı olan periosteumu çıkarmak için kafatası yüzeyini yuvarlak uçlu minyatür bir bıçakla hafifçe kazıyın (bkz. adım 2.6).</li>
	<li>Diş aşındırma malzemesini tüm yüzeye uygulayın, onlarca saniye bekleyin ve yeterli steril salin ile durulayın.</li>
	<li>Su geçirmez mürekkep kullanarak, çıkarılacak kemiğin alanını işaretleyin (3.0 mm çapında, yaklaşık 2.5 mm posterior ve bregma'ya 2.5 mm yanal ortalanmış dairesel bir alan). İşaretledikten sonra kafatası yüzeyini iyice kurulayın. NOT: Kraniotominin pozisyonu hipokampusun büyüklüğüne bağlıdır ve farklı yaşlar için optimize edilmelidir. Kraniotominin pozisyonu için yararlı göstergeler aşağıda sunulacaktır (bkz. adım 3.4.5, NOT).</li>
	<li>Dikdörtgen alüminyum plakayı, üreticinin talimatlarına göre diş reçine çimentosu kullanarak 1.0 mm kalınlığında ve merkezde 5.0 mm çapında bir delik ile kafatasına tutturun.<ol><li>Plakanın ortasındaki deliği, alüminyum plakanın kafatasının işaretli yüzeyine paralel olması için bir kalemle işaretlenmiş dairesel alanla dikkatlice hizalayın (bkz. adım 2.5) (Şekil 1B). Çimentonun plaka ve kemik arasındaki tüm boşlukları sıkıca kapattığından emin olun. Çimentonun yeterince sertleşmesi için yaklaşık 5 dakika bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fareyi, takılı plaka aracılığıyla açı ayarlayıcıları olan kafa tutma cihazının üzerine yerleştirin.</li>
</ol>3. Gözlem penceresinin implantasyonu
NOT: Aşağıdaki cerrahi işlemler stereo mikroskop altında yapılmalıdır.
<ol><li>3.0 mm çapında bir dermal zımba kullanarak kafatası üzerinde dairesel bir oluk açın. Dairesel oluğu ve kalemle işaretlenmiş alanı adım 2.5'te hizalayın. Dermal zımbayı hafif basınçla bükün, böylece oluk derinliği yavaş yavaş artar. Oluk derinliğinin tüm çevre boyunca sabit olup olmadığını sık sık kontrol edin.</li>
	<li>Dermal yumruk kafatasının en iç tabakasına ulaştığında, altta yatan duraya dokunmadan önce, 30 G'lik bir iğne kullanarak merkezi kemik adasını yavaşça kaldırın. NOT: Oluğun tabanından hafif sıvı sızıntısı, oluğun duraya yakın olduğunu gösterir.</li>
	<li>Dura seçici kullanarak dura'yı çıkarın. NOT: Kraniyal pencere içindeki duranın tamamen çıkarılması gereklidir ve ince forsepsler kullanılarak periferdeki artık duranın dikkatli bir şekilde rezeksiyonunu gerektirecektir.</li>
	<li>Hipokampusun alveusunu açığa çıkarmak için dokuyu aspiratöre bağlı 23 G veya 25 G künt iğnelerle nazikçe aspire edin. NOT: Bu adım, başarılı görüntüleme için en kritik adımdır. Doku aspirasyonu için kilit teknik noktalar Tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol><li>Pia ve pial kaplarını aspire edin.</li>
		<li>Kortikal dokuyu yüzeyden aspire edin. Maruz kalan doku yüzeyinin derinliğini tüm kraniyal pencere boyunca homojen tutun. Dış kapsülün lifleri açığa çıkana kadar aspirasyonu yavaş yavaş derinleştirin.</li>
		<li>Emme ucunu, kraniyal pencerenin rostrolateral ucunda bulunan lateral ventrikülün (LV) yakınındaki dış kapsüle dikkatlice yerleştirin. Kaudomedialde rostrolateral yöne doğru çalışan dış kapsülün yüzey tabakasını ve ardından mediolateral yönde çalışan iç tabakayı çıkarın. NOT: AG'nin yakınındaki harici kapsül, altta yatan yapıdan kolayca çıkarılabilir.</li>
		<li>Alveus yüzeyinin ve dorsal hipokampal komissürün (DHC) tam maruziyetini kontrol ederek tüm dış kapsülün çıkarılmasını onaylayın. NOT: DHC, CA1'in kaudodial kısmını kapsar. Alveus ve DHC, lif oryantasyonları ile dış kapsülden ayırt edilebilir. Yani, alveus ve DHC içindeki lifler rostromedialden kaudolateral yöne doğru uzanır ve dış kapsüldeki liflerden ayırt edilebilir. Alveus ve DHC, CA1'e sıkıca tutturulmuştur ve hasar görmemelidir. Dış kapsülün tüm parçaları çıkarılmalıdır, çünkü kalan parçalar cam kapak kaymasının alveusa doğrudan temasını önleyecektir.</li>
		<li>Kanamanın iyice durduğunu onaylayın ve deliği kafatası yüzeyinin seviyesine kadar steril salinle doldurun. NOT: Buradaki görüş alanı, deliğin farenin belirli yaşı için uygun konumda olup olmadığına karar vermeye yardımcı olur. İdeal olarak, alveus ve altta yatan CA1, merkezi alanın çoğunu işgal etmelidir. DHC'nin bir kısmı kaudomidyal alanda görülebilir. AG'nin açılması rostrolateral kenarda tespit edilebilir (Şekil 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Cam tabanlı metal boruyu (bkz. adım 1.1) dikey olarak deliğe yerleştirin ve cam taban alveusa hafifçe bastırana ve altta yatan CA1'i kısmen düzleştirene kadar tüpün kenarlarından taşan fazla suyu aspire edin. NOT: Bu basıncın uygun şekilde ayarlanması gerekir. Çok güçlüyse, CA1 hasar görür. Çok zayıfsa, CA1'in eğriliğine bağlı küresel sapma derin yapılarda görüntüleme çözünürlüğünü bozacaktır.</li>
	<li>Diş reçine çimentosu kullanarak, yerleştirilen tüpün duvarını çevreleyen kafatasına sabitleyin (Şekil 1C). Tüm çevrenin sıkıca kapatıldığından ve hava veya BOS sızıntısı olmadığından emin olun. Çimentonun sertleşmesi için yaklaşık 5 dakika bekleyin. NOT: Çimento viskozitesi düşükken yerleştirilirse, tüp ile kafatası arasındaki boşluktan beyin parankimine sızabilir ve beyne zarar verebilir. Bu nedenle, çimento, viskoziteyi artıran ve boşluktan sızıntıyı azaltan polimerizasyon başlangıcından sonra uygulanmalıdır.</li>
	<li>Kalıntıları gidermek için tüm plakayı, kafatasını ve tüpün içini steril salinle yıkayın.</li>
</ol>4. Ameliyatın kalite kontrolü için ameliyattan hemen sonra iki foton mikroskobu
<ol><li>Fareyi iki foton mikroskobunun objektif merceğinin altındaki kafa tutma cihazına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Termal destek için bir ısıtma yastığı kullanın. Anestezinin derinliğini Adım 2.1'de açıklandığı gibi izleyin ve ayarlayın, çünkü bu kalite kontrolü 30 dakika kadar sürebilir. NOT: 3 mm'den daha uzun çalışma mesafesine (WD) ve yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip suya daldırma objektif lens önerilir. Objektif lensin bir düzeltme tasması, cam ve biyomalzemeler arasındaki kırılma indisi uyumsuzluğunu telafi ederek çözünürlüğü artırabilir.</li>
	<li>Cam ile objektif lens arasındaki boşluğu suyla doldurun ve hava kabarcıklarını önlemek için özel dikkat gösterin. Gerekirse, hedefin tüm ön lensini kaplamak için daha fazla su tutan plastik bir film kullanarak metal plakanın alanını genişletin.</li>
	<li>Beyinde eksprese edilen floresan probların uyarılması için 920 nm dalga boyunda femtosaniye darbeli bir lazeri açın ve görüntü toplama yazılımını başlatın.</li>
	<li>Motorlu sahne ve motorlu odaklama sistemini kullanarak odağı CA1'e ayarlayın. Beyin parankiminden yayılan floresan ve metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında hedef yapıyı konumlandırın.</li>
	<li>Motorlu odaklama sistemi ile odağı ayarlayarak cam tabana dokunan beyin parankiminin derinliklerini ölçün. Cam tabanın ve görüntüleme düzleminin hizalamasını değerlendirmek için farklı yatay konumlardaki derinlikleri karşılaştırın.<ol><li>Cam alt kısmı görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde ayarlanana kadar kafa tutma cihazını eğerek fare kafasının açısını ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme tasmasını ayarlayın.</li>
	<li>DG üst bıçağının moleküler tabakasındaki (ML) cam tabandan 500 μm derinlikteki floresan hücrelerin tüm görüş alanında görüntülenebildiğini doğrulayın. NOT: Bu adım, ameliyatın kalitesini değerlendirmede önemlidir. CA1 hasar görürse, fokal beyin ödemi, yüzeyden 200 μm'den daha derin bir derinlikte floresan tespitini önler. Sadece CA1'de herhangi bir hasar olmadığında ve CA1 katmanlarının eğriliği üstteki örtü kayması ile düzgün bir şekilde düzleştirildiğinde, DG sinyalleri ameliyattan hemen sonra tespit edilebilir (Şekil 2A-D). Temsili Sonuçlar bölümü, CA1 ile DG arasındaki sınırı belirlemek için basit bir yol sağlar.</li>
</ol>5. Postoperatif bakım
<ol><li>Tüpün içindeki suyu aspire edin ve döküntülerin girmesini önlemek için plastik bir conta ile örtün.</li>
	<li>Fareyi sıcak tutun ve anesteziden kurtulmayı bekleyin.</li>
	<li>Fare ağrıya bağlı davranış sergilediği sürece her 24 saatte bir meloksikamı (2 mg / kg) deri altından uygulayın.</li>
	<li>Postoperatif fareyi birkaç hafta boyunca bireysel konutta kaldırın.</li>
</ol>6. CX3CR1-GFP fareleri kullanılarak mikroglia'nın in vivo kronik iki foton görüntülenmesi
<ol><li>Anestezi indüksiyonundan sonra, kalıntıları gidermek için metal tüpün içini steril salinle yıkayın. Hipokampüsün beyaz alveusunun camdan görülebildiğinden emin olun (Şekil 3A) ve postoperatif kanama gibi komplikasyonlar olmadığından emin olun.</li>
	<li>4.1 ile 4.6 arasındaki adımları izleyerek fareyi iki foton mikroskobunun altına yerleştirin.</li>
	<li>Hipokampüsün iki foton uyarımı ile elde edilen görüntülerin kalitesini ve yoğunluğunu kontrol edin (Şekil 3B). Postoperatif ödemin azalmasından sonra çekilen görüntülerin ameliyat günü çekilenlerle karşılaştırılabilir veya daha iyi olduğundan emin olun (Şekil 2A, bkz. adım 4.5). NOT: Görüntü bozulması, beynin içinde doku hasarının varlığını gösterir.</li>
	<li>Mikroglia'nın çarpık morfolojilerini zaten geri kazandığından emin olun (Şekil 3C). NOT: Mikroglia'nın görüntüleme verileri, mikroglia'nın bazal durumuna dönmesi için en az 3-4 hafta gerektiğini göstermektedir.</li>
	<li>Deneyin özel amacı için CA1'in herhangi bir katmanında in vivo görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+disease.">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity.">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum.">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).</li><li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines.">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo.">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).</li><li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex.">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540 (2016).</li><li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization.">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).</li><li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits.">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures.">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li><li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia.">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li><li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity.">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li><li>B&#246;ttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution.">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination.">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity.">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer's+disease+model.">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li><li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties.">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1.">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning.">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li><li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus.">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li><li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability.">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li><li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li><li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimer's+disease.">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li></ol>

Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması yoktur.

Bu yöntem ayrıntılı cerrahi prosedürler içerir, ancak uygun şekilde hazırlanırsa uzun bir süre boyunca tüm CA1 boyunca yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlayabilir. Birkaç fareyle yapılan deneyler, kronik postoperatif fazdaki görüntü kalitesinin akut postoperatif görüntülemeden daha iyi olduğunu doğruladı. Daha iyi görüntü kalitesi 2 aydan fazla bir süre korundu. Başarısızlığın en yaygın nedeni, ameliyat sırasında CA1'in postoperatif kalite kontrolünde tespit edilen kasıtsız hasarıdır (bkz. adım 4). Bunun nedeni aspirasyonla doğrudan yaralanma, beynin kuruması, camın aşırı basıncı veya son adımda diş çimentosundan kaynaklanan toksisite olabilir. Başarısızlığın bir başka nedeni de ameliyattan sonraki 1 hafta içinde cam alt pencereden doğrulanabilen postoperatif kanamadır (bkz. adım 6.1). Protokolü dikkatlice okuyun ve bu tür sıkıntılardan kaçınmak için tüm önlemleri alın.
Laboratuvarda GaAsP dedektörleri ile iki fotonlu mikroskobun mevcut kurulumunda bile, dorsal CA1'i korteks yoluyla görüntüleme girişimi, ışığın ihmal edilemez saçılması nedeniyle önemli bir çözünürlük kaybına neden olur. Bu nedenle, mikroglial süreçlerin hareketini veya CA1'deki nöronların dendritik dikenlerinin oluşumunu gözlemlemek için yeterli çözünürlük elde etmek için, mevcut yöntemde olduğu gibi, üstteki korteksin bir kısmının çıkarılması kaçınılmazdır. Yüksek görüntü çözünürlüğünü korurken kortikal çıkarma derecesini azaltmanın tek alternatif yolu, gradyan kırılma indisi (GRIN) lensi gibi bir röle lensi yerleştirmektir. Bu yaklaşımda, kronik CA1 görüntüleme28,29 için doğrudan CA1'in üzerine implante edilmiş bir kılavuz tüpün içine bir GRIN lens yerleştirilmiştir. Kılavuz tüpün dış çapı, bu kağıttaki cihazın 3,0 mm'sinden daha küçük olan 1,8 mm iken, buradaki sistemle karşılaştırılabilir yüksek çözünürlük (NA; 0,82) üretirken (etkili NA; 0,88). Bununla birlikte, bir GRIN lens kullanan yaklaşım, yüksek çözünürlüklü gözlem için dar bir görüş alanına ve GRIN lensin WD'si ile sınırlı kısa bir görüntüleme derinliğine sahiptir. Bu nedenle, tüm hipokampal tabakaların geniş bir görüş alanında yüksek çözünürlükte görüntülenmesi, bu makaledeki yöntemin özel bir avantajıdır.
Bu prosedürün bir sınırlaması, korteksin ve inflamasyonun kısmen çıkarılmasının hipokampus üzerinde bazı zararlı etkilere sahip olabileceğidir. Bununla birlikte, çıkarılan korteksin hipokampusa doğrudan bir girişi olmadığından, entorinal korteks zarar görmediğinden ve hipokampüsün kendisi doğrudan yaralanmadığından, genel değerlendirme hipokampüsün fonksiyonel bozukluğunun önemli olmadığıdır. Önceki birkaç çalışma, öğrenme ve hafıza da dahil olmak üzere hipokampal fonksiyonların hipokampal pencere implantasyonundan sonra korunduğunu doğrulamıştır 25,26,27,30,31,32,33,34. Bu nedenle, burada tarif edilen görüntüleme yaklaşımının yeterli bir postoperatif dönemden sonra hipokampal fonksiyonları aslına uygun olarak raporlaması beklenmektedir.
Bu görüntüleme tekniğine dayanan araştırma konularının gelecekteki yönleri, mikroglia ve nöronların eşzamanlı görüntülenmesiyle tespit edilen sinaptik budama5, sinapslarla öğrenme ile ilişkili mikroglial etkileşim35, hipokampal nöral aktivite36 tarafından düzenlenen mikroglial motiliteyi ve periferik inflamasyona veya doku hasarına mikroglial yanıtları içerebilir7. Bu yöntem aynı zamanda nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesini aydınlatmaya yardımcı olacaktır. Örneğin, Alzheimer hastalığında (AD), amiloid β ve tau proteinleri, nöronal hücre ölümleri ve hipokampal atrofi ile paralel olarak birikir ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açar; mikroglia'nın bu sürece dahil olduğu bildirilmiştir37,38. AD fare modellerini kullanarak mikroglia ve nöronların in vivo kronik görüntülenmesi, AD fare modellerinin hipokampüsünde mikroglial fonksiyonlar ile nöronal patoloji arasındaki korelasyonu izlememizi sağlayacaktır.
Bu makale mikroglial görüntülemeye odaklanmaktadır, ancak aynı görüntüleme prosedürü CA1'deki diğer nöronal ve glial hücre tipleri için de geçerlidir. Ek olarak, protokol anestezi uygulanmış farelerin görüntülenmesiyle sınırlıdır, ancak teknik uyanık farelerde hipokampal mikroglia'nın izlenmesine de genişletilebilir. Solunum, kalp atışları ve vücut hareketlerinin neden olduğu hareket artefaktları, özellikle cam pencereden uzaktaki derin hipokampal katmanlarda, uyanık farelerle yapılan deneylerde mevcut olabilir. Bu nedenle, mikroglial morfolojiyi ve dinamikleri yakalamak için uygun bir hareket düzeltme sistemi gerekebilir.
Protokol ile ilgili tartışmalar Zamansal ve uzamsal özgüllüğe sahip floresan probların ekspresyonu için uygun yaş ve genetik modifikasyonlara sahip farelerin seçilmesi önerilir (bkz. adım 1.3). 1 aylıkken fareler deneyler için kullanılabilir, ancak 2 aydan büyük farelerin daha büyük vücut boyutları ve cerrahi strese karşı dirençleri ile kullanımı daha kolaydır. Ek olarak, hipokampusun dış kapsülü ve alveusunun genç farelerde ayrılması daha zordur. Bu nedenle, genç farelerde dış kapsülün çıkarılması cerrahi beceriler gerektirir (bkz. adım 3.4.3-4). Ameliyatın değerlendirilmesi ve sonraki görüntüleme, floresan proteinlerini CA1 ve DG'de tekrarlanabilir ve homojen olarak eksprese eden farelerle daha basit olacaktır (bkz. adım 4.7). Bu nedenle, ameliyatın ilk denemelerinde, Thy1-YFP veya Thy1-GFP fareleri39 gibi seyrek etiketli nöronlara sahip transgenik farelerin veya CX3CR1-GFP fareleri24 gibi etiketli mikroglialı farelerin kullanılması tavsiye edilir.
Başarılı bir ameliyat için anestezi seçimi önemlidir (bkz. adım 2.1). Farklı anestezi türleri, ameliyatın zorluğunu, implante edilen metal tüpün göreceli pozisyonunu ve cam pencereden beyin sıkışmasının derecesini etkileyen çeşitli derecelerde intraoperatif beyin ödemine neden olabilir. Bu faktörler ayrıca ameliyattan sonra hipokampal nöronların hayatta kalmasını da etkileyebilir.
Hipokampüsü açığa çıkarmaya yönelik aspirasyon sürecinde (bkz. adım 3.4), beyne verilen zararı en aza indirmek ve başarılı bir görüntüleme sağlamak için aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir. Kraniyal pencerenin yan tarafına bir çıkış yerleştirerek doku yüzeyine sürekli olarak steril salin sağlayın. Aspirasyon sırasında doku yüzeyinin havaya maruz kalmasını önleyin. Doku aspirasyonunun temel prensibi, emme ucuna sıvı akışı ile doku yüzeyinin çıkarılmasıdır. Emme ucunun dokuya doğrudan temasından kaçınılmalıdır. Emme borusuna uygulanan negatif basıncı minimum olacak şekilde ayarlayın. Dokuyu adım adım aspire edin ve kanamanın her adımda kontrol edildiğini onaylayın. Kanama uzadığında, kanama kendiliğinden durana kadar bekleyin. Sürekli steril salin akışı ile kanama noktasından kısa bir mesafeden aspirasyonu koruyun. Dokusunu, boyutu cam tabanlı metal boruya uyan silindirik bir boşluk oluşturmak için aspire edin (bkz. adım 1.1). Kalın pial damarları veya büyük doku parçalarını aspire etmek için 23 G iğneleri ve küçük doku kalıntılarını emmek için 25 G iğneleri seçin.

Mikroglia, beyinde bulunan tek bağışıklık hücreleri ve doku makrofajlarıdır. Enflamasyona hızlı yanıt gibi bağışıklık hücreleri olarak işlevlerine ek olarak, sinaptik budama, sinaptik plastisitenin düzenlenmesi ve nöronal aktivitenin kontrolü gibi nöral devrelerin korunmasında ve yeniden modellenmesinde çeşitli fizyolojik roller oynadıkları gösterilmiştir 1,2,3,4,5 . Mikroglia ve nöronlar arasındaki fizyolojik etkileşimler hem nöral devre gelişiminde hem de hastalık nörobiyolojisinde giderek artan bir ilgi görmektedir. Mikroglia'nın fizyolojisini in vivo olarak analiz etmek, mikroglia'yı doku hasarı ve enflamatuar yanıtlar olmadan gözlemlemek için yöntemler gerektirir. Bununla birlikte, mikroglia inflamasyona duyarlıdır ve doku hasarına yanıt olarak şekillerini ve işlevlerini önemli ölçüde değiştirir 6,7.
İki fotonlu in vivo görüntüleme, mikroglia8'in fizyolojik dinamiklerini yakalamak için ideal bir araçtır. İn vivo iki foton görüntülemenin ilk uygulamaları, yetişkin fare korteksi 9,10'da çevresel gözetim için mikroglial süreçlerin dinamik hareketini ortaya koymuştur. Aşağıdaki iki fotonlu görüntüleme çalışmaları, nöronlarla fonksiyonel ve yapısal etkileşimlerin analizi için mikroglia'nın in vivo izlenmesini daha da genişletti 5,11,12,13,14. Bununla birlikte, geleneksel iki foton mikroskobunun görüntüleme derinliği, beyin yüzeyinden 1 mm'den daha az bir mesafe ile sınırlandırılmıştır15,16. Bu kısıtlama, mikroglia'nın hipokampus gibi derin beyin bölgelerindeki davranışını bildiren önceki çalışmaların azlığını açıklamaktadır.
Son zamanlarda yapılan RNA dizileme çalışmaları, mikroglianın önemli bir bölgesel heterojenliğini ortaya koymuş ve farklı fonksiyonel rollerin olasılığını artırmıştır 17,18,19,20,21. Bu nedenle, çeşitli beyin bölgelerindeki nöronlarla mikroglial etkileşimleri kaydetmek gerekir, ancak teknik zorluklar bu tür çalışmaları engellemiştir. Özellikle, sinaps yeniden şekillenmesinde mikroglial aktif katılımın, hipokampal sinir ağının ve hafıza ile ilgili işlevlerinin gelişiminde kritik olduğu bildirilmiştir22,23. Bununla birlikte, tartışmasız hipokampal mikroglia'yı in vivo gözlemlemek için etkili yöntemler mevcut değildir.
Bu protokol, dorsal hipokampusun CA1'inde istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için prosedürleri tam olarak kontrol edilen cerrahi teknikler kullanarak açıklamaktadır. Mikroglia24'te GFP'yi eksprese eden CX3CR1-GFP farelerinde (CX3CR1 + / GFP) CA1 alanının iki fotonlu görüntülenmesi, CA1'in tüm katmanlarındaki çarpılmış mikroglia'nın yeterli çözünürlükte gözlemlenmesini sağlamıştır. Protokol, gözlem penceresinin başarılı bir şekilde implantasyonu ve uygun görüntüleme koşulları için birkaç ipucu içerir. Ek olarak, CA1'deki piramidal nöronların ve mikroglia'nın eşzamanlı olarak görselleştirilmesi bir uygulama örneği olarak sunulmuştur. Bu tekniğin avantajları, sınırlamaları ve potansiyelleri de tartışılmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >23 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-166</td>
			<td >Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 G blunt needles</td>
			<td >NIPRO</td>
			<td >02-167</td>
			<td>Suction tips for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3 mm dermal punches (DermaPunch)</td>
			<td >Maruho</td>
			<td >213001610</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 G needles</td>
			<td >Dentronics</td>
			<td >Disposable needle No. 30</td>
			<td>Tools for craniotomy.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A femtosecond pulsed laser</td>
			<td >Spectra-Physics</td>
			<td >MaiTai Deep See</td>
			<td>A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A two-photon microscope</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >A1R MP+</td>
			<td >Microscope for the CA1 imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV1-hSyn-Cre</td>
			<td >Penn Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>AAV for neuronal labeling.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >An objective lens for two-photon imaging</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >XLPLN25XSVMP</td>
			<td>25&#215; objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aspirators</td>
			<td >Shin-ei Industries</td>
			<td >KS-500</td>
			<td>Tools for aspiration.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum plates</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >CP-1</td>
			<td>Plates made of alminum for head fixation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemical depilatory cream</td>
			<td >YANAGIYA</td>
			<td ></td>
			<td>Cream for hair removal around the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circular glass coverslips</td>
			<td >Matsunami Glass</td>
			<td >3&#966; No.1</td>
			<td>Coverslips bonded to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CX3CR1-GFP mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >008451</td>
			<td>Transgenic mice for microglial imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cylindrical stainless steel tubes</td>
			<td >MORISHITA</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental etching material</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610461</td>
			<td>Used to etch the skull bones.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dental resin cement (Super-Bond C&#38;B)</td>
			<td >Sun Medical</td>
			<td >204610555</td>
			<td>Dental cement.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dura pickers (Micro Points)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >10063-15</td>
			<td>Tools for dura removal.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >PRI13-3374</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head holding device</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >MAG-2</td>
			<td>The head holding device of mice with angle adjusters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Bio Research Center</td>
			<td >BWT-100A and HB-10</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >ALA Scientific</td>
			<td >HEATINGPAD-1 and Hot-1</td>
			<td>Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine (Ketalar)</td>
			<td >Daiichi Sankyo Company</td>
			<td >S9-001665</td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam</td>
			<td >Tokyo Chemical Industry</td>
			<td >M1959</td>
			<td>Analgesia during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ophthalmic ointment</td>
			<td >Sato Pharmaceutical</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prevent eye dryness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-iodine scrub solution</td>
			<td >Meiji Seika Pharma</td>
			<td >2612701Q1137</td>
			<td>Used to disinfect the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round-tipped miniature knives</td>
			<td >Surgistar</td>
			<td >4769</td>
			<td>Surgical tools.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel</td>
			<td >MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td>
			<td >450-098-67</td>
			<td>Disposable surgical tool.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo microscopes</td>
			<td >Leica Microsystems</td>
			<td >S8 APO</td>
			<td>Microscopes for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td >Otsuka Pharmaceutical Factory</td>
			<td >3311401A2026</td>
			<td>Washing solution during surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile waterproof pad</td>
			<td >AS ONE</td>
			<td >8-5945-01</td>
			<td>Surgical platform.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulforhodamine 101</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S7635</td>
			<td>A dye for in vivo vessel imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical drape</td>
			<td >Medline Industries</td>
			<td >MP-0606F6T</td>
			<td>Perforated drape for surgery.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Toshiba</td>
			<td >GL15</td>
			<td>Used to cure the adhesives.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-curing optical adhesives</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >NOA81</td>
			<td>Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine (Celactal 2%)</td>
			<td >Bayer</td>
			<td ></td>
			<td>Anesthesia during surgery.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus

Beyinde bulunan tek bağışıklık hücresi olan mikroglia, sinapsları ve nöronal uyarılabilirliği değiştirerek nöral devre bakımına aktif olarak katılır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, farklı beyin bölgelerinde mikroglia'nın diferansiyel gen ekspresyonunu ve fonksiyonel heterojenitesini ortaya koymuştur. Hipokampal sinir ağının öğrenme ve hafızadaki benzersiz işlevleri, mikroglia'nın sinaps yeniden şekillenmesindeki aktif rolleri ile ilişkili olabilir. Bununla birlikte, cerrahi prosedürlerle indüklenen enflamatuar yanıtlar, hipokampal mikroglia'nın iki fotonlu mikroskobik analizinde sorunlu olmuştur. Burada, hipokampal CA1'in tüm katmanlarındaki mikroglia'nın bir görüntüleme penceresinden kronik olarak gözlemlenmesini sağlayan bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, mikroglial süreçlerdeki morfolojik değişikliklerin 1 aydan fazla bir süre boyunca analiz edilmesini sağlar. İstirahat mikrogliasının uzun süreli ve yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi minimal invaziv cerrahi prosedürler, uygun objektif lens seçimi ve optimize edilmiş görüntüleme teknikleri gerektirir. Hipokampal mikroglianın geçici enflamatuar yanıtı, ameliyattan hemen sonra görüntülemeyi önleyebilir, ancak mikroglia birkaç hafta içinde sessiz morfolojilerini geri yükler. Ayrıca, nöronları mikroglia ile aynı anda görüntülemek, hipokampustaki çoklu hücre tiplerinin etkileşimlerini analiz etmemizi sağlar. Bu teknik, hipokampustaki mikroglial fonksiyon hakkında temel bilgiler sağlayabilir.

Bu tekniği kullanarak, ramifiye ve sessiz mikroglia, stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) ve stratum lacunosum-moleculare (SLM) dahil olmak üzere dorsal CA1'in tüm katmanlarında, özellikle inflamasyon azaldığında ameliyattan 3-4 hafta sonra kronik olarak gözlemlenebilir. Ameliyat uygun şekilde yapılırsa, ameliyattan birkaç ay sonrasına kadar görüntüleme yapılabilir. Bu bölümde intravital görüntülemenin değerlendirilmesinde yararlı üç konu bulunmaktadır. İlk olarak, ameliyattan hemen sonra ve kronik fazda örnek görüntüler uygun cerrahi ve görüntüleme prosedürleri için referans olarak verilir. İkincisi, mikroglianın farklı morfolojisi, floresan yoğunluğu ve spesifik hipokampal katmanlardaki kan damarı dağılımı, okuyucuların alveustan DG'ye kadar değişen görüntüleme derinliğini tahmin etmelerine yardımcı olmak için açıklanmaktadır. Üçüncü olarak, nöronların ve mikroglia'nın eşzamanlı görüntülenmesini gösteren bir uygulama örneği verilmiştir.
CX3CR1-GFP farelerde ameliyattan hemen sonra mikroglia'nın temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. CA1'de belirgin bir hasar yoksa ve CA1 katmanlarının eğriliği üstteki örtü kayması ile düzgün bir şekilde düzleştirilirse, mikroglia'nın iki foton görüntüleme derinliği tüm CA1 katmanlarını aşar ve DG'nin ML veya granül hücre tabakasının (GCL) bulunduğu cerrahi yüzeyden 500 μm'ye ulaşır (Şekil 2A; bkz. adım 4.7 ve Şekil 4E). Mikroglia, özellikle cerrahi yüzeye yakın tabakada, sağlam hipokampustakilere kıyasla biraz daha az çarpılır. Bununla birlikte, uygun cerrahi prosedürleri düşündüren belirgin bir aktivasyon göstermezler (Şekil 2B). Öte yandan, doku hasarının neden olduğu CA1'deki ödem, görüntüleme derinliğini 200 μm ile sınırlayacaktır (Şekil 2C). Doku hasarı ayrıca serbest doku yüzeyine doğru şişkin süreçlerin birikmesi gibi anormal mikroglial aktivasyonu da indükler (Şekil 2D; Şekil 2B'nin üst görüntüsüyle karşılaştırın). Bunlar uygunsuz ameliyat belirtileridir.
Ameliyattan 3 haftadan fazla bir süre sonra kronik fazda mikroglia'nın temsili görüntüleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Mikroglia, CA1'in ötesinde, DG'nin daha derin katmanlarına daha yüksek floresan yoğunluğu ve çözünürlüğü ile ve daha homojen dağılımla tekrar görüntülenebilir (bkz. adım 6.3, Şekil 3B). Görüntüleme kalitesi ameliyattan hemen sonra olduğundan daha iyidir (Şekil 2A). Bu fark, azalan ödem ve iltihaplanma ile açıklanabilir. Tüm katmanlardaki mikroglialar, postoperatif görünümlerinden farklı olarak ramifiye morfolojilerini (Şekil 3C) zaten restore etmişlerdir (Şekil 2B). CA1'deki mikroglia'nın hızlandırılmış görüntülemesi, hareketsiz hücre cisimlerini ve gözetim için oldukça hareketli süreçleri ortaya koymaktadır (Video 1-2). Hareketli davranışları, korteks9'daki mikroglial süreç dinamiklerinin önceki raporuna benzer.
Görüntülenen hipokampal katmanları, hipokampal nöronlarda floresan probları ifade eden fareleri kullanarak nöronal hücre cisimlerinin dağılımına ve derinliğine dayanarak belirtmek kolaydır25,26,27. Nöron hücre cisimleri hakkındaki konumsal bilgilerin yardımı olmadan, floresan mikrogliadan gelen sinyaller tek başına hipokampal tabakaların tanımlanması için bazı ipuçları sağlar (Şekil 3B). Alveustaki mikroglia, aksonal yollar boyunca uzanma eğiliminde olan uzamış hücre gövdelerine ve süreçlerine sahiptir (Şekil 4A). Diğer katmanlardaki mikroglia, yuvarlak hücre gövdeleri ve tercih edilen yönler olmadan yayılan süreçleri ile ayırt edilebilir. SP'deki mikroglia, yoğun bir şekilde paketlenmiş piramidal nöronlar arasındadır ve mikroglial süreçlerin daha düşük yoğunluğu ile ayırt edilebilir. SP'nin üstündeki ve altındaki katmanlar sırasıyla SO ve SR olarak tanımlanmıştır (Şekil 4B). SR ve SLM arasında sadece mikroglial özelliklere dayanarak ayrım yapmak imkansızdır. CA1 ve DG arasındaki sınır, sınır boyunca uzanan kalın kan damarları tarafından tanınır (Şekil 4C). Bu damarlar, intraperitoneal olarak enjekte edilen sülforhodamin 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g vücut ağırlığı) gibi boyalarla kapların etiketlenmesiyle daha iyi tanınabilir (Şekil 4D). Mikroglia'dan gelen floresan sinyali, muhtemelen bu yapıların kırılma indisindeki farktan dolayı, üstteki CA1'e kıyasla DG'de keskin bir şekilde düşer. Floresan yoğunluğundaki bu boşluk, DG ve CA1 arasındaki sınırın belirlenmesine de yardımcı olabilir. Bir uygulama örneği olarak, GFP-pozitif mikroglia ve tdDomates işaretli piramidal nöronların eşzamanlı görüntülenmesi gösterilmiştir (Şekil 4E). Bu deneyde, CX3CR1-GFP fareleri, hipokampal piramidal nöronlarda tdDomates ekspresyonu için adeno ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu aldı. Nöronal etiketleme, CA1'in tam katman yapılarını anlamaya yardımcı olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Şekil 1: Gözlem penceresinin implantasyonu için şematik çizimler . (A) Monte edilmiş cam tabanlı metal borunun kesitsel görünümü. Dairesel bir cam kapak, silindirik paslanmaz borunun bir ucuna yapışır. (B) Kafatasına tutturulmuş alüminyum plakanın kesitsel görünümü. Plaka, odaklama için plakaya yakın konumlandırılmış objektif lense müdahale etmeyecek şekilde kafatasının işaretli yüzeyine paralel olmalıdır. (C) İmplante edilen tüpün kesitsel görünümü. Cam taban, CA1'in yüzeyini hafifçe bastırmak ve düzleştirmek için hipokampüsün alveusuna yakından tutturulmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Şekil 2: CX3CR1-GFP farelerde ameliyattan hemen sonra mikroglia'nın in vivo görüntülemesi. (A) Postoperatif günde CX3CR1-GFP farenin in vivo CA1 görüntülemesinden temsili 3D rekonstrüksiyon (POD) 0 (genişlik: 511 μm, yükseklik: 511 μm, derinlik: 550 μm). DG'nin ML'sindeki floresan mikroglia, cam tabandan 500 μm derinlikte tüm CA1 boyunca görüntülenebilir. (B) (A)'da elde edilen tipik GFP dolgulu mikroglia, cam tabandan 100, 300 ve 520 μm derinliklerde 20 μm kalınlığa sahip görüntü yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP'ler) olarak gösterilir. Mikroglial morfoloji, yüzeysel CA1'den DG'nin ML'sine kadar saptanabilir, ancak DG'de belirgin görüntü bozulması vardır. Mikroglia, özellikle cerrahi yüzeye yakın tabakada daha az çarpılır, ancak belirgin bir aktivasyon göstermez. Ölçek çubukları, 50 μm. (C) Cerrahi olarak hasar görmüş CA1'in temsili 3D görüntü rekonstrüksiyonu. Veriler, POD 0 üzerindeki bir CX3CR1-GFP fareden alınmıştır (genişlik: 399 μm, yükseklik: 399 μm, derinlik: 450 μm). Mikroglial floresan, 500 μm derinlikte tespit edilen floresan mikroglia ile hasarsız CA1 (A) ile karşılaştırıldığında, yalnızca 200 μm derinliğe kadar tespit edilebilir. (D) (C) 'de anormal şekilde aktive edilmiş mikroglia'nın tipik görüntüsü. 60 μm derinlikte 20 μm kalınlığa sahip GFP görüntü yığınlarının MIP'si, cerrahi olarak maruz kalan doku yüzeyine doğru uzanan mikroglial şişkinlik süreçlerini gösterir. Genel mikroglial morfoloji, (B)'de gösterilen görüntüden farklıdır. Ölçek çubuğu, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Şekil 3: Kronik fazdaki CX3CR1-GFP farelerde mikroglianın in vivo görüntülenmesi . (A) Kronik fazda sağ dorsal CA1 üzerinde implante edilmiş pencerenin temsili görünümü. Cam tabandan, alveusun beyaz lifleri postoperatif kanama olmadan açıkça gözlenir. DHC ve AG, sırasıyla kaudomidyal alanda ve rostrolateral kenarda kısmen görülebilir. Ölçek çubuğu, 1 mm. (B) POD 24 üzerinde bir CX3CR1-GFP farenin in vivo kronik CA1 görüntülemesinden temsili 3D rekonstrüksiyon (genişlik: 511 μm, yükseklik: 511 μm, derinlik: 670 μm). Ameliyattan hemen sonraki görüntülerle karşılaştırıldığında (Şekil 2A) mikroglia daha homojen bir dağılım göstermekte ve ödem ve inflamasyonun azalması nedeniyle DG'nin daha derin katmanlarında daha net gözlenebilmektedir. (C) (B)'den gelen mikroglia'nın tipik görüntüleri, cerrahi yüzeyden 100, 280 ve 500 μm derinliklerde 20 μm kalınlığında GFP görüntü yığınlarının MIP'leri olarak gösterilir. Ölçek çubukları, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Şekil 4: İn vivo görüntüleme sırasında hipokampüsün her bir katmanını tanımlamaya yönelik ipuçları ve bu yöntemin bir uygulama örneği. (A) Kronik fazdaki CX3CR1-GFP farelerinin alveusundaki mikroglia'nın tipik görüntüsü. Aksonal yollar boyunca uzanan mikroglial hücre gövdeleri ve süreçleri, 15 μm derinlikte 10 μm kalınlığındaki GFP görüntü yığınlarının MIP'sinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu, 50 μm. (B) 5 μm kalınlığında GFP görüntü yığınlarının MIP'si olarak gösterilen kronik fazdaki SO, SP ve SR'deki mikroglia'nın temsili görüntüleri. Mikroglial süreçlerin lokal yoğunluğu, SP'deki yoğun şekilde paketlenmiş piramidal nöronlar nedeniyle SP'de çevreleyen SO veya SR'den daha düşüktür. ölçek çubukları, 100 μm. (C) CA1 ve DG arasındaki sınır boyunca uzanan kalın kan damarları sadece mikroglial floresan tarafından tanınabilir. Yaklaşık 500 μm derinlikte kronik fazda 90 μm kalınlığa sahip karolu GFP görüntü yığınlarının ortalama yoğunluk projeksiyonu gösterilmiştir. GFP sinyalinin boşluğu, kalın kaplara karşılık gelir. Ölçek çubuğu, 500 μm. (D) (Üst) SR101'in intraperitoneal enjeksiyonundan sonra C ile aynı görüş alanının görüntüsü. Ölçek çubuğu, 500 μm. (Alt) SR101 enjeksiyonundan sonra döşeme görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu (genişlik: 2,60 mm, yükseklik: 1,73 mm, derinlik: 0,69 mm). CA1 ve DG arasındaki sınır boyunca uzanan kalın damarlar, intravasküler SR101 floresan tarafından kolayca tanınabilir. (E) (Solda) CA1 ve DG'nin 3D rekonstrüksiyonu (genişlik: 255 μm, yükseklik: 255 μm, derinlik: 730 μm) ve (sağda) 20 μm kalınlığındaki görüntü yığınlarından yapılmış SP'deki GFP ve tdDomates floresansının MIP'si. Ameliyattan 1 hafta önce, nöronları seyrek olarak etiketlemek için CX3CR1-GFP farenin hipokampüsüne 1.5 μL AAV1-CAG-FLEX-tdDomates (5.0 x 10 12 vg / mL) ve AAV1-hSyn-Cre (1.0 x10 9 vg / mL) karışımı enjekte edildi. Görüntüleme POD 0 üzerinde yapıldı. SP ve GCL, nöronal hücre cisimlerinin pozisyonu ile kolayca tanınır. Ölçek çubuğu, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Kronik fazda SO mikroglia'nın hızlandırılmış görüntülenmesi. GFP görüntüsünün MIP'si, SO mikroglia'nın hızlandırılmış görüntülemesinde 20 μm kalınlığında yığınlanır ve 1 saniyede 28 dakika oynatılacak şekilde canlandırılır. Ölçek çubuğu, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: Kronik fazda SR mikroglia'nın hızlandırılmış görüntülemesi. GFP görüntüsünün MIP'si, SR mikroglia'nın hızlandırılmış görüntülemesinde 20 μm kalınlığında yığınlanır ve 1 saniyede 28 dakika oynatılacak şekilde canlandırılır. Ölçek çubuğu, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus at JoVE.com

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Mikroglia'nın hipokampustaki rolleri henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, mikroglia'nın nöronlarla nasıl temas ettiğini ve düzenlediğini doğrudan görüntüleyebilir. Hipokampustaki istirahat mikroglia ve nöronların in vivo görüntülenmesi çok zor olmuştur.Bu yöntem bu sorunu çözebilir. Gözlem penceresini implante etmek için, bir dermal zımba kullanarak kafatası üzerinde üç milimetrelik dairesel bir oluk açın ve oluğun önceden işaretlenmiş alanla hizalanmasını sağlayın. Dermal yumruk, altta yatan duraya dokunmadan önce kafatasının en iç tabakasına ulaştığında, 30 gauge'lik bir iğne kullanarak merkezi kemik adasını yavaşça kaldırın.Ardından, bir dura seçici kullanarak dura'yı dikkatlice çıkarın. Pia, pial damarları ve kortikal dokuyu yüzeyden aspire edin. Maruz kalan doku yüzeyinin derinliğini tüm kraniyal pencere boyunca homojen tutun ve dış kapsülün lifleri açığa çıkana kadar aspirasyonu kademeli olarak derinleştirin.Emme ucunu kraniyal pencerenin rostrolateral ucundaki lateral ventrikülün yakınındaki dış kapsüle yerleştirdikten sonra, kaudomedialde çalışan dış kapsülün yüzey tabakasını rostrolateral yöne doğru çıkarın. Daha sonra mediolateral yönde çalışan iç tabakayı çıkarın. Alveus yüzeyinin ve dorsal hipokampal komissurenin tam olarak maruz kalmasını kontrol ederek tüm dış kapsülün çıkarılmasını onaylayın.Kanamanın tamamen durduğundan emin olduktan sonra, deliği kafatası yüzeyinin seviyesine kadar steril salinle doldurun. Daha sonra, cam taban metal tüpü dikey olarak deliğe yerleştirin ve cam taban alveusa hafifçe bastırana ve altta yatan CA1'i kısmen düzleştirene kadar tüpün kenarlarından taşan fazla suyu aspire edin. Diş reçine çimentosunu kullanarak, yerleştirilen tüpün duvarını çevreleyen kafatasına sabitleyin.Fareyi kafa tutma cihazına, iki foton mikroskobunun objektif merceğinin altına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Ardından, cam taban ile objektif lens arasındaki boşluğu hava kabarcıkları oluşturmadan suyla doldurun. Beyin parankiminden yayılan floresan ve darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde odağı CA1'e ayarlayın.Kafa tutma aygıtını, cam taban görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde eğerek fare kafasının açısını ayarlayın. Ardından, CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme tasmasını ayarlayın. Daha sonra, dentat girusun veya DG'nin moleküler tabakasındaki cam tabandan 500 mikrometre derinlikteki floresan hücrelerin tüm görüş alanında görüntülendiğini doğrulayın.Sadece başarılı bir ameliyat durumunda, DG sinyalleri hemen tespit edilebilir. Postoperatif fareyi birkaç hafta boyunca bireysel konutta kaldırın. Anestezi uygulanan fareyi iki fotonlu mikroskop altına yerleştirin.Hipokampusun görüntülemesini gerçekleştirin. Postoperatif ödemin azaltılmasından sonra çekilen görüntülerin kalitesinin ve yoğunluğunun ameliyat gününde yakalananlardan daha iyi veya karşılaştırılabilir olup olmadığını onaylayın. Mikroglia'nın parçalanmış morfolojilerini geri kazandığından emin olun.Daha sonra CA1'deki ilgi katmanında in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Ameliyattan hemen sonra yakalanan CX3CR1-GFP farelerdeki mikroglia, belirgin bir aktivasyon göstermedi. Ödem indüksiyonu olmadan yapılan başarılı ameliyattan sonra, iki fotonlu görüntüleme derinlikleri tüm CA1 katmanlarını aştı ve cerrahi yüzeyden 500 mikrometreye ulaştı.Ameliyattan üç haftadan uzun bir süre sonra kronik fazdaki mikroglia, azalmış ödem ve inflamasyon nedeniyle daha yüksek floresan yoğunluğu ve çözünürlüğü ve daha homojen dağılım gösterdi. Tüm katmanlardaki mikroglia, parçalanmış morfolojilerini zaten restore etti ve hareketsiz hücre gövdeleri ve oldukça modal süreçler sergiledi. CA1'in tamamında yüksek çözünürlüklü görüntüler birkaç ay boyunca sağlandı.Floresan mikrogliadan gelen sinyaller hipokampal tabakaların tanımlanmasına yardımcı olur. Alveustaki mikroglia, aksonal yollar boyunca uzanan uzatılmış hücre gövdelerine ve süreçlerine sahipti. Stratum piramidaldeki mikroglia, işlemlerinin daha düşük yoğunluğu ile ayırt edilebilir.CA1 ve DG arasındaki sınır, sınır boyunca uzanan kalın kan damarları tarafından tanınabilir ve bu da damarların sülforhodamin 101 ile etiketlenmesiyle daha iyi tanınmıştır. Bir uygulama örneği olarak, GFP pozitif mikroglia ve tdDomates etiketli piramidal nöronlar aynı anda görüntülendi. Nöronal etiketleme, CA1'in tam katman yapılarını anlamaya yardımcı oldu.En önemli nokta ameliyat hasarını azaltmaktır. Aspirasyonla doku hasarından kaçının. Cam tabanını yerleştirirken hafif basınç uygulayın ve diş çimentosunun beyin yüzeyine temas etmesini önleyin.Bu yaklaşım, mikroglia'nın hipokampustaki rolünü tanımlamaya yardımcı olacaktır. Örneğin, mikroglia'nın nöronlarla nasıl etkileşime girdiği, öğrenmeye nasıl dahil oldukları ve beyin hastalıklarını nasıl kontrol ettikleri.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...